专利名称：：小麦hpfw基因、表达产物及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及水稻hpfr基因、表达产物及其用途，属农业生物
技术领域：
，用于防治植物病虫害、促进植物生长和提高作物产量。二
背景技术：
：/w^基因是植物病原细菌中决定在非寄主植物上激发过敏反应(hypersensitiveresponse,HR)和在寄主植物上致病性的基因[LindgrenPB,Theroleof/wpgenesduringplant-bacterialinteraction.AnnuRevPhytopathol,1997，35:129~152]。过敏反应是植物产生的一禾中局部的、快速的细胞编程死亡(programmedcelldeath,PCD)形式。PCD可以引发一种或多种信号传导途径，赋予植物多种抗环境胁迫能力。国内外对植物病原细菌的/wy基因做了较详细的研究。Wei等人首次发现梨火疫病菌5nW"/aawj;/ovora的A/77W基因编码的一种新蛋白质能诱导植物产生过敏反应，并将其命名为Harpin。该蛋白质的特点是富含甘氨酸和缺乏半胱氨酸，热稳定，具有诱导植物产生过敏反应、诱导抗病和促进作物生长等生物活性[WeiZM,LabyRJ，ZumoffCH，etal.Harpin,elicitorofthehypersensitiveresponseproducedbytheplantpathogen￡>nWm'(3謡y/owra.Science,1992.257:85~88]。现已陆续从丁香假单胞菌尸wwctowo"oy5y〃>7gae和黄单胞菌XawAcwo"cwwjzae等多种植物病原细菌中鉴定出具有harpin活性的蛋白质。它们是由相应的植物病原细菌/^基因簇中特定&p基因编码的。闻伟刚等从水稻白叶枯病菌^oo^epv.07zae中克隆了/wp基因，即/2/^化。基因，该基因核苷酸序列大小为420bp,编码产物harpinx。。分子量为15.6kD，该蛋白质具有harpins的功能注射烟草可以诱导植物产生过敏反应；在体外喷雾处理植物可以诱导植物产生抗性和促进作物生长等[闻伟刚，邵敏，陈功友，王金生，水稻白叶枯病蛋白质激发子诱导植物的防卫反应.农业生物技术学报,2003，11(2):192~197]。表达该蛋白质的基因工程菌株已经正在进行产业化研究与开发，相关的研究已经申请国家专利保护[专利号ZJ00135403.5];将//^&。。基因转化水稻，具有提高水稻对稻瘟病、白叶枯病的抗性[邵敏，王金生，转&/^。。基因水稻对白叶枯病的抗性，南京农业大学学报2004，27(4):36-40],相关研究已受国家专利保护[专利号ZL02157213.5.]。因此，植物病原细菌中的基因及其应用研究得较多，但植物中类似于harpin编码基因及其应用研究至今尚未有报道。三、
发明内容技术问题本发明的目的是提供水稻中的/^々基因、表达产物及其用途。来自于水稻的/t//)"基因的表达产物，防治植物病害、促进作物生长。技术方案本发明所提供的基因具有以下特征1.水稻A/^基因来源设计引物5，-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3，和5'-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3',用PCR方法从水稻中扩增出该片段。该基因片段命名为/z;^基因(图l)。以/^々基因为探针，与水稻基因组总DNA杂交，杂交结果显示，在水稻基因组中有杂交阳性信号(图2)。2.水稻基因的核苷酸序列水稻A;^基因的核苷酸序列为SEQIDNO.l(图3):确定该基因大小为405bp,起始密码子处存在EcoRI酶切位点GAATTC，编码区域富含GGT或GGC示编码甘氨酸(glycine,G)的密码子(阴影区)，有4个GGCGGC重复区域(方框区)。ATG示起始密码子，TAA示终止子。3.水稻/z;^基因编码的推导氨基酸序列水稻/^/r基因编码的推导氨基酸序列为SEQIDN0.2(图4)，根据/2/^基因的核苷酸序列推导的氨基酸序列为134个氨基酸。富含甘氨酸(阴影区)，不含半光氨酸。4.水稻/z/7/r基因体外表达将水稻/z/7/a"基因构建于蛋白质体外高效表达载体pET30a(+)形成重组质粒pETR(图5),产生水稻A/^基因的体外表达产物，命名为hpfr蛋白质，其特征类似于harpinx。。的功能能够诱导非寄主植物烟草在24小时内产生过敏反应(图6)、亲水性、对热稳定性、对蛋白酶敏感性，经过SDS-PAGE电泳，确定该蛋白质的分子量约为14.5kD(图7)。5.水稻hpfr蛋白质的理化特性hpfr蛋白质经100'C水浴10min后，仍然能够在24h内激发烟草产生过敏性反应，活性也没有明显的下降；用蛋白酶水解30min后则完全丧失了激发过敏反应的能力，这表明hpfr蛋白质热稳定，但对蛋白酶敏感。6.水稻；p々基因的表达产物的应用水稻/2/^基因的表达产物hpfr蛋白质配制成适当浓度，在作物的不同生长季节用于作物叶面喷施，也可以用于作物移栽时浸根处理，防治植物病害、促进作物生长。7.来源于植物的与上述水稻/z;^基因的同源序列/z/^基因，其特征在于，用水稻&/7/,基因引物5，-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3，和5'-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3',以植物的基因组DNA为模板，用PCR方法扩增出/^A基因，PCR扩增条件94。C/5min的1个循环，941:/45360+60°(:/45360+72°C/45sec的35个循环，72°C/7min的1个循环；/yA基因编码产物具有诱导烟草产生过敏反应反应、激发植物产生抗性和促进植物生长功能。/^々基因所编码的产物为hpfx蛋白质。8.来源于小麦的与水稻/;^基因的同源序列基因，其序列为SEQIDN0.3，其推导的氨基酸序列为SEQIDN0.4，基因编码产物hpfw蛋白质具有诱导烟草产生过敏反应、激发植物产生抗性和促进植物生长功能。有益效果本发明人将/r/Afo。基因转化水稻[邵敏，王金生，转;^/^。。基因水稻对白叶枯病的抗性，南京农业大学学报，2004，27(4):36-40],在转基因水稻分子检测时发现水稻中存在与/""/^。。基因同源序列，并将其克隆和在体外表达，其表达产物具有诱导烟草产生过敏反应、激发植物产生抗性和促进植物生长等功能，在植物中发现类似于harpin编码基因尚属首次。本发明为水稻中与水稻白叶枯病菌(Ipv.w^ae)的/z^p基因同源序列、表达产物及其用途，来源于水稻的A/y基因同源序列表达产物与水稻黄单胞菌基因的编码产物/^戸'"化。有相似的功能，所以将该基因命名为(hrp-likefunctionlociinrice)基因。该基因大小为405bp。本发明研究发现；p々基因在体外的表达产物与水稻黄单胞菌的/^p基因表达产物有相似的功能，即促进植物生长、诱导抗病虫性等，本发明已从水稻中克隆了/^/r基因，并构建至表达载体中，获得表达产物。研究结果表明，hpfr蛋白质处理烟草有明显诱导烟草抗TMV的能力(图8)。将hpfr蛋白质处理的番茄、辣椒长势明显优于未处理(图9)，采摘期提前l周左右hpfr蛋白质处理番茄产量比未处理提高40.3%，辣椒提高31.6%。番茄上病毒病害发生明显减轻(图10)。用hpfW蛋白质喷雾处理番茄，具有促进植物生长功能(图14)'，同时，明显减少番茄早疫病的发生；用该蛋白质喷雾处理黄瓜，对黄瓜霜霉病有较好的防治效果(表2)。四图1水稻基因PCR扩增电泳图图2水稻/z;^基因为探针与水稻基因组总DNA杂交结果M-Marker，/^/r-基因阳性对照，1、2、3-水稻基因组总DNA图3水稻/;^基因的核苷酸序列SEQIDNO.l图4水稻*々基因推导氨基酸序列SEQIDNO.2图5水稻Ap々基因构建于pET30a(+)上酶切电泳图图6水稻hpfr蛋白质诱导烟草产生过敏反应A-BL21(DE3)/pETR的粗蛋白质抽提物，B-BL21(DE3)/pET30(a)的粗蛋白质抽提物C-H20图7水稻hpfr蛋白质SDS-PAGE电泳图M-Marker,1.BL21(DE3)/pETR提取的CFEP，2.纯化的水稻hpfr蛋白质图8BL21(DE3)/pETR表达水稻hpfr蛋白质诱导烟草抗TMV图9水稻hpfr蛋白质叶面喷施番茄、辣椒促进生长图10水稻hpfr蛋白质叶面喷施番茄减轻病毒病害发生图11小麦基因的核苷酸序列为SEQIDN0.3图12小麦V>基因推导氨基酸序列SEQIDN0.4图13小麦hpfW蛋白质SDS-PAGE电泳图图14小麦hpfW蛋白质诱导烟草产生过敏反应A-BL21(DE3)/pETW的粗蛋白质抽提物，B-BL21(DE3)/pET30(a)的粗蛋白质抽提物C-H20图15小麦hpfV蛋白质叶面喷施番茄促进生长五具体实施方式实施例11.水稻;2p々基因的发现与克隆根据水稻黄单胞菌白叶枯病致病变种/w/A&。基因开放阅读框设计水稻力/#基因引物5'-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3，和5'-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3'，用PCR方法从水稻中扩增出来源于水稻中&>基因。PCR扩增条件94'C/5min的1个循环，94°C/45sec+60°C/45sec+72°C/45sec的35个循环'，72°C/7min的1个循环。将该基因片段命名为*>基因(图1)。以水稻/^々基因为探针，与水稻基因组总DNA杂交，杂交结果显示，在水稻基因组中有杂交阳性信号(图2)。2.水稻/^/r基因的体外表达PCR产物纯化后经iV&I和SflwHI酶切，连接于表达载体pET30a(+)上，获得重组质粒为pETR[pET30a(+)::/p/rl(图5)。将pETR转化大肠杆菌BL21(DE3),获得重组微生物BLTR[BL21(DE3)/pET30a(+)::/z/刑,在将重组微生物BLTR的单菌落接种20ml的LB+Km20吗/ml中37。C下振荡培养12h,转接于20ml的LB+Km20吗/ml中37。C下振荡培养3h，将1M的IPTG(TaKaRa公司)加入其中，使其终浓度为lmM，继续培养2h。离心(5000rpm，10min)收集菌体。菌体于IO(TC水浴煮沸10min，冷却后离心(12000rpm，10min)，取上清(Cell-freeElicitorProtein,CFEP)，注射烟草叶片叶肉组织细胞中，24h内产生过敏反应(图6)。取上清液3pl进行12%SDS-PAGE电泳，根据标准蛋白质的分子量推算，水稻hpfr蛋白质的分子量约为14.5kD(图7)。3.实验室小计量生产水稻hpfr蛋白质将重组微生物BLTR9的单菌落接种20ml的LB+Km20ng/ml中37'C下振荡培养12h,转接于5L的玉米粉发酵培养基(味精1%,酵母膏1%，玉米粉3.5%)+Km20^ig/ml中37'C下发酵培养3h，加乳糖(终浓度为10mM)诱导培养2h。离心(5000rpm，10min)收集菌体。菌体于100。C水浴煮沸10min，冷却后离心(12000rpm，10min)，取上清，即为水稻hpfr蛋白质。1L玉米粉发酵培养基大约可以产生1.5ghpfr蛋白质。实施例2水稻/y^基因表达产物hpfr蛋白质的直接使用水稻//^"基因的表达产物hpfr蛋白质按15、30、60pg/ml的浓度对植物进行叶面喷洒。1.诱导Xanthi烟草对TMV的抗性表型将水稻hpft和harpinx。。蛋白质的CFEP母液分别稀释至浓度为15、30、60pg/ml，用微型喷雾器喷施成株期珊西烟，每处理5个重复；16h后，用摩擦接种活化的TMV于烟草叶片上；4天后观测结果，并统计病斑数。研究结果表明，水稻hpfr和harpinx。。处理烟草，都有明显诱导烟草抗TMV的能力(枯斑数目上的减少)(图8)。经LSD法多重比较分析(F189464)表明，BL21(DE3)/pETR和BL21(DE3)/pET30a(+)::/^/^"。。的蛋白质抽提物处理与pET30(a)/BL21(DE3)蛋白质抽提物对照相比差异极显著(表l)。在浓度为6(^L/mL时诱导抗病性效果最显著，水稻hpfr蛋白质的防效为96.35%，与harpinx。。防效(95.9%)相近。2.促进植物生长，提高产量将水稻hpfr蛋白质CFEP母液稀释至浓度为60pg/ml;在番茄、辣椒大棚，分别在苗期、花期和座果期喷施，研究结果表明，处理的番茄、辣椒长势明显优于未处理(图9)，采摘期提前1周左右水稻hpfr蛋白质处理番茄产量比未处理提高40.3%,辣椒提高31.6%。番茄上病毒病害发生明显减轻(图IO)。表1BL21(DE3)/pETR9表达水稻hpfr蛋白质诱导烟草抗TMV的效果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>*:尸<0.01水平上的差异显著性来源于植物的与上述水稻/^^基因的同源序列统一命名为/ZJ^C基因，其特征在于，用实施例l水稻/^々基因引物，以植物的基因组DNA为模板，用PCR方法(方法同实施例l)扩增出/z;^基因，其编码产物具有诱导烟草产生过敏反应、激发植物产生抗性和促进植物生长功能。/^々基因所编码的产物统一命名为hpfic蛋白质。下面实施例以小麦为例，从小麦中获得与水稻/^#基因同源的基因为/^>，表达产物为hp&蛋白质。实施例3小麦中与水稻基因同源基因克隆与表达1.小麦/^>基因克隆与核苷酸序列用设计引物5，-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3，和5，-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3，，用PCR方法(方法同实施例l)从小麦中扩增与水稻&;^基因同源基因，命名为^>基因。/y/iv基因的核苷酸序列为SEQIDN0.3(图11)，大小为414bp，与水稻V户基因的同源性为93%。/^,基因推导氨基酸序列为SEQIDN0.4(图12)。2.小麦/7/y^基因的体外表达和小计量生产hpfw蛋白质(方法同实施例l)将小麦基因连接于表达载体pET30a(+)上，获得重组表达载体pETW9[pET30a(+)通过大肠杆菌BL21(DE3)表达的产物，命名为hpfW蛋白质。该经12XSDS-PAGE电泳，根据标准蛋白质的分子量推算，小麦hpfW蛋白质的分子量约为14.8kD(图12)。3.小麦hpfw蛋白质的生物活性小麦hpfW蛋白质注射烟草叶片叶肉组织细胞中，24h内激发烟草产生过敏反应(图13);用该蛋白质喷雾处理番茄，结果表明，该蛋白质具有促进植物生长功能(图14)，同时，明显减少番茄早疫病的发生；用该蛋白质喷雾处理黄瓜，对黄瓜霜霉病有较好的防治效果(表2)。表2.小麦hpfw蛋白质对作物病害的防治效果(相对防效，％)<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>序列表<110>南京农业大学<120>水稻hpfr基因、表达产物及其应用<130>说明书<140>00<141>2007-02-05<160>6<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>405<212>DNA<213>Oiyzasativa(7K禾舀)<220><221><222>(1)..(405)<223><400>1atgaattctttgaacacacaattcggcggcagcacgtccaaccttcaggttggcccaagc60caggacacaacgttcggttcgaaccagggcggcaaccagggcatctcggaaaagcaactg120gaccagttgctgtgccagctcatctcggccctgcttcagtcgagcaaaaatgctgaggag180ggtaagggtcagggtggcgataatggcggtggccagggcggcaatcagcaggccgggaag240gagaatggcgcctcgccactcacccagatgctgatgaatatcgtcggagagattctccag300gcgcagaatg魄gtg魄ccggtggtgccggcggcagcagcggcggcgactttggtggc360agtttcgccagcagcttctcgaacgacagcgcatcaatgcagtaa405<210>2<211>134<212>PRT<213>Oryzasativa沐稻)<220><221>水稻hpfr基因表达的氨基酸序列<222>(1)..(134)<223>富含苷氨酸<400>2MetAsnSerLeuAsnThrGinPheGlyGlySerThrSerAsnLeuGin151015ValGlyProSerGinAspThrThrPheGlySerAsnGinGlyGlyAsn202530GinGlylieSerGluLysGinLeuAspGinLeuLeuCysGinLeulie354045SerAlaLeuLeuGinSerSerLysAsnAlaGluGluGlyLysGlyGin505560GlyGlyAspAsnGlyGlyGlyGinGlyGlyAsnGinGinAlaGlyLys65707580GluAsnGlyAlaSerProLeuThrGinMetLeuMetAsnHeValGly859095GlulieLeuGinAlaGinAsnGlyGlyGlyAlaGlyGlyAlaGlyGly廳105noSerSerGlyGlyAspPheGlyGlySerPheAlaSerSerPheSerAsn115120125AspSerAlaSerMetGin130134<210>3414DNA小麦(Triticumaestivum)<211><212><23><220><221><222><223><400>小麦hpfw基因(1)..(414)3atgaactctttgaacacacaattcggcggcagcgcgtccaacttccaggttgaccaaagc60cagaacgcgcaatocgattcgagccagggcagcaatggcagccagggtatctcggaaaag〗20caactggaccagttgct爽ccagctcatctcggccctgcttcagtcgagcaaaaatgct180gaggagggtaagggtcagcagggtggcgagaatggcggtggccagggcggcaatcagcag240gccgggaaggagaatggcgcctcgccactcacccagatgctgatgaatatcgtcggagag300attctccaggcgcagaatggtggtggtgccggtggtgccggcggcagcagcggcggcgac360tttggtggcagtttcgccagcagcttctcgaacggaagcgcatcaatgcagtaa414<210>4137PRT小麦(Triticumaestivum)小麦hpfW氨基酸(1)..(137)<211><212><213><220><221><222><223><400>4MetAsnSerLeuAsnThrGinPheGlyGlySerAlaSerAsnPheGin151015ValAspGinSerGinAsnAlaGinSerAspSerSerGinGlySerAsn202530GlySerGinGlyHeSerGluLysGinLeuAspGinLeuLeuCysGin354045LeulieSerAlaLeuLeuGinSerSerLysAsnAlaGluGluGlyLys505560GlyGinGtaGlyGlyGluAsnGlyGlyGlyGinGlyGlyAsnGinGin65707580AlaGlyLysGluAsnGlyAlaSerProLeuThrGinMetLeuMetAsn85卯95lieValGlyGlulieLeuGinAlaGinAsnGlyGlyGlyAlaGlyGly100105110AlaGlyGlySerSerGlyGlyAspPheGlyGlySerPheAlaSerSer115120125PheSerAsnGlySerAlaSerMetGin130135137<210>5<211>33<212>DNA<213>人工合成<220><221>水稻hpfr基因引物左序列<222>(1)"(33)<223><400>5ggaattccatatgaactctttgaacacacaatt33<210>6<211>31<212>DNA<213>人工合成<220><221>水稻hpfr基因引物右序列<222>(1)..(31)<223><400>6cgggatcctattactgcattgatgcgcttcc'3权利要求1.小麦hpfw基因，其序列为SEQIDNO.3。2.根据权利要求1所述的小麦/p>基因，其特征在于，该基因是用水稻/^々基因引物5，-GGAATTCCATATGAACTCTTTGAACACACAATTGG-3，禾口5'-CGGGATCCTATTACTGCATTGATGCGCTTCC-3'，以小麦的基因组DNA为模板，用PCR方法扩增出的，PCR扩增条件94t:/5min的1个循环，94°C/45sec+60°C/45sec+72°C/45sec的35个循环，72°C/7min的1个循环；扩增得到的，/y/W基因编码产物具有诱导烟草产生过敏反应、激发植物产生抗性和促进植物生长功能。3.权利要求1或2所述小麦基因编码的蛋白质，其推导氨基酸序列为SEQIDN0.4。4.权利要求1或2所述小麦/^*基因的表达产物，命名为hpfw蛋白质，该蛋白质具有诱导烟草产生过敏反应、激发植物产生抗性和促进植物生长功能。5.权利要求4所述小麦/^^基因的表达产物在防治植物病害、促进作物生长方面的应用。全文摘要本发明涉及小麦hpfw基因、表达产物及其用途，属农业生物
技术领域：
，用于防治植物病虫害、促进植物生长和提高作物产量。本发明为水稻hpfr基因，是首次从植物中发现具有类似植物病原细菌hrp基因功能的基因序列，编码产物具有激发子的功能，在烟草上产生过敏反应、诱导植物产生抗病性、促进植物生长和提高农作物产量等，由于hpfr基因来源于植物，表达产物hpfr蛋白质通过高效表达载体与微生物发酵产生，是经济环保的生物农药，可以用于大田和保护地植物病虫害防治和提高产量。本发明还提供了小麦hpfw基因，其表达产物hpfw蛋白质具有诱导烟草产生过敏反应、激发植物产生抗性和促进植物生长功能。文档编号A01P21/00GK101429510SQ20081017960公开日2009年5月13日申请日期2007年2月14日优先权日2007年2月14日发明者敏邵,玲郭,高学文申请人:南京农业大学