专利名称：：一种杀蚊球形芽孢杆菌漂浮剂及其制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种生物制剂的制备方法，具体地说，涉及一种杀蚊球形芽孢杆菌(Bacz7/w^/^eWcwj，简称Bs)漂浮剂及其制备方法。属于生物农药中微生物杀虫剂的生产工艺和制剂化技术。
背景技术：
：杀蚊球形芽孢杆菌(5ac///^^/zaen'cz^简称Bs)是广泛存在于自然环境中的有益微生物，其菌体代谢产生的一种蛋白质伴孢体，对紋子的幼虫孑孓有非常高的杀灭活性。杀蚊球形芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌以色利亚种(即B.t.i)被世界卫生组织(WHO)确定为对蚊虫进行生物防治的两种有益细菌，国内外有数个B.s菌株被用于工业化生产和蚨虫防治，如世界卫生组织向全世界推荐的Bs2362菌株和C3-41菌株。大量研究结果表明，杀紋球形芽孢杆菌所产生的杀蚊活性物质对热非常敏感，长时间处于45'C以上就会失活，由于其热敏性太强，所以工业化生产杀蚊球形芽孢杆菌的原粉(或母粉)比较困难。有关杀蚊球形芽孢杆菌原粉的生产工艺过程未见国外有公开的报道。国内有关专家为克服这一困难，进行过杀蚊球形芽孢杆菌热保护剂的筛选，但一直未见有公开的文献发表和专利申请。目前国内生产杀蚨球形芽孢杆菌的方法有两种，一种是不生产粉剂，只生产水剂，由此避开热失活问题；另一种是釆取常规的喷雾干燥方法，发酵之后遇过碟片离心机离心，收集菌浆然后用喷雾干燥塔生产出杀蚨球形芽孢杆菌的原粉。生产水剂的方法虽然简单，收率也很高，但是产品效价低，体积大，运输不方便，而且产品易腐败，保质期较短。杀蚊球形芽孢杆菌产品有一定的国际巿场，但以水剂出口显得很不合适。以喷雾干燥法生产原粉的办法对苏云金芽孢杆菌产品的生产是成熟可行的，但对杀紋球形芽孢杆菌却不合适，因为喷雾干燥法无论是进口温度还是出口温度都大大超过本产品的失活温度。所以釆用喷雾干燥法生产杀蛱球形芽孢杆菌不仅能耗大，成本高，而且效价损失也很大，其损失率达到50%以上。为了探索一条生产杀蚊球形芽孢杆菌固体产品(或者说干燥产品)的途径，而且保证生产过程中效价损失率低，能耗小，运输成本低，本发明人对杀蚨球形芽孢杆菌发酵后处理生产工艺进行了反复研究，最终完成了本申请。
发明内容本发明的目的是提供一种杀蚊球形芽孢杆菌(&"7/"s印/iMn'cw)漂浮剂，釆用低温后处理工艺，保持杀蚊球形芽孢杆菌高活性，并达到持久的防治效果。本发明的另一目的是提供一种杀蚊球形芽孢杆菌漂浮剂的制备方法，该方法釆用低温后处理工艺，避免了菌种在高温下失活的缺陷，而且保证生产过程中效价损失率低，能耗小，运输成本低，可工业化生产。为了实现本发明目的，本发明的一种杀紋球形芽孢杆菌(^z"7/m^/^en'c^)漂浮剂，其由如下步骤制备而成先将灭蚊球形芽孢杆菌发酵滤液釆用膜浓缩法进行浓缩，然后用多孔载体物质进行吸附，再与缓释剂混合，并在4050'C干燥成母粒，最后包裹疏水剂。为了将菌体与发酵液中的水分离，本发明釆用微孔滤膜进行过滤去水。本发明所述膜浓缩法中所釆用的滤膜为醋酸纤维素酯膜(CA)、无机陶瓷膜或聚偏二氟乙烯膜(PVDF),经比较确认无机陶瓷膜最好，根据杀蚊球形芽孢杆菌的活性蛋白的分子量大小，确定膜的孔径为50~謂nm。为实现低温干燥，本发明不按照先生产原粉，后生产制剂的工艺路线，而是直接生产漂浮剂母粒，通过漂浮剂的多孔载体吸收水份，吸附菌体和杀紋活性物质，并以此增加物料的通透性，扩大有利于水份蒸发的孔隙度和蒸发面积。所述的多孔载体物质为珍珠岩、玉米芯颗粒、膨化的白炭黑，最优选为玉米芯颗粒。玉米芯颗粒材料具有漂浮性好，吸附量大，材料环保无污染，价格便宜等优点。试验了不同粒径大小的玉米芯颗粒的效果，优选结果表明l2mm粒径的玉米芯颗粒为最好。对l2mm玉米芯颗粒的用量进行试验，当菌浆含固量达到20~25%时，玉米芯用量(W/W)4.550。/。可以达到低温干燥的目的，最优为7.5~8.5%。本发明选择母粒的干燥温度，从40~50°C，每差1°C设置一个处理，反复比较结果表明42。C至46。C均为可行的选择，但以45'C为最优。湿母粒的干燥机械以沸腾床最好，鼓风式的控温干燥箱也可选用。为了保证漂浮剂的漂浮时间和缓释性能，本发明人对漂浮母粒包裹上缓释剂。所述缓释剂选用香豆胶、阿拉伯树胶、P-环状糊精等，优选为香豆胶。本发明试验了不同的香豆胶含量，优选结果香豆胶与菌浆质量比为0.0050.009:1，最优为0.007:1。香豆胶以40g香豆胶/lL水的比例溶成香豆胶水溶液后进行涂布成母粒。玉米芯颗粒吸附菌体和杀蚊活性物质之后，在水中漂浮时间会大大缩短，吸附的活性物质会很快释放出来，持效时间仅仅几天，达不到通常对灭紋漂浮剂的要求。为此，本发明用多种疏水剂对漂浮剂母粒进行包裹。这些疏水剂包括棕榈油，石蜡，紫胶等，同时还试验了单层包裹和多层包裹。经比较最后选定双层包裹方案最好，材料为一层石蜡，一层紫胶，先包裹石蜡层，再包裹紫胶层和先包裹紫胶层再包裹石蜡层两种包裹顺序都可行。紫胶包裹时应先将紫胶用乙醇溶解，紫胶与溶剂的比例为50ml乙醇/g紫胶。石蜡的包裹条件为5(TC的温度下加入丙酮，丙酮的用量为3ml丙酮/g石蜡。为了实现本发明的另一目的，本发明的一种杀蚊球形芽孢杆菌(万ad〃ww;^am'cws)漂浮剂的制备方法，其包括如下步骤先将灭蚊球形芽孢杆菌发酵滤液采用膜浓缩法进行浓縮，然后用多孔载体物质进行吸附，再与缓释剂混合，并在405(TC干燥成母粒，最后包裹疏水剂而成。其中，所述膜浓缩法中所采用的滤膜为醋酸纤维素酯膜(CA)、无机陶瓷膜和聚偏二氟乙烯膜(PVDF)，优选为无机陶瓷膜，膜的孔径为50~画nm。所述的多孔载体物质为珍珠岩、玉米芯颗粒、膨化的白炭黑，最优选为玉米芯颗粒，粒径为l2mm。当菌浆含固量达到2025%时，玉米芯用量(W/W)4.550。/。可以达到低温干燥的目的，最优为7.5~8.5%。本发明干燥温度优选为45°C。湿母粒的干燥机械以沸腾床最好，鼓风式的控温干燥箱也可选用。所述缓释剂选用香豆胶、阿拉伯树胶、P-环状糊精等，优选为香豆胶。本发明试验了不同的香豆胶含量，优选结果香豆胶与菌浆质量比为0.0050.009:1,最优为0.007:1。香豆胶以40g香豆胶/lL水的比例溶成香豆胶水溶液后进行涂布成母粒。所述疏水剂包括棕榈油，石蜡，紫胶等，可采用单层包裹和多层包裹。经比较最后选定双层包裹方案最好，材料为一层石蜡，一层紫胶，先包裹石蜡层，再包裹紫胶层和先包裹紫胶层再包裹石蜡层两种包裹顺序都可行。紫胶包裹时应先将紫胶用乙醇溶解，紫胶与溶剂的比例为50ml乙醇/g紫胶。石蜡的包裹条件为5(TC的温度下加入丙酮，丙酮的用量为3ml丙酮/g石蜡。本发明所述杀紋球形芽孢杆菌母粒低温生产工艺可生产杀蚊球形芽孢杆菌漂浮剂，活性成份的损失率(即效价损失率)仅10%左右，固形物回收率达到95%左右。而且该工艺保证生产过程中效价损失率低，能耗小，运输成本低。经测定，本发明漂浮剂一次投药4mg/L在水中持续杀灭致乏库蚊(0//"/加'^"力效果可长达28天以上(室内测定)。图l为本发明所述杀蚊球形芽孢杆菌母粒低温生产工艺及漂浮剂生产工艺路线示意图。具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1灭蚊球形芽孢杆菌发酵成功之后加盐酸调pH5.0，经过三足式离心机去渣(筛网网眼为60目，离心机转速为1000rpm)。取75kg发酵滤液，在功率为45w，膜面积为0.3m2，膜孔径为100nm的无机陶瓷膜组件中浓缩，运行温度35'C,运行时间6小时25分钟，经浓缩排出清液66.3kg，放出菌浆，并用少许清水冲洗存留在膜及管道内中的菌浆，收集菌浆8.6kg，同时用稀盐酸调PH值4.8。将此菌浆按重量比7.8%加入粒径为1-2111111的干燥玉米芯颗粒0.67kg,在槽式混合机中将二者充分混匀，再将60.2g香豆胶溶于1.4L清水成香豆胶水溶液，将香豆胶水溶液倒入槽式混合机中，与附着菌浆的载体充分混匀，物料呈豆渣状。置于45'C鼓风干燥箱内干燥，经12小时得到干透的母粒2.71kg。对所得干母粒进行检测，其含水量3.16%，效价4582ITU/mg，活性成分收率(效价回收率)为91.02%，固形物回收率96.07。/。。实施例2灭蚨球形芽孢杆菌发酵成功之后加盐酸调pH5.0,经过三足式离心机去渣(筛网网眼为40目，离心机转速为1000rpm)。取75kg发酵滤再将68.8g香豆胶溶于1.4L清水成香豆胶水溶液，将香豆胶水溶液倒入槽式混合机中，与附着菌浆的载体充分混匀，物料呈豆渣状。置于45。C鼓风干燥箱内干燥，经13.5小时得到干透的母粒3.846kg。对所得干母粒进行检测，其含水量3.23%,效价3760ITU/mg，活性成分收率(效价回收率)为89.86%,固形物回收率96.39%。实施例3灭蚊球形芽孢杆菌发酵成功之后加盐酸调pH5.0，经过三足式离心机去渣(筛网网眼为60目，离心机转速为1000rpm)。取75kg发酵滤液，在功率为45w,膜面积为0.3m2,膜孔径为100nm的无机陶瓷膜组件中浓缩，运行温度37'C,运行时间6小时18分钟，经浓缩排出清夜66.5kg，放出菌浆，并用少许清水冲洗存留在膜及管道内中的菌浆，收集菌浆8.6kg，同时用稀盐酸调PH值4.8。将此菌浆按重量比9.0%加入粒径为l-2mm的干燥玉米芯颗粒0.7432kg,在槽式混合机中将二者充分混匀，再将68.8g香豆胶溶于1.4L清水成香豆胶水溶液，将香豆胶水溶液倒入槽式混合机中，与附着菌浆的载体充分混匀，物料呈豆渣状。置于45'C鼓风干燥箱内干燥，经12小时得到干透的母粒2.83kg。对所得干母粒进行检测，其含水量3.07%,效价4496ITU/mg,活性成分收率(效价回收率)为90.86%，固形物回收率95.98%。实施例4按照本工艺路线，釆用双疏水层结构。干母粒紫胶石蜡=3.5:0.02:0.2(质量比)。一取实施例l的干母粒350g倒入槽式混合机中。二将2g紫胶先溶于100ml乙醇溶液，再将紫胶的乙醇溶液倒入槽式混合机中充分混匀成a。三在50。C下，将20g石蜡中加入60ml丙酮，倒入槽式混合机中与a充分混句成b。四将b移至控温鼓风干燥箱内在45°C条件下干燥0.5小时成漂浮剂产品c。对所得c进行性能检测，其含水量3.65%。效价4286ITU/mg。实施例5按照本工艺路线，釆用双疏水层结构。干母粒石蜡紫胶=3.5:0.2:0.02(质量比)。一取实施例l的干母粒350g倒入槽式混合机中。二在50。C下，将20g石蜡中加入60ml丙酮，倒入槽式混合机充分混匀成al。三将2g紫胶先溶于100ml乙醇溶液，再将紫胶的乙醇溶液倒入槽式混合机中，与al充分混匀成bl，四将bl移至控温鼓风干燥箱内在45'C条件下干燥0.5小时成漂浮剂产品c1。对所得cl进行性能检测，其含水量3.61%。效价4259ITU/mg。实验例l按照实施例4的工艺，将配比换成干母粒石蜡紫胶=3.5:0丄0.01(质量比)制备成漂浮剂C2;干母粒石蜡=3,5:0.3(质量比)制备漂浮剂C3。将C，C2，C3进行杀蚊活性测定，并选用效价为200ITU/mg的水悬剂为对照l，效价为700ITU/mg的粉剂为对照2，清水为对照3。以4L塑料桶为容器，每桶装入3L过夜自来水。漂浮时间为漂浮率为50%以上的天数，防效为加入紋幼虫48小时后的死亡率。结果统计如表l-.表l本发明的BS漂浮剂与BS水悬剂(对照2)持效性比较<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>通过上表可以看出，通过本工艺制备的漂浮剂C在漂浮时间最长，防治效果与其他产品和对照差不多，但持效期明显长于其他产品和对分别取膜工艺，喷粉工艺，絮凝离心工艺所得产品进行效价收率和成本比较。喷粉工艺处理方法将25kg发酵液经过直接喷粉处理，得到0.52kg干粉。膜工艺处理方法将25kg同一批发酵液经过本发明工艺浓缩，干燥。得到0.81kg干的漂浮剂母粉。本实验釆用生物测定的方法来检测结果，考虑膜浓缩干燥工艺的产品为干燥的菌粉附着于载体上，直接测定会由于缓释而干扰测定结果，因此，本试验将膜工艺处理后的产品进行湿磨成粉以后进行测定。湿磨的目的在于避免磨碎的过程中产生热量而引起的活性成分损失。絮凝离心浓缩处理方法将lkg与上述发酵液同一批次的发酵液中加入3%。的絮凝剂氯化铝，以3000r/min处理5分钟。分别收集上清液和沉淀。收集上清液880g，沉淀120g,浓縮倍数8.33倍。对上述三种方法浓缩生产的试验产品分别测定其浓度倍数，总活性收得率，比较结果列于表2中。表2BS发酵液三种浓缩方法优缺点比较浓缩工艺干燥工艺浓缩倍数总活性收率(%)一次性投资成本运行成本污染物直接喷粉12.78高高粉尘和噪音污染絮凝离心鼓风干燥8.3367.3低高有含有部分活性成分的滤液产生，COD值18000mg/L膜浓缩鼓风干燥8.6291.8中低有几乎不含活性成分的滤液产生，COD值2500mg/L通过上表可以看出，本发明工艺在活性收率和运行成本上明显优于传统生产工艺。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。权利要求1.一种杀蚊球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)漂浮剂，其特征在于，其由如下步骤制备而成先将灭蚊球形芽孢杆菌发酵滤液采用膜浓缩法进行浓缩，然后用多孔载体物质进行吸附，再与缓释剂混合，并在40～50℃干燥成母粒，最后包裹疏水剂。2.根据权利要求l所述的杀蚨球形芽孢杆菌漂浮剂，其特征在于，所述膜浓缩法中所釆用的滤膜为醋酸纤维素酯膜、无机陶瓷膜或聚偏二氟乙烯膜。3.根据权利要求1或2所述的杀紋球形芽孢杆菌漂浮剂，其特征在于，所述滤膜为无机陶瓷膜。4.根据权利要求l-3任意一项所述的杀蚨球形芽孢杆菌漂浮剂，其特征在于，所述的多孔载体物质为珍珠岩、玉米芯颗粒、膨化的白炭黑。5.根据权利要求l-4任意一项所述杀蚊球形芽孢杆菌漂浮剂，其特征在于，所述玉米芯颗粒用量(W/W)4.5~50%。6.根据权利要求l-5任意一项所述杀蚊球形芽孢杆菌漂浮剂，其特征在于，所述缓释剂选用香豆胶、阿拉伯树胶或P-环状糊精。7.根据权利要求6所述杀蚨球形芽孢杆菌漂浮剂，其特征在于，所述香豆胶与菌浆质量比为0.0090.005:1。8.根据权利要求l-7任意一项所述杀紋球形芽孢杆菌漂浮剂，其特征在于，所述疏水剂选用棕榈油、石蜡或紫胶中的一种或多种。9.根据权利要求l-8任意一项所述杀蚊球形芽孢杆菌漂浮剂，其特征在于，所述疏水剂包裹时釆用单层包裹或多层包裹。10.制备权利要求l-9任意一项所述的杀紋球形芽孢杆菌漂浮剂的方法，其特征在于，其包括如下步骤先将灭蚊球形芽孢杆菌发酵滤液釆用膜浓缩法进行浓缩，然后用多孔载体物质进行吸附，再与缓释剂混合，并在405(TC干燥成母粒，最后包裹疏水剂而成。全文摘要本发明提供了一种杀蚊球形芽孢杆菌(Bacillussphaericus)漂浮剂，其由如下步骤制备而成先将灭蚊球形芽孢杆菌发酵滤液采用膜浓缩法进行浓缩，然后用多孔载体物质进行吸附，再与缓释剂混合，并在40～50℃干燥成母粒，最后包裹疏水剂。本发明采用低温生产工艺制备杀蚊球形芽孢杆菌漂浮剂，活性成份的损失率(即效价损失率)仅10％左右，固形物回收率达到95％左右。而且该工艺保证生产过程中效价损失率低，能耗小，运输成本低。经测定，本发明漂浮剂一次投药4mg/L在水中持续杀灭致乏库蚊(Culexfatigans)效果可长达28天以上(室内测定)。文档编号A01P7/00GK101554179SQ20081010354公开日2009年10月14日申请日期2008年4月8日优先权日2008年4月8日发明者夏海洋,张用梅,芒李,林开春,肖凤平,陈小龙申请人:武汉天惠生物工程有限公司