专利名称：：一种用于制备秸秆饲料的发酵菌剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用于制备秸秆饲料的发酵菌剂。
背景技术：
：农作物秸秆是一种重要的生物资源，具有数量大、分布广和种类多等特点。但是长期以来，这些秸秆资源却没有得到合理的开发利用。近几年来，由于农作物产量的大幅度提高和农村薪材结构的改变，越来越多的秸秆成为废弃物，既浪费了资源又污染了环境。因此，解决我国剩余秸秆问题对资源利用和环境污染治理极其重要。秸秆作为反刍动物的饲料也是解决秸秆污染问题、给人类增加蛋白营养来源的重要途径，也符合我国畜牧业长远的发展目标。但是，由于秸秆养分低、适口性差、消化率低，因而如何提高秸秆的适口性、提高其饲用价值是解决我国秸秆公害、提高有机物利用率的一大热点。我国传统的发酵饲料添加剂如甲酸、甲醛等，具有腐蚀性，存在家畜采食安全隐患，且添加量较大，造成成本高和操作不便等缺点。而目前国内普遍使用的饲料发酵菌剂大多依靠进口，价格昂贵，其产品有纯化的单一菌剂和简单混合菌剂，且以简单混合菌剂居多。纯化的单一菌剂是根据所需的功能要求从自然界中分离、纯化后，在严格无菌条件下经过纯培养发酵，再吸附于特定载体上制成的菌剂，菌株多为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum);简单混合菌剂是将两种或两种以上的乳酸菌按一定比例混合后，吸附于特定载体上制成的。以上菌剂存在的主要问题是(1)纯化的单一菌剂中的菌在纯化过程中，由于失去了在自然条件下长期处于协同关系的其他菌的共存，其产酸能力大大降低；(2)纯化的单一菌剂中的菌对生长条件的适应范围较窄，对发酵条件要求较高，发酵成本昂贵；又由于单一菌孤立生长，容易受到其他菌的污染和抑制，使得其在青贮饲料中难以成为控制发酵的优势菌，已有研究结果证实，用植物乳杆菌(Lactobacillusplantar咖)单菌接种效果并不理想；(3)简单混合菌剂中是人为的将几种菌简单混合，各种菌之间是否具有协同关系，是否产生拮抗作用还有待证实。
发明内容本发明的目的是提供一种用于制备秸秆饲料的发酵菌剂。本发明所提供的用于制备秸秆饲料的发酵菌剂的活性成分包括发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)禾口类干酷乳杆菌(Xactobacillusparacasei)。所述秸秆饲料发酵菌剂中，所述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、植物乳杆菌(Xactobacillusplantarum)禾口类干酪乳杆菌(Xactobacillusparacasei)的集落形成单位数目比为(18-20):(4-6):1，具体为i9:5:i。所述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)具体可为发酵乳杆菌3(Xactobacillusferment咖)JCM1173T，所述植物乳杆菌Lactobacillusplantarum)具体可为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)JCM1149T，所述类干酪乳杆菌(bactobacillusparacasei)具体可为类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)NBRC15889。本发明所提供的秸秆饲料发酵菌剂的活性成分也可仅有由所述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)禾口类干酷乳杆菌(Xactobacillusparacasei)组成。所述秸秆饲料发酵菌剂中，所述发酵乳杆菌(Lactobaci1lusfermentum)JCM1173T、所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)JCM1149T和所述类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)N服C15889可分别独立包装，也可混合在一起。本发明的秸秆饲料发酵菌剂可为液体制剂，也可为固体制剂。在上述秸秆饲料发酵菌剂的活性成分的培养物中加入甘油、EDTA等物质，即得到秸秆饲料的液体发酵菌剂，该液体菌剂中的活菌数量和菌的活性可以长期保持稳定，对饲喂的动物也比较安全；在上述液体菌剂中加入吸附载体，如加入麦饭石和/或秸秆粉等，即可获得秸秆饲料的固体发酵菌剂，该固体菌剂中的吸附载体与发酵乳杆菌、植物乳杆菌和类干酪乳杆菌具有高度的亲和力，对饲喂的动物安全，可以使制成的固体菌剂保质期长，方便运输和使用，且干燥、冷冻处理都不会降低固体菌剂中活菌的数量和活性。上述液体菌剂中，所述活性成分、甘油和EDTA的配比为1X10"CFU:(1-5)g甘油(1-2)gEDTA，具体为1X10"CFU:5g甘油lgEDTA。上述固体菌剂中，所述活性成分和所述吸附载体的配比为1X106CFU:(l-10)g吸附载体，具体为1X106CFU:5g吸附载体。本发明所制备的菌剂可用于降解各种植物秸秆(如玉米秸秆、水稻秸秆等)制备秸秆饲料。本发明的用于制备秸秆饲料的发酵菌剂中的各种乳酸菌具有高度的协同作用，自体形成稳定的生态系统，能在未经灭菌的天然原料中快速繁殖、定殖而占据优势，迅速产生大量乳酸，降低发酵料的pH值，改善饲料的发酵品质，提高饲料的营养价值和适口性，对饲喂的动物安全，且应用简易，成本低廉。具体实施例方式实施例1、发酵菌剂中活性成分的筛选MRS培养液的组成(g/L):<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>MRS-S培养液的组成(g/L):<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>将干玉米秸秆和干水稻秸秆分别粉碎成12cm长的小段，加水至最终含水量为70%，然后填装于lOOmL的螺口瓶中，每种秸秆各装10瓶，封口后置于3(TC恒温下自然发酵。发酵1周后，选择PH值下降至4.0以下并发出酸香味的发酵物作为筛选发酵菌剂的来源。将MRS培养液和MRS-S培养液分别装于9个50mL的螺口瓶中，使培养液达到瓶容积的90%，向瓶中分别加入5.5g上述发酵好的玉米秸秆发酵物、水稻秸秆发酵物及以1:1的质量比混合的玉米秸秆发酵物和水稻秸秆发酵物的混合物，每种发酵物重复三瓶，3(TC静置培养。72h后，按5X(体积百分含量)的接种量转接继代培养，测定发酵液的pH值和乳酸的产量。选择PH值下降迅速，产乳酸量较多且对外界环境变化相对稳定的培养物，筛选其中的活性成分。通过分子生态学方法建立16SrDNA克隆文库对上述获得的培养物进行研究，结果表明，上述培养物中的组成菌主要为发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、植物乳杆菌(Xactobacillusplantarum)禾口类干酪乳杆菌(Xactobacillusparacasei)。实施例2、用于制备秸秆饲料的发酵菌剂的制备发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)JCM1173T和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)JCM1149T均购自日本微生物保存中心，类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)N服C15889购自日本技术评价研究所生物资源中心。1、用于制备秸秆饲料的发酵菌剂的制备将发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)JCM1173T、植物乳杆菌(bactobacillusplantarum)JCM1149T禾口类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)NBRC15889分别接种到MRS-S培养基中，3(TC静置培养72h，将19ml上述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)JCM1173T的发酵液、5ml上述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)JCM1149T的发酵液禾口lml上述类干酷乳杆菌(Lactobacillusparacasei)NBRC15889的发酵液混合，使混合发酵液中，发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)JCM1173T、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)JCM1149T和类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)NBRC15889的集落形成单位数目比为19:5:l，该混合发酵液中的集落形成单位数目为1X108CFU/ml。将上述混合发酵液、甘油和EDTA按照lX103ml:5g:lg的配比混合，得到秸秆饲料的液体发酵菌剂。将上述获得的秸秆饲料的液体发酵菌剂和玉米秸秆按照lml:500g的配比混合，发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)JCM1173T、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)JCM1149T禾口类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)NBRC15889在25-3(TC条件下厌氧发酵2d，乳酸菌大量繁殖，产生大量乳酸，发酵料的pH值迅速降低。利用分子生态学技术一变性梯度凝胶电泳法(DGGE)证明，在发酵料中，以发酵乳杆菌(Lactabacillusfermentum)JCM1173T为主的乳酸菌迅速控制发酵过程，并且在发酵过程中稳定存在。发酵lOd后，得到用于制备秸秆饲料的固体发酵菌剂。2、用于制备秸秆饲料的发酵菌剂的发酵效果实验将50g上述步骤1获得的用于制备秸秆饲料的固体发酵菌剂分别接种到1000g玉米秸秆或1000g稻杆中，常温发酵30d后，测定发酵料的pH值和乳酸的含量，同时以未接种秸秆饲料发酵菌剂的玉米秸秆和稻杆作为对照。实验设三次重复，结果表明，接种秸秆饲料发酵菌剂的玉米秸秆发酵料比未接种秸秆饲料发酵菌剂的玉米秸秆的pH值降低7.36%±0.53%，乳酸含量提高了174.79%±3.65X;接种秸秆饲料发酵菌剂的稻杆发酵料比未接种秸秆饲料发酵菌剂的稻杆的pH值降低7.5%±0.65%，乳酸含量提高了139.49%±2.95%，玉米秸秆发酵料和稻杆发酵料的品质得到了明显改善。实施例3、用于制备秸秆饲料的发酵菌剂的制备发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)JCM1173T和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)JCM1149T均购自日本微生物保存中心，类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)N服C15889购自日本技术评价研究所生物资源中心。1、用于制备秸秆饲料的发酵菌剂的制备将发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)JCM1173T、植物乳杆菌(bactobacillusplantarum)JCM1149T禾口类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)NBRC15889分别接种到MRS-S培养基中，3(TC静置培养72h，将18ml上述发酵乳杆菌6(Lactobacillusfermentum)JCM1173T的发酵液、4ml上述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)JCM1149T的发酵液禾口lml上述类干酷乳杆菌(Lactobacillusparacasei)NBRC15889的发酵液混合，使混合发酵液中，发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)JCM1173T、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)JCM1149T和类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)NBRC15889的集落形成单位数目比为18:4:l，该混合发酵液中的集落形成单位数目为1X108CFU/ml。将上述混合发酵液、甘油和EDTA按照lX103ml:lg:lg的配比混合，得到秸秆饲料的液体发酵菌剂。将上述获得的秸秆饲料的液体发酵菌剂和玉米秸秆按照lml:100g的配比混合，发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)JCM1173T、植物乳杆菌(Lactobacillusplanta進)JCM1149T禾口类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)NBRC15889在25-3(TC条件下厌氧发酵2d，乳酸菌大量繁殖，产生大量乳酸，发酵料的pH值迅速降低。利用分子生态学技术一变性梯度凝胶电泳法(DGGE)证明，在发酵料中，以发酵乳杆菌(Lactabacillusfermentum)JCM1173T为主的乳酸菌迅速控制发酵过程，并且在发酵过程中稳定存在。发酵lOd后，得到用于制备秸秆饲料的固体发酵菌剂。2、用于制备秸秆饲料的发酵菌剂的发酵效果实验将50g上述步骤1获得的用于制备秸秆饲料的固体发酵菌剂分别接种到1000g玉米秸秆或1000g稻杆中，常温发酵30d后，测定发酵料的pH值和乳酸的含量，同时以未接种秸秆饲料发酵菌剂的玉米秸秆和稻杆作为对照。实验设三次重复，结果表明，接种秸秆饲料发酵菌剂的玉米秸秆发酵料比未接种秸秆饲料发酵菌剂的玉米秸秆的pH值降低7.14%±0.57%，乳酸含量提高了172.68%±3.43X;接种秸秆饲料发酵菌剂的稻杆发酵料比未接种秸秆饲料发酵菌剂的稻杆的pH值降低7.4%±0.58%，乳酸含量提高了138.59%±2.79%，玉米秸秆发酵料和稻杆发酵料的品质得到了明显改善。实施例4、用于制备秸秆饲料的发酵菌剂的制备发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)JCM1173T和植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)JCM1149T均购自日本微生物保存中心，类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)N服C15889购自日本技术评价研究所生物资源中心。1、用于制备秸秆饲料的发酵菌剂的制备将发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)JCM1173T、植物乳杆菌(bactobacillusplantarum)JCM1149T禾口类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)NBRC15889分别接种到MRS-S培养基中，30°C静置培养72h，将20ml上述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)JCM1173T的发酵液、6ml上述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)JCM1149T的发酵液禾口lml上述类干酷乳杆菌(Lactobacillusparacasei)NBRC15889的发酵液混合，使混合发酵液中，发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)JCM1173T、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)JCM1149T和类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)NBRC15889的集落形成单位数目比为20:6:l，该混合发酵液中的集落形成单位数目为1X108CFU/ml。将上述混合发酵液、甘油和EDTA按照lX103ml:5g:2g的配比混合，得到秸秆饲料的液体发酵菌剂。将上述获得的秸秆饲料的液体发酵菌剂和玉米秸秆按照lml:lOOOg的配比混合，发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)JCM1173T、植物乳杆菌(Lactobacillusplanta進)JCM1149T禾口类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)NBRC15889在25-3(TC条件下厌氧发酵2d，乳酸菌大量繁殖，产生大量乳酸，发酵料的pH值迅速降低。利用分子生态学技术一变性梯度凝胶电泳法(DGGE)证明，在发酵料中，以发酵乳杆菌(Lactabacillusfermentum)JCM1173T为主的乳酸菌迅速控制发酵过程，并且在发酵过程中稳定存在。发酵lOd后，得到用于制备秸秆饲料的固体发酵菌剂。2、用于制备秸秆饲料的发酵菌剂的发酵效果实验将50g上述步骤1获得的用于制备秸秆饲料的固体发酵菌剂分别接种到1000g玉米秸秆或lOOOg稻杆中，常温发酵30d后，测定发酵料的pH值和乳酸的含量，同时以未接种秸秆饲料发酵菌剂的玉米秸秆和稻杆作为对照。实验设三次重复，结果表明，接种秸秆饲料发酵菌剂的玉米秸秆发酵料比未接种秸秆饲料发酵菌剂的玉米秸秆的pH值降低7.28%±0.54%，乳酸含量提高了173.89%±3.85X;接种秸秆饲料发酵菌剂的稻杆发酵料比未接种秸秆饲料发酵菌剂的稻杆的pH值降低7.3%±0.96%，乳酸含量提高了138.79%±2.85%，玉米秸秆发酵料和稻杆发酵料的品质得到了明显改善。权利要求一种用于制备秸秆饲料的发酵菌剂，它的活性成分包括发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)。2.根据权利要求1所述的菌齐U，其特征在于所述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)禾口类干酷乳杆菌(Lactobacillusparacasei)的集落形成单位数目比为(18-20):(4-6):1。3.根据权利要求2所述的菌齐U，其特征在于所述发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)禾口类干酷乳杆菌(Lactobacillusparacasei)的集落形成单位数目比为19:5:1。4.根据权利要求1-3中任一所述的菌齐U，其特征在于所述发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum)为发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum)JCM1173T，所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)JCM1149T，所述类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)为类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)NBRC15889。5.根据权利要求1-4中任一所述的菌剂，其特征在于所述菌剂中包括甘油和EDTA。6.根据权利要求5所述的菌剂，其特征在于所述活性成分、甘油和EDTA的配比为1X10"CFU:(1-5)g甘油(l-2)gEDTA，优选为1X10"CFU:5g甘油lgEDTA。7.根据权利要求6所述的菌剂，其特征在于所述菌剂中包括吸附载体，所述吸附载体为麦饭石和/或秸秆粉。8.根据权利要求7所述的菌剂，其特征在于所述活性成分和所述吸附载体的配比为ixio6cfu:(1-10)g吸附载体，具体为ixio6cfu:5g吸附载体。9.根据权利要求1-8中任一所述的菌齐U，其特征在于所述发酵乳杆菌Lactobacillusfermentum)JCM1173t、所述植物乳杆菌Lactobacillusplantarum)JCM1149T和所述类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)NBRC15889分别独立包装或混合在一起。10.权利要求1-9中任一所述的发酵菌剂在制备秸秆饲料中的应用。全文摘要本发明公开了一种用于制备秸秆饲料的发酵菌剂。它的活性成分包括发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)和类干酪乳杆菌(Lactobacillusparacasei)。本发明的用于制备秸秆饲料的发酵菌剂中的各种乳酸菌具有高度的协同作用，自体形成稳定的生态系统，能在未经灭菌的天然原料中快速繁殖、定殖而占据优势，迅速产生大量乳酸，降低发酵料的pH值，改善饲料的发酵品质，提高饲料的营养价值和适口性，对饲喂的动物安全，且应用简易，成本低廉。文档编号A23K1/14GK101735963SQ200810226318公开日2010年6月16日申请日期2008年11月12日优先权日2008年11月12日发明者崔宗均,王小芬,高丽娟申请人:中国农业大学