专利名称：一种用于获得免疫耐受禽类的方法
技术领域：
本发明属于免疫生物学领域，具体地，涉及一种用于获得免疫耐 受禽类的胚胎血管微注射方法。
背景技术：
免疫耐受可以被定义为免疫系统不与机体固有成分或被引入的 抗原发生破坏性免疫反应的一种生理状态，这种状态可以通过将抗原 引入发育中的免疫系统而人为诱导。但是对于大多数转基因动物，特 别是作为生物反应器的转基因动物，外源基因通常在免疫系统已发育 完全的成年动物中表达，对于这些转基因动物而言，异源基因表达形 成的蛋白产物对机体自身而言属于"非己"物质，因而很有可能会引 发特异性的免疫应答。这种免疫应答造成的结果可能有二 一是免疫系统发挥功能，排 除在体内出现的异源物质；二是由于这些异源物质的刺激导致机体发 生炎症反应，造成机体损伤。在转基因研究中存在的免疫应答问题， 其原因归根结底还是由于基因传递系统中存在太多被机体认为是"非 己"成分的异源物质而导致的，因此如果使这些物质能够被机体识别 为"自身"成分，消除它们的刺激性，就有可能解决免疫应答造成的 负面影响。免疫耐受似乎就成为解决这一问题的理论基础。因此需要 建立一种通过向发育早期的胚胎中引入外源蛋白抗原诱导免疫耐受 的方法。如何解决转基因动物存在的对转基因产物的免疫应答问题，成为 转基因动物成功应用的关键因素之一。与哺乳动物不同的是，禽类的 胚胎发育在离开母体的密闭蛋壳内独立完成，这为胚胎期接种抗原提 供了更为方便的条件。现有的在禽类中获得免疫耐受鸡的技术主要有两种， 一种是在种 蛋未入孵之前通过往种蛋卵黄中注射大剂量的特异外源蛋白抗原，通 过鸡胚发育过程中对卵黄营养物质的吸收过程而进入胚胎血液系统 中诱导免疫系统对外源蛋白抗原的免疫耐受，虽然此种方法也可奏 效，成功的获得免疫耐受的雏鸡，但是此方法有2项缺点一是诱导产生的免疫耐受鸡在实验群体中比例不高，而且维持免 疫耐受的时间较短，因为外源蛋白抗原是注射在卵黄中，不直接和免 疫系统接触，或者说它们的接触需要借助卵黄营养物质的吸收过程， 这样就降低了获得免疫耐受雏鸡的概率。二是实验的成本太高，因为 是往卵黄中注射外源蛋白抗原，所以经过卵黄的稀释，就需要很高的 剂量才能诱导鸡免疫耐受的产生，而商品化的纯化蛋白价格昂贵，需 要花费大量的经费购买。并且此方法由于获得免疫免疫耐受雏鸡的概 率较小，所以需要大量的样本(种蛋数)来维持研究和生产应用的需 要，而种蛋的购买，孵化费用也不容忽视，这样就大大增加了实验的 成本。还有一种获得免疫耐受鸡的方法是对刚出壳的雏鸡进行外源蛋 白抗原的免疫接种注射，但是此时雏鸡的免疫系统已经发育完全，所 以获得免疫耐受鸡的概率更加小， 一般不被釆用。发明内容本发明的目的是提供一种用于获得免疫耐受禽类的方法。 其根据免疫耐受原理，在禽类胚胎发育早期，将很少剂量的外源 蛋白通过微注射的方法注入胚胎静脉血管中，在胚胎的胸腺组织中与 早期发育的免疫细胞接触作用，诱导禽类免疫系统对注入的外源蛋白 发生免疫宽容，进而获得对注射的外源蛋白抗原免疫耐受的雏鸡。并 在孵化后对其按常规方法进行二次免疫后收集血清进行外源蛋白抗 体水平的检测，验证禽类对通过本发明方法诱导的免疫耐受的效果和 维持时间。为了实现本发明的目的，本发明的一种用于获得免疫耐受禽类的 方法，主要是在禽类胚胎发育早期，引入较少剂量的外源抗原，诱导 禽类免疫系统产生对外源蛋白的免疫宽容，最终获得免疫耐受的个 体。本发明提供一种用于获得免疫耐受禽类的方法，其包括如下步(1) 取孵化时间为65 70h之间的种蛋，确定胚胎所处位置，并 在蛋壳上做标记；(2) 使胚胎脱离内层壳膜后，在步骤(l)作的标记处，于蛋壳上打孔；(3) 将外源抗原缓慢注射到禽类胚胎静脉血管中；(4) 注射完成后封闭蛋壳上的孔，将种蛋入孵直至出雏。 所述的步骤(1)做标记的位置在胚胎血管较密集处的蛋壳上。 所述的步骤(2)中打孔的方法为将种蛋钝端朝上倾斜， 一般倾斜30度为宜，静置3 5min,使标记下方的血管网脱离内层壳膜， 在标记附近打一个直径为4 5mm的孔，并保证内层蛋壳膜的完整。 其中，使标记下方的血管网脱离内层壳膜，便于下一步的打孔和揭去 内层壳膜时不会累及血管网的完整，可使打孔时对血管网的影响最 小，打孔可以使用医用牙钻。打孔后，将种蛋钝端朝上，静置3min 以上，使游离的血管网复位。所述的步骤(3)中注射仪器用玻璃针，优选的为内径20 3(Him、 外径30 40^im的微玻璃针。所述的步骤(3)注射的方法为揭去内层蛋壳膜，将0.5 2)il的抗原缓慢注射到禽类胚胎静脉血管中。所述的静脉血管的注射位置 为静脉血管的二或三级血管分支处。可用玻璃针从分叉处底部上挑刺 入血管，这种方法比单一的背主静脉便于注射，并且出血较少。可以在体式显微镜下通过观察红细胞的流向来判断静脉血管和动脉血管，其中血细胞流向胚胎的为静脉血管。所述的步骤(3)中的外源抗原为天然蛋白或人工合成蛋白，其 中天然蛋白可以是牛乳酪蛋白、痩素蛋白，人工合成蛋白可以是胰岛 素。所述的步骤(4)中优选的用parafilm封口膜封闭蛋壳上的孔。 所述的步骤(4)中入孵方法为将种蛋钝端朝上倾斜，以15度 为宜，使血管网离开孔的位置，可以较好的避免感染，提高孵化率。 种蛋放回孵化器继续孵化，调节好相对湿度和温度，直至出雏。本发明 一种用于获得免疫耐受禽类的方法可以用于获得免疫耐 受鸡。在对鸡胚胎血管进行注射时，要尽量缩短时间，在技术熟练的情 况下，平均每只鸡胚的注射时间可缩短至2 3min，整个过程需在超 净工作台中进行，封蛋时要保证不出现滲漏的情况。整个操作过程可以在室温条件下完成，但是最好合理搭配人工， 一人钻孔， 一人注射， 一人封蛋，可以使每只蛋在孵化器外的时间缩 短至7 10min,尽可能的减少环境变化对鸡胚孵化的影响，可以大大 的提高其孵化率，进而提高免疫耐受率，并且本实验对免疫耐受的鸡 个体跟踪检测了长达2个月，其始终保持了对特定外源蛋白抗原的免 疫耐受，得到了目前为止在相关研究中免疫耐受可以维持的最长时 间。本发明的获得免疫耐受禽类的方法具有如下优点(1) 操作条件简单易得，成本低廉；(2) 可操作性强，每枚种蛋的注射时间仅需2 3min;(3 )简洁高效，只需极少的抗原剂量就可引起禽类的免疫耐受, 耐受率53.8%;(4)可重复性好，耐受成功率高，并且维持耐受的时间久，在 雏鸡60日龄后仍然存在对特定抗原的免疫耐受，这为在转基因动物研究中高效获得外源基因产物、建立对转基因产物免疫耐受的禽类模 型、提高鸡输卵管生物反应器的利用价值提供了科学依据和有效的方 法；(5) 对鸡胚胎的孵化影响小，孵化率可达65%;(6) 可以解决禽类对转基因产物的免疫应答问题。 本发明建立的获得免疫耐受禽类的方法，主要是在禽类胚胎期注射外源蛋白抗原获得免疫耐受禽类，该方法提出了合适的注射时间和 注射剂量以及切实可行的技术规范，使外源抗原注射到鸡胚胎血液循 环系统中，在鸡胚胎的发育过程中直接和免疫系统相接触，成功地在 胚胎期诱导了鸡对外源抗原的免疫宽容，获得了免疫耐受雏鸡。通过本发明的方法建立的诱导鸡免疫耐受的模型，成功的通过人 为诱导免疫耐受的发生，使外源基因产物不再是一种外来物质，具体 来说使转基因鸡避免出现对特定外源蛋白产物的免疫应答的问题，使 得鸡输卵管生物反应器可以产生更高的经济效益，在生物制药等领域 拥有更广阔的应用前景。
图l是65 70h胚龄接种抗原诱导获得免疫耐受鸡的结果。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 实施例l本实施例是获得免疫耐受鸡。对孵化65~70h的种蛋进行血管微注射外源抗原牛乳酪蛋白 (casein )。整个操作过程在室温条件下完成， 一人钻孔， 一人注射， 一人封 蛋，可以使每只蛋在孵化器外的时间缩短至7 10min。取71枚在孵化器孵化时间为65~70h的种蛋，用酒精棉擦拭其表 面消毒后，通过纤维光源照蛋确定胚胎所处位置，在胚胎血管较密集的地方用铅笔在蛋壳上打上标记。然后上下轻轻晃动使胚胎脱离内层壳膜，将鸡蛋钝端朝上倾斜30度静置3min,使标记下方的血管网脱离内层壳膜，以便打孔时对 血管网的影响较小，选用医用牙钻在标记附近打磨出一个直径在 4~5mm的小孔并保证内层蛋壳膜的完整。打孔后将种蛋钝端朝上， 静置3min以上，使游离的血管网复位，即重新回到打孔标记的下方。 用无菌的眼科用镊子揭去内层壳膜，在实体显微镜下通过观察红 细胞的流向来判断静脉血管和动脉血管，所要注射的血管位置为静脉 血管的二或三级血管分支处，用内径20nm、外径3(Him微玻璃针从 分支处底部上挑刺入血管，将0.5^1的浓度为10pg小l牛乳酪蛋白溶 液缓慢注射到鸡胚胎静脉血管中，稳健快速的抽出微玻璃针。注射完 成后用parafilm封口膜封闭蛋壳上的孔，将种蛋钝端朝上倾斜15度， 使血管网离开孔的位置，然后放回孵化器继续孵化，调节相对湿度 70。/。和温度38.5t:，直至出雏。孵化率为65%。 实施例2将痩素蛋白或胰岛素，通过同实施例1的方法注射到鸡胚胎，获 得雏鸡的孵化率为63%。 实验例l利用酶联免疫(ELISA)检测65 70h胚龄接种抗原诱导免疫耐 受的结果。共选71枚孵化到65 70h种蛋，除了注射仪器选用内径30pm、 外径40)nm的微玻璃针外，其余同实施例l的方法，分别接种了浓度 为10pg4il的牛乳酪蛋白溶液2^1，接种剂量为20pg/枚。在孵出的 34只小鸡中，有8只在出生后不久死亡，经四次常规免疫后收集剩 余26只小鸡的血清样本用于ELISA检测。在本实验例中的四次免疫指的是所有孵化的小鸡在20日龄后用 胚胎期接种的抗原进行二次免疫(相对于胚胎期注射血管抗原为一次免疫)，检查是否会产生相应的抗体。这种二次免疫检测是否会产生 抗体的实验在雏鸡的不同日龄分别进行了四次，即检测试验组小鸡是 否产生的相应的抗体，图1显示的是第四次检测(雏鸡60日龄)的 结果。检测各试验组小鸡的血清样本前，需要先通过按照系列倍比(抗原浓度分别为20赫1、 15一1、 IO一I、 5ng/nl，对应血清稀释倍 数为128000、 64000、 32000、 16000)分别稀释抗原、阳性对照和阴 性对照，以确定抗原、抗体的最佳反应浓度。阳性对照是同批孵化的 胚胎期未经抗原处理的小鸡，出生后和试验组小鸡同样经历了四次常 规免疫；阴性对照有两种， 一种是既没有经过胚胎期的接种处理，出 生后也没接受常规免疫的普通鸡； 一种是用无特定病原菌(SPF)鸡。用酶联仪在492nm波长检测系列配比的阳性血清、普通阴性血 清和SPF血清的OD值，找到了建立ELISA检测的最灵敏区段，此 时多数阳性对照OD值在0.96±0.06且与相应的同样稀释度下的阴性 对照数值差异最大，选取此时所对应的牛乳酪蛋白抗原包被浓度 10ng/pl以及血清稀释倍数32000作为后续的检测试验组小鸡血清样 本时使用的抗原浓度和稀释倍数。由于普通阴性对照血清的检测结果 0.08±0.007与SPF血清检测结果0.08±0.004无显著性差异(p>0.05 )， 因此在结果所示图1中只显示了 SPF血清的检测结果。当检测试验 组样本OD值大于SPF阴性对照OD值的2.1倍时，判定该试验组样 本为阳性，反之则为阴性。酶联仪检测得到的阳性对照的平均OD值为0.96±0.06，阴性对 照的平均OD值为0.08±0.004。釆用酶联仪检测试验组小鸡血清样本的OD值，来评价试验小鸡 对casein的耐受性，检测结果见图1。试验小鸡血液样本OD值检测时，血液样本经离心后，取血清， 将血清按上述稀释度稀释后用于ELISA实验。12个试验小鸡血液样本中检测到较强的抗体应答，平均OD值为1.09 ±0.15，与阳性对照相比没有显著差异(p=0.598)。因此认为 这些小鸡对casein不耐受；有8个试验小鸡血液样本虽然OD值仍高于阴性对照的2.1倍， 但只有较弱的抗体应答，其平均OD值为0.33 ±0.04，与阳性对照相 比差异显著(p=0.001),这些小鸡被认为对casein是部分耐受的；有6个试验小鸡血液样本的OD值为0.12 ±0.02，小于阴性对照 的2.1倍，因此判定为阴性，即这些小鸡没有产生可检测到的抗牛乳 酪蛋白抗体，对casein是完全耐受的(completely tolerant),耐受率 为53.8% (14/26，包括部分耐受和完全耐受的小鸡)。从上述结果可以推论出，为了获得对casein的免疫耐受的鸡，可 以在鸡胚胎发育到65~70h通过胚胎血管微注射预先接种抗原的方法 诱导产生。
权利要求
1、一种用于获得免疫耐受禽类的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤(1)取孵化时间为65～70h之间的种蛋，确定胚胎所处位置，并在蛋壳上做标记；(2)使胚胎脱离内层壳膜后，在步骤(1)的标记处，在蛋壳上打孔；(3)将外源抗原缓慢注射到禽类胚胎静脉血管中；(4)注射完成后封闭蛋壳上的孔，将种蛋入孵直至出雏。
2、 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的步骤(l)做 标记的位置在胚胎血管较密集处的蛋壳上。
3、 如权利要求l或2所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2) 中打孔的方法为将种蛋钝端朝上倾斜静置3 5min，待标记下方的 血管网脱离内层壳膜，在标记处打一个直径为4~5mm的孔，并保证 内层蛋壳膜的完整。
4、 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的步骤(2)中 打孔后，将种蛋钝端朝上，静置3min以上，使游离的血管网复位。
5、 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)注 射的方法为揭去内层蛋壳膜，将0.5 2)iil的外源抗原缓慢注射到禽 类胚胎静脉血管中。
6、 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中 静脉血管的位置在静脉血管的二或三级血管分支处。
7、 如权利要求l-6任一所述的方法，其特征在于，所述的步骤 (3)中外源抗原为天然蛋白或人工合成蛋白。
8、 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的步骤(4)中 入孵方法为将种蛋钝端朝上倾斜，使胚胎血管网离开孔的位置。
9、 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的步骤(3)中注射仪器用玻璃针。
10、权利要求l-9任一所述的方法在获得免疫耐受鸡中的应用。
全文摘要
本发明提供了一种用于获得免疫耐受禽类的方法，其是在禽类胚胎发育早期，将外源抗原引入到禽类胚胎中，诱导禽类免疫系统对注入的外源蛋白发生免疫宽容。采用本发明的方法，将外源抗原注射到鸡的胚胎中，可以在胚胎期成功诱导鸡免疫系统对注入的外源蛋白发生免疫宽容，进而获得了免疫耐受的雏鸡个体，其耐受率高达53.8％，免疫耐受的效果可以维持2个月以上，孵化率可达65％。
文档编号A01K67/00GK101213954SQ20081005648
公开日2008年7月9日 申请日期2008年1月18日 优先权日2008年1月18日
发明者鹏 孙, 迟 宋, 李赞东, 王晓萍, 斌 蒋, 晨 赵, 金秀梅, 靳文静, 韩海棠 申请人:中国农业大学