专利名称：：多功能菌株及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物制剂领域，具体地涉及一株多功能土壤芽孢杆菌及其应用。
背景技术：
：在我国，长期过量施用化肥导致了土壤板结、肥力退化等一系列问题。同时，人们对农产品的农药、化肥残留问题日益关注，绿色食品、有机食品受到巿场的热捧。在这种大环境下，我国生物肥料产业得以迅速发展，生物肥料的年产量达到400万口屯，在农业部登记的产品种类多达12个，包括根瘤菌肥料、固氮菌肥料、解磷菌类肥料、解钾菌类肥料等。但是，目前巿场上销售的生物肥料普遍存在着功能单一、质量不稳定、土壤适应性差等问题，从而限制了其规模化推广。克服上述问题的关键在于筛选出抗逆性强的多功能菌株。本发明正是基于此思路，经多年实验筛选出具备多种功能的土壤芽孢杆菌，并改进了现有的孢子粉生产工艺，实现了生物菌肥生产的突破。
发明内容(一)要解决的技术问题本发明的目的是提供一株多功能土壤芽孢杆菌，本发明的另一目的是提供利用该菌株生产孢子粉的方法。(二)技术方案本发明所述的土壤芽孢杆菌(^^7/船eJ"//n'c船)YZH-002，该菌株已于2008年2月25曰被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.2315。本发明所述的土壤芽孢杆菌(B""7/we^p/w'cw)CGMCCNo.2315,具备改善土质、分泌植物生长激素、防治病虫害等多种功能。本发明提供了一种生产前述土壤芽孢杆菌孢子粉的方法，包括如下步骤:(1)种子活化挑取冷冻保藏的菌液，在固体培养基平板上划线，于30。C培养14-16h;然后挑取单菌落接种于液体培养基中，于30°C、250rpm振荡培养至OD600nm-l-1.5;(2)芽孢生成取步骤(1)所得菌液0.2mL，接种于装有固体培养基的克氏瓶中，涂匀，于3(TC培养3-4天，直至培养基表面形成明显的菌苔，得到芽孢种子；(3)接种种子罐用无菌水冲洗菌苔，接种于灭过菌的种子罐，接种温度70-80°C,发酵参数设置为温度30-35°C，罐压0.03-0.05MPa,通气量l:0.2-0.3(m3/t/h)，pH6.8-7.2，搅拌转数200-400rpm,培养时间20-24h;(4)发酵培养将步骤(3)得到的种子液输入发酵罐，发酵参数的设置同步骤(3)，培养时间28-34h;(5)喷粉将步骤(4)发酵得到的菌液输入贮存罐，按菌液碳酸钙=1:3-4的比例加入碳酸钙，搅拌混匀；然后进入喷雾塔，进口温度为180-220。C，出口温度为50-60°C，得到孢子粉。上述方法中所用到的培养基的组成具体如下(1)活化菌种所用的培养基组成按质量百分比计为(用于种子活化和芽孢生成步骤)蛋白胨5~10%o葡萄糖3~8%o酵母粉0.5~2%。5NaCl3~6%0KC10.5~1.5%oMgS04.7H200.2~0.4%opH7.0;(2)发酵培养基按质量百分比计为(用于接种罐和发酵培养步骤)::玉米浆1~10%豆饼粉0.5~5%淀粉0.5~5%NH2S040.01~0.3%K2HP040.01~0.1%MgS040.1%FeS040.01%pH7.0~7.2。本发明所述的土壤芽孢杆菌可应用于制备生物有机肥、生态配方肥、生物农药以及土壤改良剂等生物制剂。相应地，本发明所述的孢子粉生产方法也可应用于上述制剂的生产。(三)有益效果本发明所述的土壤芽孢杆菌耐盐、耐热、抗逆性强，能够分泌吲哚丙酸、玉米素、赤霉素等多种植物激素，并能防治线虫及多种真菌病害，适用于生产生物有机肥、生态配方肥、生物农药以及土壤改良剂等生物制剂。同时，本发明提供的孢子粉生产方法有效减少了核心菌株的死亡率，使得存活率达93%以上，并将孢子粉的保质期提高到12个月以上。图l、几丁质分解实验结果圈。本发明所述的土壤芽孢杆菌(5a"7/w5e^p/2/cw5)YZH-002,该菌株已于2008年2月25日被保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC,保藏编号为CGMCCNo.2315。具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例l本发明所述的土壤芽孢杆菌的性质及功能实验本发明所述的土壤芽孢杆菌是发明人从水稻根际土壤中分离得到，其性质和功能如下。一、形态及生理生化特性G+、杆状，大小为(0.4-0.6)x(1.5-3)pm;芽孢侧生，多数为椭圆形；VF,培养液pH7.07.2;pH5.5-9.8下生长+。在厌氧培养基上不生长，在7.5%以上的NaCl中不生长；淀粉水解—，明胶液化+，分解酪素+，接触酶+，氧化酶-，柠檬酸盐利用—，葡萄糖产气—，葡萄糖产酸+,L-阿拉伯糖产酸-，木糖产酸-，甘露醇产酸+，硝酸盐还原+，甲基红试验+。以上所用到的检测方法均为微生物实验教科书中的经典方法，+表示实验结果阳性，-表示实验结果阴性。二、功能实验1.植物生长激素的分泌表1激素种类分泌量7所用的测定方法为经典的液相色谱法。2、几丁质分解在活化培养基(见本申请技术方案的记载)中添加浓度为2%的几丁质,平板培养所述的土壤芽孢杆菌。36h后，观察到菌落周围出现透明圈，如附图l所示，表明该菌具备很强的分解几丁质能力。几丁质是线虫卵外壁和致病真菌细胞壁的主要成分，这说明该菌具备防治线虫和真菌病害的功能，田间实验也证明其效果显著。3.抗逆性实验3.1耐盐性取35。/n的(NH4)2S04溶液10mL，加入土壤芽孢杆菌菌液1亳升(发酵菌液，菌体数量40-50亿个/mL)，浸泡土壤芽孢杆菌0~15天。用10mL蒸馏水代替35。/。的(NH4)2S04浸泡做对照。然后，将浸泡液加入装有90mL无菌水的三角瓶(内有无菌坡璃珠)中，50100rpm振荡培养30min。取1mL稀释液加入装有9mL无菌水的试管中，摇匀，重复上述操作，直至稀释至104倍。取1(T6、10—7、10—s倍的稀释液各0.1mL置于平板中，涂匀，3(TC培养12天，计数。存活率结果如表2所示，从表2可看出该菌株有较强的耐盐性。表2耐盐性实验<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>3.2耐热性:以8(TC和9(TC为温度处理，以1、3小时为时间处理，以自然保存温度为对照，对所述土壤芽孢杆菌进行耐热处理。然后取1亳升菌液(发酵菌液，菌体数量40-50亿个/mL)加入装有99ml无菌水的三角瓶(内有无菌玻璃珠)中，50~100rpm振荡培养30min。取1mL稀释液加入装有9mL无菌水的试管中，摇匀，重复上述操作，直至稀释至10—8倍。取10"6、10—7、10—8倍的稀释液各O.lmL置于平板中，涂匀，3(TC培养12天，计数，结果如表3所示。根据表3的数据，我们可以看出8(TC处理3小时的菌剂中芽孢存活率为93.25%,表现出很高的耐热性。表3耐热性实验<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>实施例2孢子粉的制备(1)种子活化挑取冷冻保藏的菌液，在固体培养基平板上划线，于3(TC培养14h;然后挑取单菌落接种于液体培养基中，于3(TC、250rpm振荡培养至OD6()()ran=1.5;(2)芽孢生成取步骤(1)所得菌液0.2mL，接种于装有固体培养基的克氏瓶中，涂匀，于3(TC培养3天，直至培养基表面形成明显的菌苔，得到芽孢种子；(3)接种种子罐用无菌水冲洗菌苔，接种于灭过菌的种子罐，接种温度70。C，发酵参数设置为温度35"C，罐压0.03MPa，通气量1:0.2(m3/t/h)，pH6.8，搅拌转数250rpm，培养时间20h;(4)发酵培养将步骤(3)得到的种子液输入发酵罐，发酵参数的设置同步骤(3)，培养时间34h;(5)喷粉将步骤(4)发酵得到的菌液输入贮存罐，按菌液碳酸钙=1:3的比例加入碳酸钙，搅拌混匀；然后进入喷雾塔，进口温度为220°C，出口温度为6(TC，得到孢子粉。以上所用培养基见技术方案。经检测，孢子存活率达95%,孢子粉的保质期18个月。实施例3孢子粉的制备(1)种子活化挑取冷冻保藏的菌液，在固体培养基平板上划线，于30匸培养16h;然后挑取单菌落接种于液体培养基中，于3(TC、250rpm振荡培养至00600鹏=1;(2)芽孢生成取步骤(1)所得菌液0.2mL，接种于装有固体培养基的克氏瓶中，涂匀，于3(TC培养4天，直至培养基表面形成明显的菌苔，得到芽孢种子；(3)接种种子罐用无菌水冲洗菌苔，接种于灭过菌的种子罐，接种温度80。C,发酵参数设置为温度30r,罐压0.05MPa,通气量1:0.3(m3/t/h)，pH7.2，搅拌转数400rpm，培养时间24h;(4)发酵培养将步骤(3)得到的种子液输入发酵罐，发酵参数的设置同步骤(3)，培养时间28h;(5)喷粉将步骤(4)发酵得到的菌液输入贮存罐，按菌液碳酸钙=1:4的比例加入碳酸钙，搅拌混匀；然后进入喷雾塔，进口温度为18(TC，出口温度为5(TC,得到孢子粉。以上所用培养基见技术方案。经检测，孢子存活率达96%，孢子粉的保质期14个月。实施例4在制备生物菌肥中的应用将实施例2所得孢子粉与腐熟好的有机质混合搅拌，经70°C-18(TC高温烘干，制造出含水率不超过8%的有机生物颗粒。冷却至常温，筛分，得到不同大小的粒子，选取符合标准的粒子打包入库，制得生物有机菌肥。实施例5在制备生态配方肥中的应用根据土壤中的N、P、K含量和不同农作物N、P、K需求量，在实施例4制得的生物有机菌肥中加入不同含量的N、P、K无机养分，混合均匀，制成有机质、无机养分和微生物三者有机结合的生态配方肥。实施例6线虫抑制剂的制备取实施例3所得孢子粉，向其中加入5%-20%的淀粉、3%-5%的虾壳粉或蟹壳粉，制得线虫抑制剂。以上比例均为重量百分比。权利要求1、一株土壤芽孢杆菌(Bacillusedaphicus)CGMCCNo.2315，其特征在于该菌株具备改善土质、分泌植物生长激素、防治病虫害等多种功能。2、一种生产如权利要求l所述的土壤芽孢杆菌孢子粉的方法，包括如下(1)种子活化挑取冷冻保藏的菌液，在固体培养基平板上划线，于30'C培养14-16h;然后挑取单菌落接种于液体培养基中，于30'C、250rpm振荡培养至OD600nm-l-1.5;(2)芽孢生成取步骤(1)所得菌液0.2mL，接种于装有固体培养基的克氏瓶中，涂匀，于3'C培养3-4天，直至培养基表面形成明显的菌苔，得到芽孢种子；(3)接种种子罐用无菌水冲洗菌苔，接种于灭过菌的种子罐，接种温度70-80°C,发酵参数设置为温度30-35°C，罐压0.03-0.05MPa,通气量1:0.2-0.3，pH6.8-7.2，搅拌转数200-400rpm，培养时间20-24h;(4)发酵培养将步骤(3)得到的种子液输入发酵罐，发酵参数的设置同步骤(3),培养时间28-34h;(5)喷粉将步骤(4)发酵得到的菌液输入贮存罐，按菌液碳酸钙=1:3-4的比例加入碳酸钙，搅拌混匀；然后进入喷雾塔，进口温度为180-220°C，出口温度为50-6。C，得到孢子粉。3、根据权利要求2所述的方法，其中所用到的培养基组成是(1)活化菌种所用的培养基组成蛋白胨5~10%o葡萄糖3~8%o酵母粉0.5~2%oNaCl3~6%oKC10.5-'1.5%oMgS04.7H200.2~0.4%0pH7.0;(2)发酵培养基玉米浆1~10%豆饼粉0.5~5%淀粉0.5~5%NH2S040.01~0.3%K2HP040.01~0.1%MgS040.1%FeS040.01%pH7.0—7.2。4、根据权利要求l所述的菌种在制备生物有机肥、生态配方肥、生物农药以及土壤改良剂等生物制剂中的应用。5、根据权利要求2所述的方法在制备生物有机肥、生态配方肥、生物农药以及土壤改良剂等生物制剂中的应用。全文摘要本发明提供了一株土壤芽孢杆菌(Bacillusedaphicus)CGMCCNo.2315，该菌株耐盐、耐热、抗逆性强，能够分泌吲哚丙酸、玉米素、赤霉素等多种植物激素，并能防治线虫及多种真菌病害。本发明还提供了生产前述土壤芽孢杆菌孢子粉的方法，该方法有效减少了核心菌株的死亡率，使得存活率达93％以上，并将孢子粉的保质期提高到12个月以上。本发明提供的多功能菌株和其孢子粉生产方法适用于生产生物有机肥、生态配方肥、生物农药以及土壤改良剂等生物制剂。文档编号A01P5/00GK101525582SQ20081010149公开日2009年9月9日申请日期2008年3月7日优先权日2008年3月7日发明者刘旭明申请人:北京易众恒科技有限公司