专利名称：一种植物叶片卷曲调控基因及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种双链RNA结合蛋白BcpLH基因的新 用途。
背景技术：
叶的极性建立直接决定叶的平展性，极性改变会破坏大多数植物叶的平展性，影 响植株的光合、呼吸、蒸腾作用和抗逆性等生理功能。与此同时，叶的巻曲对一些作物来说 是一种非常有用的农艺性状。了解叶极性发生或叶巻曲的遗传规律，揭示这一重要过程的 基因调控机制，对于遗传上控制叶的姿态和形态，发展叶发育的重要理论，改良叶平展度或 巻曲度等遗传性状，提高农作物产量和品质有重要的理论意义和实用价值。
大白菜(Brassica c卿estris L ssp. pekinensis)属于芸薹属植物，在中国禾口远 东地区是主要的蔬菜作物。栽培条件下，大白菜的营养生长可分为4个发育时期幼苗期、 莲座期、包心期和结球期。每个发育时期都具有明显的形态标志，其中叶片的形态特征最为 明显。幼苗期主要是幼叶的分化和生长，莲座期主要进行莲座叶的扩张生长，包心期分化包 叶，而结球期则表现为球叶的分化和扩张生长。幼叶、莲座叶、包叶和球叶是4种不同类型 的叶子，在形状、大小、颜色和生理功能上有所不同不同。 已经知道，许多因素影响大白菜叶片平展或巻曲的发生和发育进程。生长素在叶 片内的不均衡分布、较低的温度和较大的昼夜温差、弱光和短日照，以及充足的碳素营养都 可以促进叶片发育。叶片的平展与巻曲是一个复杂的生物学过程，是环境因子诱导下的形 态学反应。在此过程中，基因的表达和调控是植物接受外界信号和展开发育活动的关键环 节。长期以来，本领域对叶平展和巻曲发育过程中基因的调控作用知之甚少，这在很大程度 上妨碍了对叶片形态发生过程的深入了解，使许多生理实验的结果无法得到正确的解释和 证实。要清晰地了解叶片平展或巻曲发育的生理机制，就必须首先分离与之相关的基因，明 确其结构特征和表达方式，只有这样，才能研究激素和环境因子引起基因表达的生物化学 反应链，建立环境_基因_形态三者的相互关系，了解叶片平展或巻曲发生的复杂机理。
在以往的研究中，本申请人已经利用差异杂交的方法在大白菜中分离和克隆了双 链RNA结合蛋白基因BcpLH，参见Science in China(Series C) 2000 ;43 :321-329。但目前 还有必要对BcpLH基因的功能以及用途进行进一步研究。
发明内容
本发明的目的在于提供双链RNA结合蛋白BcpLH或其编码基因的用途，用于调控 植物叶片巻曲。 本发明的另一目的在于提供一种制备叶片平展或巻曲的转基因植物的方法。
在本发明的第一方面，提供一种双链RNA结合蛋白BcpLH或其编码基因的用途，用 于调控植物叶片的巻曲性。 在另一优选例中，所述的双链RNA结合蛋白BcpLH是
(a)如SEQ ID NO :2氨基酸序列的蛋白；或 (b)将SEQ ID NO :2氨基酸序列经过一个或多个(优选1-20个，更佳地1-10个， 更佳地l-5个)氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有调控植物叶片巻曲性功能 的由(a)衍生的蛋白。 在另一优选例中，所述的双链RNA结合蛋白BcpLH的编码基因是 (i)如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的基因；或 (ii)核苷酸序列与(i)互补的基因。 在另一优选例中，所述的植物是十字花科芸薹属植物。
在另一优选例中，所述的植物选自大白菜，或拟南芥。 在本发明的第二方面，提供一种增加植物叶片平展性的方法，所述方法包括将双 链RNA结合蛋白BcpLH的编码基因转入植物中，获得叶片平展的转基因植物。
在另一优选例中，所述方法包括 (1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有与表达载体正向连接的双 链RNA结合蛋白BcpLH的编码基因； (2)将植物细胞、组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使双链RNA结合蛋
白BcpLH的编码基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上； (3)选择出转入了双链RNA结合蛋白BcpLH的编码基因的植物细胞、组织、器官；
和 (4)将步骤(3)中的植物细胞、组织、器官再生并选出转基因植物，获得叶片平展 的转基因植物。 在本发明的第三方面，提供一种增加植物叶片巻曲性的方法，所述方法包括将反 义的双链RNA结合蛋白BcpLH的编码基因转入植物中，获得叶片巻曲的转基因植物。
在另一优选例中，所述方法包括 (si)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有与表达载体反向连接的双 链RNA结合蛋白BcpLH的编码基因； (s2)将植物细胞、组织或器官与步骤(si)中的农杆菌接触，从而使反义的双链 RNA结合蛋白BcpLH的编码基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
(s3)选择出转入了反义的双链RNA结合蛋白BcpLH的编码基因的植物细胞、组织、 器官；和 (s4)将步骤(s3)中的植物细胞、组织、器官再生并选出转基因植物，获得叶片巻 曲的转基因植物。 本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见 的。
图1 :BcpLH正义基因未能改变大白菜莲座叶的巻曲，反义基因载体 35: :anti-BcpLH引起大白菜本来平展的叶片向上巻曲。 其中，A :大白菜(对照)；B :大白菜转基因植物35S: :BcpLH ;C :大白菜转基因植物 35S::anti-BcpLH。
图2 :BcpLH回复hyll巻曲不同程度类型的转基因植株的表型。WT表示野生型；1 型，II型和III型分别表示完全回复，部分回复和未回复三种类型的转基因株系。
图3 :BcpLH在拟南芥和大白菜转基因植物根尖组织中过量表达，其蛋白在细胞核 中定位。A和C:背景，B、D和E :BcpLH-GFP， A、B、C和D为拟南芥转基因植物；E为大白菜 转基因植物。
具体实施例方式
本发明人经过长期的研究，首次发现双链RNA结合蛋白BcpLH参与了植物叶巻曲 的调控作用。基于该调控作用，可以制备叶片平展或叶片巻曲的转基因植物。
如本文所用，所述的"植物"包括但不限于十字花科、禾本科、蔷薇科。比如，所述 的"植物"包括但不限于十字花科芸薹属的大白菜、拟南芥，禾本科的水稻，此外还包括烟 草、瓜果、蔬菜、油菜等等。较佳地，所述的"植物"是十字花科芸薹属的植物。
本发明人意外地发现，双链RNA结合蛋白BcpLH(BcpLH蛋白)参与了植物叶巻曲 的调控作用，在植物中转入正义的双链RNA结合蛋白BcpLH编码基因可以使得植物的叶片 平展，而转入反义的双链RNA结合蛋白BcpLH编码基因则可以使得植物的叶片巻曲。因此， 双链RNA结合蛋白BcpLH的编码基因可用于制备叶片平展或叶片巻曲的转基因植物。
本发明人构建了大白菜包心早期茎尖组织特异的cDNA文库，分别与莲座叶和 包叶cDNA两个探针进行差异杂交，筛选出一个全长的cDNA克隆。BcpLH.基因DNA序列 和推导氨基酸序列同源性比较表明，该基因编码的蛋白质含有两个双链RNA结合结构域 (dsRNA-binding domains)，与人和小鼠dsRNA结合蛋白基因TRBP具有较高的同源区域。定 量RT-PCR分析的结果表明，BcpLH基因主要在包心期的包叶组织中表达。在包心期用IAA 涂抹植株显著增加了包叶中BcpLH基因的转录产物。据此认为，BcpLH基因与包叶的发生 和叶球的形成有关，它的表达受生长素的诱导调节。 本发明人选择了拟南芥hyll突变体为实验材料，通过对其叶脉模式和近远轴极 性等叶发育相关性状的观察，以探讨HYL1基因对叶巻曲发生调控的可能机制。和野生型相 比，hyll突变体具有向上巻曲(偏下性生长)的叶片特征，次级叶脉的复杂度降低而且常 常出现断裂的现象。在hyll突变体叶巻曲发生突出的侧部区域，叶肉细胞的近远轴极性丧 失，表现出栅栏细胞和海绵细胞的混乱。但表皮细胞的近远轴极性并没有改变，而只是远轴 面的细胞数目减少，细胞面积变大。利用半定量RT-PCR和原位杂交的方法，对HYL1基因 的表达方式进行了检测分析。结果发现，在hyll突变体成熟叶片中，近轴面决定基因REV 表达比野生型增高，而远轴面决定基因FIL表达减弱。原位杂交的结果显示，REV基因在 野生型叶片中的近轴面表达，而在hyll突变体中它的表达区域扩大到近远轴面都有表达。 Northern印迹实验表明，hyll突变体叶片和幼苗中miR 165的累积比野生型的相应部位 明显降低。由此推断，HYLl基因通过控制miR 165的合成与累积，调节与此有互补序列的 REV基因mRNA的剪切，维持该mRNA在近轴面的含量，从而控制叶片的平展发育。HYL1基因 编码的蛋白含有两个A型双链RNA结合结构花式(double-stranded RNA binding motif， DSRM)，与线虫的双链RNA结合蛋白RDE-4和果蝇的R2D2蛋白具有较高的同源性。此外该基 因的C末端还含有一个双向核定位序列以及6个正向重复序列。为了研究HYL1蛋白不同 结构域之间的生物学功能差异，本发明人分别对HYL1基因进行了缺失突变，在35S启动子驱动下转化拟南芥hyll突变体。分析了不同缺失片断转基因植株的叶相关性状，及对外源 ABA和IAA的生理反应，以及体内miR165和miR160的累积量。结果表明HYL1基因的两个 DSRM结构域就足以回复hyll叶巻曲的突变表型，同时还包括植株对外源ABA和IAA生理反 应的回复以及幼苗和成熟叶片中miR165和miR160的表达量的回复。与此不同，只转入第 一个DSRM的转基因植株不能回复hyll的所有突变表型。据此认为，HYL1的两个DSRM是 其生物学功能正常发挥的关键结构域。再者，HYL1基因对叶极性发育和激素途径中的作用 都是通过miRNA进行调控的。在此基础上，本发明人利用转基因的方法对BcpLH基因在大 白菜中的生物学功能做了详细分析。本发明人先将BcpLH基因转移到拟南芥hyll突变体 中，转基因植株能够回复hyll的所有突变表型，包括叶巻曲、对外源激素的反应以及miRNA 的累积等。BcpLH基因缺失突变的回复实验表明BcpLH的两个DSRM是叶片平展发育所必 须的结构域，同拟南芥两个DSRM结构域对hyll突变表型的互补是一致的。这一结果说明， BcpLH和HYL1对叶极性和叶平展性的调控作用是相同的。半定量RT-PCR和实时定量PCR 的结果表明，BcpLH基因在大白菜不同时期叶片中的表达和叶片的巻曲度呈负相关性，即平 展的幼叶中BcpLH基因的表达量最高，向内巻曲的包叶中的表达量其次，巻曲程度最高的 球叶中的表达量最低。本发明人分别构建了 35S: :BcpLH-GFP和35S: :anti-BcpLH的正反 义植物表达载体。将正义表达载体转化拟南芥(Nossen生态型)以研究BcpLH基因的亚细 胞定位。将正、反义表达载体分别转化结球型大白菜T508，以研究BcpLH基因对大白菜叶 片发育的调节。结果表明BcpLH基因和HYLl基因一样定位于细胞核内；当BcpLH基因的 过量表达时，sense-BcpLH大白菜植株不能在正常生育期结球；当BcpLH基因的表达被抑制 时，anti-sense大白菜植株在幼苗期就表现出叶片向上巻曲的性状。本发明人推论，大白 菜BcpLH基因的表达是受发育调控的，在幼苗期高水平表达，因为此时叶片中miR 165含量 较高，REV基因表达产物的分布保持了叶的极性，叶子是平展的；在结球期BcpLH基因的表 达很弱，就像hyll突变体一样，叶片中miR 165含量降低，REV基因表达产物的分布扰乱叶 的极性，叶片呈现巻曲的表型。 本发明所述的BcpLH蛋白还包括BcpLH蛋白的片段、衍生物和类似物。如本文所 用，术语"片段"、"衍生物"和"类似物"是指基本上保持本发明的BcpLH蛋白相同的生物学 功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或 非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残 基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基 团的蛋白，或(iii)成熟蛋白与另一个化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二 醇)融合所形成的蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前 导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义 这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。 任何一种BcpLH蛋白的生物活性片段都可以应用到本发明中。在这里，BcpLH蛋白 的生物活性片段的含义是指作为一种蛋白，其仍然能保持全长的BcpLH蛋白的全部或部分 功能。通常情况下，所述的生物活性片段至少保持50X的全长BcpLH蛋白的活性。在更优 选的条件下，所述活性片段能够保持全长8卬1^蛋白的60%、70%、80%、90%、95%、99%、 或100%的活性。在本发明中，术语"BcpLH蛋白"指具有BcpLH蛋白活性的SEQ ID N0:2序列的蛋
6白。该术语还包括具有与BcpLH蛋白相同功能的、SEQ ID N0:2序列的变异形式。这些变 异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最 佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/ 或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨 基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的 功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功 能。该术语还包括BcpLH蛋白的活性片段和活性衍生物。 编码BcpLH蛋白或其保守性变异蛋白的多核苷酸序列(编码序列)也可以应用到 本发明中。编码成熟BcpLH蛋白的编码区序列可以与SEQ ID NO :1所示的序列基本上相同 或者是简并的变异体。如本文所用，"简并的变异体"在本发明中是指编码具有SEQ ID NO: 2的蛋白质，但与SEQ ID NO:l所示的编码区序列有差别的核酸序列。 术语"编码基因"可以是包括编码所述蛋白的多核苷酸，也可以是还包括附加编码 和/或非编码序列的多核苷酸。 上述多核苷酸的变异体也是可用的，其编码与本发明有相同的氨基酸序列的蛋白 或蛋白的片段、类似物和衍生物。此多核苷酸的变异体可以是天然发生的等位变异体或非 天然发生的变异体。这些核苷酸变异体包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本 领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、 缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的蛋白的功能。 应理解，虽然本发明的BcpLH基因优选获自大白菜，但是获自其它植物的与大白 菜BcpLH基因高度同源(如具有80%以上，如85%、90%、95%、甚至98%序列相同性)的 其它基因也在本发明考虑的范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的， 例如BLAST 。 本发明的BcpLH蛋白的编码序列通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方 法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列 来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作 为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将 各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列， 尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的 片段。目前，已经可以完全通过化学合成来得到所述编码序列。然后可将该编码序列引入 本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。 包含所述编码序列的载体，以及用所述的载体或BcpLH蛋白编码序列经基因工程 产生的宿主细胞也包括在本发明中。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含BcpLH蛋 白编码序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、 DNA合成技术、体内重组技术等。所述的序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以 指导mRNA合成。包含上述的适当编码序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于 转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。 宿主细胞通常是植物细胞。转化植物一般可使用农杆菌转化或基因枪转化等方 法，例如叶盘法、水稻幼胚转化法等；优选的是农杆菌法。对于转化的植物细胞、组织或器官 可以用常规方法再生成植株，从而获得相对于野生型而言叶片巻曲性能发生改变的植物。
本发明提供了所述的BcpLH蛋白或其编码基因的用途，用于调控植物叶片的巻曲 或平展。在一种方式下，正义表达BcpLH蛋白可用增加植物叶片的平展性。在另一种方式 下，反义转入BcpLH基因后可增加植物叶片的巻曲性。因此，可基于BcpLH蛋白对于植物叶 片的影响作用来改变植物，从而达到根据实际生产需要改良植物品质的目的。较佳地，所述 的植物是大白菜或拟南芥。 本发明还涉及BcpLH蛋白或其编码基因的激动剂或拮抗剂(如反义的BcpLH基 因或如miRNA)及其用途。由于BcpLH的激动剂或拮抗剂可调节BcpLH的表达和/或调节 BcpLH的活性等，因此，所述的BcpLH的激动剂或拮抗剂也可通过对BcpLH的影响来调节植 物叶片的巻曲或平展，从而达到改良植物的目的。 任何可调节BcpLH蛋白的活性、调节BcpLH蛋白的稳定性、促进或抑制BcpLH蛋白
的表达、延长或减少BcpLH蛋白有效作用时间、或促进或降低BcpLH基因的转录和翻译的物
质均可用于本发明，作为可用于调节植物叶片平展或巻曲的有效物质。 本发明还涉及一种改良植物的方法，该方法包括调节所述植物中BcpLH蛋白的表达。 —方面，本发明提供了一种增加植物叶片平展性的方法，所述的方法包括使所述 植物过量表达BcpLH蛋白。 另一方面，本发明还提供了一种增加植物叶片巻曲性的方法，所述的方法包括降 低所述植物中BcpLH蛋白的表达(包括使BcpLH蛋白不表达或低表达)。
在得知了所述的BcpLH蛋白的用途后，可以采用本领域人员熟知的多种方法来调 节所述的BcpLH蛋白的表达。比如可通过一定的途径将携带BcpLH编码基因的表达单位 (比如表达载体或病毒等)递送到耙点上，并使之表达活性的BcpLH蛋白。此外，也可以采 用本领域人员熟知的多种方法来降低BcpLH蛋白的表达或使之缺失表达，比如将携带反义 BcpLH基因的表达单位(比如表达载体或病毒等)递送到耙点上，使得细胞或植物组织不表 达或降低表达BcpLH蛋白。 作为本发明的一种实施方式，将BcpLH蛋白的编码基因通过常规的方法克隆到适 当的载体中，将所述的带有外源基因的重组载体导入到可表达所述BcpLH蛋白的植物细胞 中，使所述的植物细胞表达BcpLH蛋白。可通过将所述植物细胞再生成植物，获得过量表达 BcpLH蛋白的植物。 优选的，所述的增加植物叶片平展性的方法包括 (1)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有与表达载体正向连接的双 链RNA结合蛋白BcpLH的编码基因； (2)将植物细胞、组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使双链RNA结合蛋
白BcpLH的编码基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上； (3)选择出转入了双链RNA结合蛋白BcpLH的编码基因的植物细胞、组织、器官；
和 (4)将步骤(3)中的植物细胞、组织、器官再生并选出转基因植物，即为叶片平展 的转基因植物。 优选的，所述的增加植物叶片巻曲性的方法包括 (sl)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有与表达载体反向连接的双
8链RNA结合蛋白BcpLH的编码基因； (s2)将植物细胞、组织或器官与步骤(si)中的农杆菌接触，从而使反义的双链 RNA结合蛋白BcpLH的编码基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；
(s3)选择出转入了反义的双链RNA结合蛋白BcpLH的编码基因的植物细胞、组织、 器官；和 (s4)将步骤(s3)中的植物细胞、组织、器官再生并选出转基因植物，即为叶片巻 曲的转基因植物。 如本文所用，所述的正向连接是指BcpLH的编码基因与表达载体的连接是正义 的连接，即编码基因按照5' — 3'的方向连接于载体上。通常，BcpLH的编码基因位于表达 载体中启动子的下游，也即启动子的3'端下游连接该编码基因的5'端。所述的编码基因 是可操作性地连接到表达载体上的。所述的"操作性连接"或"可操作地连于"指这样一种 状况，即线性DNA序列的某些部分能够调节或控制同一线性DNA序列其它部分的活性。例 如，如果启动子控制序列的转录，那么它就是可操作地连于编码序列。 如本文所用，所述的反向连接是指BcpLH的编码基因与表达载体的连接是反义 的连接，即编码基因按照3' — 5'的方向连接连接于载体上。通常，BcpLH的编码基因位于 表达载体中启动子的下游，也即启动子的3'端下游连接该编码基因的3'端。
可采用任何适当的常规手段，包括试剂、温度、压力条件等来实施所述的方法。其 它增加BcpLH表达的方法是本领域周知的。例如，可通过用强启动子驱动从而增强BcpLH 的表达。或者通过增强子来增强该BcpLH基因的表达。适用于本发明方法的强启动子包括 但不限于35s启动子、水稻、玉米的Ubi启动子等。 BcpLH蛋白的编码基因的另一个应用是根据所述基因序列信息产生特异性的分子 标记，包括但不限于SNP(单核苷酸多态)、SSR(简单序列重复多态)、RFLP(限制性内切酶 长度多态)、CAP(切割扩增片段多态)。用这些标记可以检测大白菜群体的遗传结构的动 态变化，有助于大白菜品种的纯度鉴定。 在本发明的较佳实施例中，通过对大白菜双链RNA结合蛋白基因的功能分析，揭 示大白菜品种间特异性及其进化的分子机理。在实践上可以根据该基因的结构及其功能 设计叶片巻曲调控的分子靶点；可以将该基因和相应的靶基因共价导入大白菜等芸薹属植 物培育新型农艺性状品种；有助于建立大白菜群体叶片形态分化的检测体系，研究大白菜 microRNA(miRNA)在叶片巻曲中的调控规律，揭示叶片形态建成和分化的分子特点。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明 而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条 件如Sambrook等人，分子克隆实验室指南(New York : Co Id Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和 份数按重量计算。 实施例1 :BcpLH基因结构序列表中的SEQ ID NO :l是BcpLH的基因DNA序列。BcpLH基因DNA长度为1092bp， 其全长CDS为825bp，5'和3，非翻译区分别为57bp和210bp。
实施例2 :BcpLH基因编码蛋白结构 BcpLH基因编码的蛋白序列如序列表中SEQ ID NO :2所示。双链RNA结合蛋白基
9因BcpLH编码一个由274个氨基酸残基组成的蛋白。数据库比较发现该双链结合基因与拟 南芥的双链结合蛋白基因HYL1的部分序列同源。 实施例3 :35S: :BcpLH-GFP植物表达载体转化拟南芥和大白菜
本发明人构建了 35S: :BcpLH-GFP植物表达载体。构建方法如下用5' -CAAGGAT CCATGACGCGTCGCAACTGAATGT-3'(SEQ ID NO :3)和5，-CGGTACCATCTTGTCATCGTCGTCCTTGTAG TCTGCKTGGCTTGCTTCT-3' (SEQ ID NO :4)引物，常规方法扩增BcpLH全长基因。PCR产物经 BamHI/Kpn I双酶切后克隆到pEGFP载体(购自Invitrogen)中，在C端和GFP同框融合， 并测序验证读码框正确。然后用BamH I/Xba I双酶切亚克隆至pJRl载体(获自英国诺丁 汉大学)上，使融合基因处于35S启动子下。 将该植物表达载体导入GV3101农杆菌(购自Invitrogen)后分别用浸花法和 真空抽滤法转化拟南芥(Nossen生态型，获自美国宾夕法尼亚州大学)和结球型大白菜 T508 (获自新桥农场)，以研究BcpLH基因的亚细胞定位。收获种子后于Kan培养基中筛 选，鉴定阳性植株。将35S: :BcpLH-GFP转基因植株的根分别于荧光显微镜和共聚焦显微镜 下观察GFP的绿色荧光在细胞中的定位。同时用DAPI染细胞，因为DAPI能使细胞核特异 染色。见图3，荧光显微镜的结果表明BcpLH-GFP的绿色荧光(B和D)主要定位在细胞核 中，能与DAPI的蓝色(A和C)重合。而且，将35S::BcpLH-GFP植物表达载体转化到大白菜 T508中，取阳性转基因植株的根于荧光显微镜下观察，结果也证明BcpLH基因确实是定位 在细胞核中的(E)。 实施例4 :BcpLH基因能够回复hyll的突变表型 本发明人利用转基因的方法对BcpLH基因在大白菜中的生物学功能做了详细分 析。本发明人扩增了 BcpLH基因的不同长度片断B5 (l-255bp) ，B6 (l-513bp) ，B7 (l-678bp) 和B8 (全长CDS，825bp)(图2上图)。通过引物在不同长度片断的5'端引入了一段增强植 物表达的序列GGATCCACA。而且B5， B6和B7片断通过引物引入了终止密码子。以上四个 PCR产物分别经BamH I/Sal I双酶切后克隆到pJRl载体上，PCR及酶切鉴定后，再用EcoR I/Hind III双酶切连入pCAMBIA3301双元载体(购自CAMBIA)。最后将重组质粒用冻融法 转入GV3101农杆菌中，PCR鉴定成功转入。获得重组载体通过农杆菌法转移到拟南芥hyll 突变体(叶片向上巻曲的拟南芥突变体，获自美国宾夕法尼亚州大学)中。
结果发现，将全长BcpLH基因转移到拟南芥hyll突变体中，转基因植株能够回复 hyll的突变表型，见图2。 BcpLH基因缺失突变的回复实验表明BcpLH的两个DSRM是叶片 平展发育所必须的结构域，同拟南芥两个DSRM结构域对hyll突变表型的互补是一致的。这 一结果说明，BcpLH对叶极性和叶平展性也具有调控作用。
实施例5 :正义和反义BcpLH转基因大白菜的观察 本发明人分别构建了 BcpLH的正义转基因载体35S: :BcpLH-GFP和反义转基因载 体35S: :anti-BcpLH。 35S: :BcpLH-GFP的构建方法如实施例3。 35S: :anti-BcpLH构建方 法如下将全长的BcpLH基因反向连接到(即以3' — 5'的顺序连接到5' — 3'顺序的载 体中)PJR1载体的BamH I/Kpn I位点内。 将上述正反义表达载体分别转化拟南芥(Nossen生态型)和结球型大白菜T508， 获得正义转基因大白菜植株35S: :BcpLH，和反义转基因植株35S: :anti-BcpLH。以研究 BcpLH基因对大白菜叶片发育的调节。
结果表明当BcpLH基因的过量表达时，35S::BcpLH大白菜植株不能在正常生育 期结球；当BcpLH基因的表达被抑制时，35S: :anti-BcpLH大白菜植株在幼苗期就表现出叶 片向上巻曲的性状，见图l。 综上，本发明人认为，大白菜BcpLH基因的表达是受发育调控的，在幼苗期高水平 表达，因为此时叶片中miR165含量较高，REV基因表达产物的分布保持了叶的极性，叶子是 平展的；在结球期BcpLH基因的表达很弱，就像hyl 1突变体一样，叶片中miR165含量降低， REV基因表达产物的分布扰乱叶的极性，叶片呈现巻曲的表型。 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独 引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范 围。 序列表 〈110〉中国科学院上海生命科学研究院
〈120〉 一种植物叶片巻曲调控基因及其应用
〈130>087045
〈160>4 〈170>PatentIn version 3. 3
〈210>1
〈211>1092
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权利要求
一种双链RNA结合蛋白BcpLH或其编码基因的用途，其特征在于，用于调控植物叶片的卷曲性。
2. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的双链RNA结合蛋白BcpLH是(a) 如SEQ ID NO :2氨基酸序列的蛋白；或(b) 将SEQ ID NO:2氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形 成的，且具有调控植物叶片巻曲性功能的由(a)衍生的蛋白。
3. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的双链RNA结合蛋白BcpLH的编码基因是(i) 如SEQ ID NO :1所示核苷酸序列的基因；或(ii) 核苷酸序列与(i)互补的基因。
4. 如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的植物是十字花科芸薹属植物。
5. 如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的植物选自大白菜，或拟南芥。
6. —种增加植物叶片平展性的方法，其特征在于，所述方法包括将双链RNA结合蛋白 BcpLH的编码基因转入植物中，获得叶片平展的转基因植物。
7. 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法包括(1) 提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有与表达载体正向连接的双链 RNA结合蛋白BcpLH的编码基因；(2) 将植物细胞、组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使双链RNA结合蛋白 BcpLH的编码基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(3) 选择出转入了双链RNA结合蛋白BcpLH的编码基因的植物细胞、组织、器官；禾口(4) 将步骤(3)中的植物细胞、组织、器官再生并选出转基因植物，获得叶片平展的转 基因植物。
8. —种增加植物叶片巻曲性的方法，其特征在于，所述方法包括将反义的双链RNA结 合蛋白BcpLH的编码基因转入植物中，获得叶片巻曲的转基因植物。
9. 如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述方法包括(si)提供携带表达载体的农杆菌，所述的表达载体含有与表达载体反向连接的双链 RNA结合蛋白BcpLH的编码基因；(s2)将植物细胞、组织或器官与步骤(si)中的农杆菌接触，从而使反义的双链RNA结 合蛋白BcpLH的编码基因转入植物细胞，并且整合到植物细胞的染色体上；(s3)选择出转入了反义的双链RNA结合蛋白BcpLH的编码基因的植物细胞、组织、器 官；和(s4)将步骤(s3)中的植物细胞、组织、器官再生并选出转基因植物，获得叶片巻曲的 转基因植物。
10. 如权利要求6-10任一所述的方法，其特征在于，所述的植物是十字花科芸薹属植物。
全文摘要
本发明公开了一种植物叶片卷曲调控基因及其应用。本发明还公开了一种制备叶片平展或卷曲的转基因植物的方法。所述基因在生产实践上可以用于制备叶片卷曲或平展的植物；以及用于培育新型植物品种等。
文档编号A01H1/00GK101747418SQ200810203770
公开日2010年6月23日 申请日期2008年12月1日 优先权日2008年12月1日
发明者何玉科, 孙传宝, 薛万新 申请人:中国科学院上海生命科学研究院