专利名称：：太子参四倍体不定根诱导培养方法
技术领域：
：本发明涉及的是一种生物工程领域的方法，具体是一种太子参四倍体不定根诱导培养方法。
背景技术：
：太子参是我国的一味珍贵的滋补类中草药，以根入药，具有补气健脾，增强人体免疫力的作用，《神农本草经》中列为上品。素有"老食人参，中食党参，少食太子参"的说法。由于用量巨大，目前面临着两个危机:一是野生植物资源蕴藏量和产量普遍存在着下降趋势；二是太子参需求量不断增加，造成了对该药用植物资源的超量采挖。传统的太子参大田栽培一方面受"天时地利"的影响，产量质量波动大；另一方面不可避免地带来农药残留污染和植物病毒病等问题。另外，组织、细胞生物反应器培养具有生长迅速，易于控制的特点，从而可以逐渐取代大田栽培满足市场的需要。MS培养基为Murashige和Skoog(1962)公开的培养基，其中1/2MS培养基为大量元素减半MS培养基。MS培养基在现有的生物以及农业等领域有着广泛的应用。经对现有技术文献的检索发现，谢燕等在《资源与环境学报》上发表的"太子参快繁技术的优化及同源四倍诱导"，该文章中以生长点为外植体诱导四倍体，用这种方式诱导出来的四倍体多为嵌合体。该文中虽然给出了太子参组织培养方法的介绍，但四倍体来源的太子参不定根诱导和连续培养并没有进行研究。
发明内容本发明的目的是针对上述现有技术中的不足，提出了一种太子参四倍体不定根诱导培养方法，本发明以太子参愈伤组织为材料，获得纯合四倍体个体，再从纯合四倍体愈伤组织上诱导获得不定根。本发明是通过以下技术方案实现的，本发明包括如下步骤-步骤一，用氯化汞溶液对太子参种子表面进行消毒，然后接种到种子萌发培4养基中，暗培养；步骤二，切取下胚轴接种到胚性愈伤组织诱导培养基中，进行愈伤组织诱导；步骤三，将步骤二生成的愈伤组织继代2-4次，并将继代后的愈伤组织在秋水仙碱中浸泡，然后转到分化培养基中，培养出再生植株；步骤四，对再生植株根尖的染色体进行检测，根据染色体检测结果选取四倍体植株，并用流式细胞仪筛选纯合四倍体株系；步骤五，将纯合四倍体株系的茎段接种到生根用愈伤组织诱导培养基中诱导愈伤组织；步骤六，将步骤五生成的愈伤组织接种到不定根诱导培养基中诱导不定根；步骤七，将步骤六诱导出的四倍体不定根接种到摇瓶中，然后放置在摇床上振荡培养；步骤八，将振荡培养后的不定根接种到反应器中进行间歇喷雾式培养。所述种子萌发培养基，为添加lmg/L赤霉素的MS培养基。所述胚性愈伤组织诱导培养基，为添加2mg/L萘乙酸，0.2mg/L2，4-氯化苯氧乙酸，0.2mg/L激动素的MS培养基。所述继代，在不含激素的MS培养基中进行，每次20-40天。所述分化培养基，为添加3%血红素、0.2mg/L毒莠锭、1.0mg/L赤霉素、大量元素减半且不含硝酸铵的MS培养基。所述生根用愈伤组织诱导培养基，为添加2mg/L萘乙酸的MS培养基。所述不定根诱导培养基，为添加3.0mg/L吲哚丁酸、0.lmg/L6-苄氮基嘌呤、50克每升蔗糖且大量元素减半的MS培养基。所述放置在摇床上振荡培养，其时间为5天-10天。所述间歇喷雾式培养，其使用的反应器为喷雾式反应器，反应器中使用的培养基为添加1.5mg/LIBA、0.05mg/L6-BA、30g/L蔗糖且大量元素减半的MS培养基。具体条件为通气速率为0.3vvm，灌注速率为每天50%(体积百分比)，喷雾持续时间为一次5分钟，喷雾周期为4次每小时，培养温度为25°C，暗培养。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果本发明以太子参愈伤组织为材料，获得纯合四倍体个体，再从纯合四倍体愈伤组织上诱导获得不定根。本发明5获得的太子参四倍体不定根不但生长速率快，其化学成份的含量高于大田种植生产的根。具体实施例方式下面对本发明的实施例作详细说明本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。本实施例的太子参种子来自中国药科大学。本实施例所述MS培养基采用Murashige和Skoog(1962)公开的培养基，具体成分如下<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>所述1/2MS培养基为大量元素减半MS培养基。本实施例包括如下步骤步骤一，用质量百分比0.1%的升汞溶液对太子参种子表面消毒12分钟后，接种到添加lmg/L赤霉素到MS培养基的种子萌发培养基(即MS+1.0mg/LGA3)中，获得无菌材料，并于黑暗中培养一周；步骤二，切取1.Ocm长的下胚轴接种到胚性愈伤组织诱导培养基中诱导愈伤组织，胚性愈伤组织诱导培养基为添加2mg/L萘乙酸，0.2mg/L2，4-氯化苯氧乙酸，0.2mg/L激动素的MS培养基(即MS+2.Omg/LNAA+O.2mg/L2，4-D+0.lmg/LKT);步骤三，将步骤二生成的愈伤组织在不含激素的MS培养基上继代2-4次，每次20天-40天，并将继代后的愈伤组织在0.1%秋水仙碱中浸泡5分钟-30分钟，然后无菌清洗3-6次，并转到分化培养基中，两个月后培养出再生植株，分化培养基为添加3%血红素、0.2mg/L毒莠锭、1.0mg/L赤霉素、大量元素减半且不含硝酸铵的MS培养基(即不含硝酸铵的1/2MS+3。/。血红素+毒莠锭0.2mg/L+GA3l.0，g/L);步骤四，对再生植株根尖的染色体进行检测，根据染色体检测结果选取染色体检测结果为2n=4X=64的植株，即选取出四倍体植株，并用流式细胞仪筛选纯合四倍体株系；步骤五，将纯合四倍体植株的茎段接种到生根用愈伤组织诱导培养基中诱导愈伤组织一个月，生根用愈伤组织诱导培养基为添加2mg/L萘乙酸的MS培养基(即MS+NAA2.0mg/L);步骤六，将步骤五生成的愈伤组织接种到不定根诱导培养基中诱导不定根，不定根诱导培养基为添加3.Omg/L吲哚丁酸、0.lmg/L6-苄氨基嘌呤、50克每升蔗糖且大量元素减半的MS培养基(即1/2MS+3.Omg/LIBA+O.1mg/L6-BA+50g/L蔗糖)；步骤七，将步骤六生长出的不定根接种到摇瓶中，接种量为5%-12%(每100ml体积接种的鲜克数)，然后放置在摇床上于lOOrpm，25匸下振荡培养，培养一周时间；步骤八，将振荡培养后的不定根按8%-15%(每100ml体积接种的鲜克数)接种到4.8升的喷雾式反应器中培养，反应器中的培养基为添加1.5mg/LIBA、0.05mg/L6-BA、30g/L蔗糖且大量元素减半的MS培养基(即1/2MS+1.5mg/LIBA+O.05呢/L6-BA+30g/L蔗糖)，通气速率为0.3vvm，灌注速率为50%(体积百分比)每天，喷雾时间为一次5分钟，喷雾周期为4次每小时，培养温度为25°C，暗培养。本实施例分别进行了太子参胚性愈伤组织诱导、体细胞胚植物再生、四倍体诱导与纯合体筛选、纯合四倍体植株不定根诱导与喷雾式生物反应器培养等实验。结果太子参胚性愈组织诱导率这到100%，体细胞胚植物再生率达到30%，得到四倍体50株，得到12个纯合体株系。用纯合体株系的茎段诱导生根用愈伤组织时，诱导率达了100%。将该愈伤组织(平均直径为lcm)转移到不定根诱导培养基中，l个月后每块愈伤组织上平均分化了22条不定根。本实施例中将太子参纯合四倍体不定根接种到喷雾式反应器中进行了培养，结果表明，在该培养条件下，最大平均生长率达到0.25±0.08每天，高于用气升式反应器培养时的0.22±0.12每天。权利要求1、一种太子参四倍体不定根诱导培养方法，其特征在于，包括如下步骤步骤一，用氯化汞溶液对太子参种子表面进行消毒，然后接种到种子萌发培养基中，暗培养；所述种子萌发培养基为添加1mg/L赤霉素的MS培养基；步骤二，切取下胚轴接种到胚性愈伤组织诱导培养基中，进行愈伤组织诱导，所述胚性愈伤组织诱导培养基为添加2mg/L萘乙酸，0.2mg/L2，4-氯化苯氧乙酸，0.2mg/L激动素的MS培养基；步骤三，将步骤二生成的愈伤组织继代2-4次，并将继代后的愈伤组织在秋水仙碱中浸泡，然后转到分化培养基中，培养出再生植株；所述分化培养基为添加质量百分比为3％的血红素、0.2mg/L的毒莠锭、1.0mg/L的赤霉素、大量元素减半且不含硝酸铵的MS培养基；步骤四，对再生植株根尖的染色体进行检测，根据染色体检测结果选取四倍体植株，并用流式细胞仪筛选纯合四倍体株系；步骤五，将纯合四倍体株系的茎段接种到生根用愈伤组织诱导培养基中诱导愈伤组织；所述生根用愈伤组织诱导培养基为添加2mg/L的萘乙酸的MS培养基；步骤六，将步骤五生成的愈伤组织接种到不定根诱导培养基中诱导不定根；所述不定根诱导培养基为添加3.0mg/L的吲哚丁酸、0.1mg/L的6-苄氨基嘌呤、50g/L的蔗糖且大量元素减半的MS培养基；步骤七，将步骤六诱导出的四倍体不定根接种到摇瓶中，然后放置在摇床上振荡培养；步骤八，将振荡培养后的不定根接种到反应器中进行间歇喷雾式培养。2、根据权利要求1所述的太子参四倍体不定根诱导培养方法，其特征是，所述继代在不含激素的MS培养基中进行，每次20-40天。3、根据权利要求1所述的太子参四倍体不定根诱导培养方法，其特征是，所述放置在摇床上振荡培养，其时间为5天-10天。4、根据权利要求1所述的太子参四倍体不定根诱导培养方法，其特征是，所述间歇喷雾式培养，其使用的反应器为喷雾式反应器，反应器中使用的培养基为添加1.5mg/LIBA、0.05mg/L6-BA、30g/L蔗糖且大量元素减半的MS培养基。5、根据权利要求1或4所述的太子参四倍体不定根诱导培养方法，其特征是，所述间歇喷雾式培养，其具体条件为通气速率为0.3vvm，灌注速率为每天50%，喷雾持续时间为一次5分钟，喷雾周期为4次每小时，培养温度为25'C，暗培养。全文摘要本发明涉及一种生物工程领域的太子参四倍体不定根诱导培养方法，用氯化汞对太子参种子表面进行消毒，然后接种到种子萌发培养基中培养；切取下胚轴接种到胚性愈伤组织诱导培养基中诱导愈伤组织；将愈伤组织继代，并在秋水仙碱中浸泡后转到分化培养基中，培养出再生植株；对再生植株根尖的染色体进行检测，用流式细胞仪筛选纯合四倍体植株；将纯合四倍体株系的茎段接种到生根用愈伤组织诱导培养基中诱导愈伤组织；将愈伤组织接种到不定根诱导培养基中诱导不定根；将不定根接种到摇瓶中，放置在摇床上振荡培养；将振荡培养的不定根接种到反应器中。本发明培养的太子参四倍体不定根具有生长快、有效成份含量高的特点。文档编号A01H1/08GK101473788SQ20081020508公开日2009年7月8日申请日期2008年12月31日优先权日2008年12月31日发明者王贵荣,齐念民申请人:上海交通大学