专利名称：突触核蛋白病的治疗的制作方法
技术领域：
本发明一般地涉及治疗受试者中不是溶酶体贮积病的突触核蛋白病 (sy皿cleinopathy)，以及相关的筛选方法。
背景 遗传学的、神经病理的和生物化学的证据已经暗示了在几种神经变性病症，包括 帕金森病(PD)、Lewy体痴呆(DLB)等的发展中a-突触核蛋白(a S)的提高的稳态丰 度以及异常的加工(Dawson等，(2003) Science 302， 819-22 ;Vila等，(2004)Nat Med.， IOS聊I :S58-62)。 遗传学的证据展现了，在a-突触核蛋白编码基因中的点突变与伴有早期发作 的PD的严重的、主要遗传的形式有联系(K潔ger等，(1997)Nat. Genet. ， 18， 106-108 ; Zarranz等，(2004) Arm. Neurol， 55 (2) : 164-73 ;Polymeropoulos等，(1997) Science, 276 : 2045-7)，暗示了"功能的毒性增益"发病机理。这些突变引起了以下的氨基酸变化丙氨酸 30—脯氨酸(A30P)、谷氨酰胺46—赖氨酸(E46K)和丙氨酸53—苏氨酸(A53T)。此外，双份 和三份的编码a-突触核蛋白的突触核蛋白a (淀粉样前体的非A4成分)基因(SNCA)已 经与具有组合的PD/DLB表型的家族性帕金森氏综合征有联系，其展现了即使野生型(wt) 基因的提高的表达率也可能引起疾病(Chartier-Harlin等，(2004) Lancet, 364， 1167-9 ; Singleton等，(2003) Science, 302， 841)。引起兴趣地，SNCA基因的启动子区域内的某些 多态性还与散发性、晚期发作的PD的提高的风险相联系(Pals等，(2004)A皿.Neuro1，56， 591-5 ;Maraganore等，(2006) JAMA， 296， 661-70)。 神经病理学证据表明，代表了在尸检中所见的PD和DLB的病理学标志物之一 的、称为Lewy体和Lewy轴突的神经元内包含物，含有高水平的聚集的a -突触核蛋白 蛋白质(Spillantini等，(1998)Proc. Natl. Acad. Sci， U. S. A. ，95,6469—73 ;Baba等， (1998)Am. J. Pathol，152，879-884)。这些聚集物一般被视为细胞错误处理a -突触核蛋 白蛋白质(可能与翻译后事件相关，例如超磷酸化(Anderson等，(2006)， J. Biol. Chem.， 281,29739-29752)，以及作为可溶的有毒寡聚物和不溶的纤丝的细胞内积累(Sharon等， (2001)，P. N. A. S. ，98,9110-9115)的结果。 此外，生物化学的证据表明，在细胞或动物系统中a-突触核蛋白的过量表达可 能引起细胞的应激和/或最后通过各种机制的死亡，包括，尤其是，过度的多巴胺浓度和 反应性氧种类的产生(Tabner等，(2002)， Free Radic. Biol. Med. ，32(11) :1076-83 ;Fahn 等，(1992) ， Ann. Neurol， 32， 804-12)，以及线粒体功能障碍(Lee (2003) ， Antioxid. Redox Signal, 5 :337-48 ;HaShimoto等，(2003) ，Neuromolecular Med. ，4(1-2) :21-36)等等。公 开的PCR专利申请W007084737公开了治疗具有与溶酶体酶牵连的中枢神经系统的溶酶体 贮积病症。
概述 本发明至少部分地基于发现，S卩，某些试剂，包括酸性P-葡糖脑苷脂酶(GBA)多 肽和蛋白酶的组织蛋白酶家族的选定成员(例如，组织蛋白酶D)可以降低中枢和/或外周
4神经系统的元件内a-突触核蛋白(aS)的细胞内水平。结果，本发明包括，特别地，在不患 有已知的经典溶酶体贮积病症的受试者中治疗突触核蛋白病，例如，原发性突触核蛋白病 的新方法，例如，通过施用非蛋白酶型溶酶体酶多肽，例如，脂质代谢酶，例如GBA多肽，或 编码GBA多肽的核酸分子，或活化GBA活性的试剂，或具有a-突触核蛋白降低活性("突 触核蛋白酶"活性)的蛋白酶型溶酶体酶。 —般地，蛋白酶型溶酶体酶属于天冬氨酰蛋白酶(例如组织蛋白酶D或组织蛋白 酶E)和半胱氨酰蛋白酶(例如，组织蛋白酶F和组织蛋白酶L)的类别。因此，本发明还包 括，特别地，用蛋白酶型溶酶体酶以及组织蛋白酶原(procath印sin)D、E、F和L多肽，或编 码组织蛋白酶D、E、F或L的核酸分子，或编码它们的蛋白原或前蛋白原多肽形式的核酸分 子来治疗突触核蛋白病的新方法。 此夕卜，非蛋白酶，例如，GBA多肽，或蛋白酶，例如组织蛋白酶D多肽，可以与提高或 诱导自体吞噬的试剂，例如雷帕霉素或雷帕霉素类似物共同施用。 此外，考虑到皂化蛋白原(prosaposin， PS)和它的衍生物，皂化蛋白A(saposin A， SA)、皂化蛋白B(SB)、皂化蛋白C(SC)和皂化蛋白D(SD)作为GBA的体内活性中的辅助 因子起到的关键作用，其他治疗方法包括与GBA活化多肽，例如PS多肽和/或SC多肽一起 施用GBA多肽；或单独施用PS多肽和/或SC多肽(来活化或提高内源GBA)来促进体内 a _突触核蛋白稳态蛋白水平的降低。 —般地，本发明的特征在于治疗患有突触核蛋白病，例如原发或继发的突触核蛋 白病，而不患有临床上诊断的、或不患有临床上可诊断的溶酶体贮积病的受试者，例如人类 或动物，例如驯养的动物，例如，犬、猫、马、山羊、奶牛和猪的方法。这些方法包括以有效降 低受试者的中枢或外周神经系统中、或这两者中、或受试者的溶酶体区室中的a-突触核 蛋白水平的数量向受试者施用一种或更多种以下的溶酶体酶多肽(例如，非蛋白酶型多 肽，例如GBA，或蛋白酶型酶多肽，例如，组织蛋白酶D)、编码一种或更多种溶酶体酶多肽的 多核苷酸、溶酶体酶活化试剂、编码溶酶体酶活化试剂的多核苷酸。 突触核蛋白病可以是一种或更多种以下的帕金森氏病(PD);散发的或可遗传的 Lewy体痴呆(DLB);伴有突触核蛋白沉积的纯自主神经衰竭(pure autonomic failure) (PAF);多系统萎縮症(MSA);伴有脑部铁积累的遗传性神经变性；和老年的偶发的Lewy体 疾病。在其他实施方式中，所述突触核蛋白病可以是一种或更多种以下的Lewy体变体 的阿尔茨海默氏病；Down' s综合征；进行性核上麻痹；Lewy体特发性震颤(essential tremor with Lewy bodies);有或者没有痴呆的家族性帕金森氏综合征；有或者没有帕金 森氏综合征的tau基因和progranulin基因关联的痴呆；克-雅病(Creutzfeldt Jakob disease);牛海绵状脑病；继发性的帕金森病；由神经毒素暴露引起的帕金森氏综合征；伴 有a-突触核蛋白沉积的药物诱发的帕金森氏综合征；散发的或可遗传的脊髓小脑性共济 失调；肌萎縮性侧索硬化(ALS);和自发性的快速眼动睡眠行为失常。 在这些方法中，蛋白酶型溶酶体酶可以是天冬氨酰蛋白酶多肽，例如组织蛋白酶D 多肽、组织蛋白酶原D多肽、组织蛋白酶E多肽和组织蛋白酶原E多肽，或半胱氨酰蛋白酶 多肽，例如组织蛋白酶F多肽、组织蛋白酶原F多肽、组织蛋白酶L多肽和组织蛋白酶原L 多肽。 在某些实施方式中，溶酶体酶活化试剂是或者包括GBA多肽活化试剂，例如isofagomine(IFG)、或活化多肽，例如皂化蛋白原(prosaposin)多肽、皂化蛋白(saposin) A多肽、皂化蛋白B多肽、皂化蛋白C多肽和皂化蛋白D多肽的一种或更多种。当然，也可以 使用编码皂化蛋白原多肽、皂化蛋白A多肽、皂化蛋白B多肽、皂化蛋白C多肽和皂化蛋白 D多肽的任何一种或更多种的多核苷酸。 在另一个方面，本发明特征在于通过进一步施用一种或更多种提高a-突触核蛋 白的自体吞噬的试剂来治疗在此描述的突触核蛋白病的方法。例如，所述试剂可以是或者 包括mTOR抑制物、雷帕霉素、雷帕霉素类似物、依维莫司(everolimus)、环孢菌素、FK506、 hsc70、N-辛基-4-印i-P-井冈霉烯胺(valienamine)或甘油。 在此处描述的方法中，所述试剂可以是小分子、大分子、肽、抗体、核酸或其生物学 活性片段。 在另一个方面，本发明包括在此描述的溶酶体酶多肽、编码一种或更多种溶酶体
酶多肽的多核苷酸、溶酶体酶活化试剂和编码溶酶体酶活化试剂的多核苷酸中的一种或更
多种，在利用公知的制造方法制备用于治疗突触核蛋白病的药物的方法中的用途。"多肽"是指氨基酸的任何链，不考虑长度或翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸
化)，因而包括蛋白质、多肽和肽。"基本上纯的多肽"是指已经从体内伴随它的成分中分离的多肽。当多肽按重量计 算至少60%没有与之天然相关的蛋白质和天然存在的有机分子，多肽是基本上纯的。优选 的，所述制品是按重量计算至少75%，更优选的至少90%，最优选的至少99%的所述期望 的多肽。 "GBA多肽"是任何GBA蛋白质或多肽，其在此处描述的多巴胺能细胞模型中降低 a S水平方面具有相应野生型GBA的生物学活性的至少百分之50。"组织蛋白酶多肽"，例如组织蛋白酶D多肽，是任何组织蛋白酶蛋白或多肽，其在 此处描述的多巴胺能细胞模型中降低aS水平方面具有相应野生型组织蛋白酶的生物学 活性的至少百分之50。 如在此使用的，"a-突触核蛋白"蛋白或多肽(aS或aS蛋白质)包括单个的、 单体的蛋白质或多肽，以及所述aS蛋白或多肽的以下形式寡聚体形式，例如，二聚体或 三聚体的形式，或脂质相关复合物的形式，或无脂质的形式，或聚集物的形式，任何这些形 式可以是可溶的或不溶的。该术语还包括在与其他分子的复合物中存在的aS蛋白质。
在另一个方面，本发明特征在于鉴定用于治疗突触核蛋白病的候选化合物的方 法，包括(a)获得模型系统，例如，细胞系统，例如，多巴胺能细胞模型，例如在此描述的，便 于a -突触核蛋白复合物的定量；(b)用测试化合物接触所述模型系统来孵育；和(c)比较 在存在和不存在所述测试化合物的情况下a-突触核蛋白的水平；其中在存在测试化合物 的情况下a-突触核蛋白复合物的水平的降低表明所述测试化合物是用于治疗突触核蛋 白病的候选化合物。在某些实施方式中，a-突触核蛋白蛋白质的精确定量通过采用夹层 式、特异性和敏感性的ELISA，例如在此描述的，来实现。a-突触核蛋白模型系统可以是， 例如，表达蛋白质的细胞和/或动物模型。 本发明还特征在于治疗突触核蛋白病的方法，其中通过用蛋白质、肽序 列、酶、抗体、天然脂质、半合成脂质和合成脂质以及其衍生物靶向葡萄糖神经酰胺 (glucosylceramide)和含糖基神经酰胺(glycosylceramide)的鞘糖脂来降低神经和非神
6经细胞内葡萄糖神经酰胺和含有葡萄糖神经酰胺的鞘糖脂的数量或浓度。例如，神经和非 神经细胞内葡萄糖神经酰胺和含有糖基神经酰胺的鞘糖脂的数量或浓度可以通过葡萄糖 神经酰胺和含有葡萄糖神经酰胺的鞘糖脂的酶学或非酶学水解来降低。这些方法可以通过 有结合能力的、但无催化活性的、处于野生型形式或处于突变形式的GBA来催化。在这些方 法中，也可以施用皂化蛋白原和/或它的衍生物，例如在此描述的皂化蛋白C。在某些实施 方式中，期望的蛋白质或多肽，例如GBA，通过表达编码所述酶或其衍生物的多核苷酸来获 得。 在这些方法中，所述试剂，例如皂化蛋白原、皂化蛋白A、皂化蛋白B、皂化蛋白C、 皂化蛋白D、由其衍生的肽、小分子或大分子、抗体、抗体的片段、或改善GBA的天然生物学 功能的小的或大的多核苷酸，例如，GBA活化试剂，被以有效降低aS蛋白质水平的数量递 送到中枢和/或外周神经系统。 除非另外定义，此处使用的所有技术和科学术语具有本发明所属技术领域的普通 技术人员通常所理解的相同含义。虽然类似于或等同于在此描述的那些的方法和材料可以 被用于本发明的实践和测试，以下描述了适合的方法和材料。在此提及的所有公开物、专利 申请、专利和其他参考文献通过引用将它们完整地合并。在冲突的情况下，当前的说明书， 包括定义，是支配性的。此外，材料、方法和实施例仅是说明性的，而不意图是限制性的。
根据以下的详细说明和根据权利要求，本发明的其他特征和益处将是明显的。
附图的简要描述 附
图1是Western印迹的呈现，展现了在体外人类脑神经节苷脂和a -突触核蛋 白之间稳定的19-20kDa复合物(aS/G)的时间依赖性形成。 附图2A是在用指定水平的a -突触核蛋白cDNA质粒瞬时转染的MES23. 5细胞中 表达的a -突触核蛋白蛋白质的Western印迹的呈现。 附图2B是Western印迹的呈现，表明GBA cDNA转染、+/-皂化蛋白原cDNA转染 对MES23.5-syn细胞中细胞内a -突触核蛋白蛋白质水平的影响。后者蛋白质的水平在 Western印迹的下部画面中显示。 附图2C是ELISA测量的柱形图，表明在存在或缺乏皂化蛋白原的情况下，取决于 共转染的GBA DNA的数量，在MES-syn细胞中检测的细胞内a -突触核蛋白蛋白质水平。
附图3A是夹心ELISA的性能的图形，如通过0D吸光度读取(Y轴)所监测的，其 特异性地检测重组a-突触核蛋白蛋白质的提高的量(X轴)。 附图3B是ELISA测量的柱形图，表明在存在被转染到这些细胞中的提高数量的 SNCA (突触核蛋白，a (淀粉样前体的非A4成分))cDNA (X轴)的情况下，在MES23. 5-syn 细胞中检测到的细胞内a-突触核蛋白蛋白质水平，其中溶胞产物以连续方式从l比200 稀释到1比4， 000。 附图3C是通过夹心ELISA测量的、作为从附图3A和附图3B获得的数据内插的， 在给定数量的转染的SCNA cDNA之后细胞内a-突触核蛋白蛋白质的浓度的回归分析。
附图3D是显示在转染24小时之后，确认表达a -突触核蛋白蛋白质的MES-syn 细胞的完全细胞生存力的乳酸脱氢酶(LDH)和MTT分析的结果。 附图4是来自五个独立实验的夹心ELISA结果的呈现，其表明在突变GBA多肽的 表达之后，在MES23. 5细胞中细胞内a -突触核蛋白蛋白质水平方面百分之20到> 270的
7提高，所述突变GBA多肽带有近来与帕金森疾病和Lewy体痴呆相联系的几种错义突变之 一，或带有对GBA活性位点有害的突变。a -突触核蛋白蛋白质水平按照与没有异常GBA、 但仅空载体cDNA转染的MES-syn细胞的浓度相关地表示。 附图5，当在MES23. 5-syn细胞(MES-a S)中共同表达时，人类组织蛋白酶D的人
类和大鼠a -突触核蛋白蛋白质水平降低活性的夹心ELISA测量的柱形图。 附图6是Western印迹的呈现，表明了当在MES23. 5_syn细胞(MES-a S)中共同
表达时，人类组织蛋白酶D的剂量依赖性a-突触核蛋白蛋白质水平降低活性。 附图7是当在MES23. 5-syn细胞(MES-a S)中共同表达时，组织蛋白酶D的人类
a-突触核蛋白蛋白质水平降低活性的夹心ELISA测量的柱形图。注意，野生型a-突触
核蛋白蛋白质可以被组织蛋白酶D以及几种突变的a-突触核蛋白同种型降低，所述突变
的a-突触核蛋白同种型带有错义突变，早先已经与家族形式的疾病和尸检确认的帕金森
病相联系。 详细说明 —般地，本发明涉及降低人类或动物受试者的细胞中aS水平的方法，所述受试 者患有不是溶酶体贮积病症的突触核蛋白病，例如，患有原发(或不变)突触核蛋白病的受 试者。这些方法包括，例如，施用非蛋白酶型溶酶体酶多肽，例如GBA多肽，或蛋白酶型溶酶 体酶多肽，例如组织蛋白酶D多肽，或编码这些多肽的核酸分子，单独地或与提高或诱导自 体吞噬的试剂如雷帕霉素或雷帕霉素类似物组合地施用。此外，GBA活化试剂，例如皂化蛋 白原多肽和/或皂化蛋白C多肽，可以被施用，或者皂化蛋白原多肽和/或皂化蛋白C多肽 可以单独地施用(来提高内源GBA活性的活化)来促进体内aS稳态蛋白质水平的降低。
因而，本发明涉及通过提高溶酶体和/或细胞质内的加工，在某些实施方式中，通 过提高由溶酶体摄取(自体吞噬)的aS的数量，来调节a-突触核蛋白(aS)的生理学 降解。虽然不希望受到任何工作原理的限制，aS聚集物的降解加工是稳态水平下的系统 功能。通过将质量作用的法则用于aS蛋白质、寡聚形式、聚集物和/或复合物的稳态降解 加工，人们可以通过提高它的离析物的丰度来调节朝向它的终产物的降解加工。通过改变 途径的成分反应，人们可以将总体加工朝向更高的产物水平推动。因而，通过提高aS向溶 酶体中的输入，或增强它本身的降解效率，人们可以将aS的水解作用和后续加工向更高 的产物水平推动。提高途径的自体吞噬成分和溶酶体成分可以产生对aS蛋白质损伤的提 高的保护，这样的组合可以实现超过叠加(additive)的效应。 在此描述的某些实施方式是治疗或延迟不是溶酶体贮积病的突触核蛋白病病症 的进行或发展的方法，例如，通过施用提高GBA和/或皂化蛋白原/皂化蛋白C的活性或水 平的单种或复数种试剂。在某些实施方式中，所述试剂可以是GBA和/或皂化蛋白原/皂 化蛋白C多肽或其活性片段，或编码这些多肽或活性片段的核酸。在某些实施方式中，所述 试剂是GBA的有结合能力的、但无催化活性的形式，或是编码它们的核酸分子。
在此描述的其他实施方式是治疗或延迟突触核蛋白病病症的进行或发展的方法， 例如，通过施用提高组织蛋白酶D或组织蛋白酶F和/或前组织蛋白酶原D或前组织蛋白 酶原F的活性或水平的单种或复数种试剂。在某些实施方式中，所述试剂可以是GBA和/ 或皂化蛋白原/皂化蛋白C/组织蛋白酶D/组织蛋白酶F多肽或其活性片段，或编码这些 多肽或活性片段的核酸。在某些实施方式中，所述试剂是GBA、组织蛋白酶D或组织蛋白酶
8F的有结合能力的、但无催化活性的形式，或是编码它们的核酸分子。
治疗突触核蛋白病病症的方法 术语突触核蛋白病在此使用来命名一组神经变性病症，其特征是在神经元和神经 胶质的选定群体的细胞区室内a-突触核蛋白(aS)的可溶的非纤丝变体、可溶的寡聚同 种型、不溶的非纤丝变体、复合物、和不溶的纤丝聚集物的任何一种或更多种的提高的水 平，例如，稳态水平的存在。因而，aS稳态水平被理解为涵盖SNCA基因产物的所有可溶的 以及不溶的和中间的(亚稳态)形式。 这些病症包括分组为"不变的"(或"原发的")突触核蛋白病的任何一种下列病 症(Schlossmacher MG. a-sy皿clein andsy皿cleinopathies. The DementiaS 2Blue Books of Practical Neurology ;Editors :Growdon JH & Rossor MN. Butterworth Heinema皿， Inc. ， Oxford. 2007 ;Ch即ter 8 :pp 184-213):帕金森氏病(PD)，例如，散发的帕金森病/ 帕金森氏综合征和家族性的帕金森病/帕金森氏综合征；散发的或可遗传的Lewy体痴呆 (DLB) (aka弥漫性的Lewy体疾病)；具有突触核蛋白沉积的纯自主神经衰竭(PAF);多系统 萎縮症(MSA)(小脑的、帕金森病的、或混合型)；具有脑部铁积累的遗传的神经变性(aka， 哈-斯病(Hallervordern Spatz disease)，或泛酸激酶2_关联的神经变性)；和老年偶发 的Lewy体疾病。 此外，"可变的"(或"继发性的")突触核蛋白病已经被鉴定，其中a-突触核蛋 白新陈代谢的失调被认为是继发性的事件(考虑到神经系统中蛋白质的丰度)，尽管如此 其对原发疾病的进程、外显率、发作年龄、严重度和表现度有显著贡献。可变突触核蛋白 病的病症(Schlossmacher MG. a-sy皿clein and sy皿cleinopathies. The DementiaS2 Blue Books of Practical Neurology ;Editors :Growdon JH & Rossor MN. Butterworth Hei固a皿，Inc. ， Oxford. 2007 ;Chapter 8 :pp 184-213)包括但不限于，Lewy体变体的阿 尔茨海默氏病；Down' s综合征；进行性的核上麻痹；Lewy体特发震颤；由突变的基因和尚 未鉴定基因突变的基因座引起的、有或者没有痴呆的家族性的帕金森氏综合征；克-雅病 和相关的朊病毒疾病，例如牛海绵状脑病(疯牛病)；继发性的帕金森病/由神经毒素暴露 引起的帕金森氏综合征/伴有a-突触核蛋白沉积的药物诱发的帕金森氏综合征；散发的 或可遗传的脊髓小脑性共济失调；肌萎縮性侧索硬化(ALS);自发性的快速眼动睡眠行为 失常；和在哺乳动物中伴随原发性疾病过程的与中枢和/或外周a-突触核蛋白积累相关 的其他状况。 临床上，所有这些相关的病症特征在于运动、认知、行为和/或自主神经机能的慢 性的和进行性的下降，取决于a-突触核蛋白异常的分布。 突触核蛋白病可能或可能不与疾病症状相关联。还可能也是正常老化的产物。例 如，超过55、60、65、70、75或80岁的人可能积累这样的a S蛋白质，例如以聚集物的形式， 而没有与病理、症状或疾病状态的明显相关。这种状况被称为偶发的Lewy体疾病(参见上 文)，具有这种状况的人被认为处于PD/帕金森氏综合征的更高风险中。
—般地，患有在此预期的突触核蛋白病类型的受试者不患有临床上诊断的(或不 患有临床上可诊断的)原发的溶酶体贮积病症(LSD)，例如高歇病(Gaucher disease)或 泰-萨病(Tay-Sachs disease);这些LSD综合征常常展现常染色体隐性遗传模式。然而， 在此外与经典的LSD表型相关的基因中具有单个等位基因突变的受试者可能也发展突触核蛋白病，并遭受其结果(例如，PD/帕金森氏综合征或Lewy体痴呆)，但没有全身性LSD 的证据(Eblan等，N. Engl. J. Med. ， 2005)。 LSD是一类代谢病症，包括超过四十种遗传性病症，其中许多涉及各种溶酶体水解 酶中的遗传缺陷，其普遍由编码溶酶体酶的基因的两个等位基因中的突变引起丄SD的标志 性特征是所讨论的溶酶体水解酶的酶活性方面90% (或更高)的损失，产生的溶酶体内代 谢物的异常积累，其导致核周体中大量的扩大的溶酶体的形成。 在此描述的方法可以用于治疗所有患有原发或继发性的突触核蛋白病的人，包括 在他们的溶酶体酶基因，例如GBA基因中没有突变的那些(即，没有已知的单个基因异常的 散发的帕金森病患者)。这些是其中老化/毒性损伤/头部外伤/修饰基因的影响或其他 未知原因可能一起引起或促成疾病的患者(Klein and Schlossmacher， Neurology, 2007， 69(22) :2093-104)。 在此描述的新的方法还可以用于治疗在一种或更多种溶酶体酶基因，例如在GBA 基因中具有杂合的(即，单个等位基因而不是两个等位基因)突变的突触核蛋白病患者的 亚群。这些受试者不患有典型的LSD (因为他们不具有百分之90或更多的酶缺失，因为他们 仍然从残余的健康等位基因表达足够的GBA)，但是他们常常患有原发的突触核蛋白病。当 前可获得的数据表明，这种在GBA中的杂合突变充当了帕金森病(和相关病症)的风险因 素，充当了在神经系统中发展原发突触核蛋白病的风险等位基因(Clark等.，Neurology, 2007,69(12) :1270-7)。引起兴趣地，如果GBA基因的两个拷贝(等位基因)都被突变(例 如，在GBA的N370S、L444P、K198T和R329C变体的载体中)，具有经典LSD特征的高歇病的 患者亚群将发展继发性的突触核蛋白病(Lwin等，Mol. Genet. Metab. ，2004,81(1) :70-3)。
特别是，所述治疗可以预防性地施用给那些人，他们被基因分型为已知的GBA突 变(例如，他们由于高歇病的家族史已经被基因分型)来预防帕金森病的发展，或在已经发 展突触核蛋白病病症、具有已知的GBA突变的那些人中治疗性地施用。因而，为溶酶体酶基 因例如GBA基因中的突变将受试者或患者基因分型的步骤，可以是在此描述的治疗方法中 的第一步骤。对于突变是杂合子的患者是所述新方法的治疗的候选人。
施用或活化非蛋白酶型溶酶体酶多肽 所述新方法包括向需要其的患者，例如在已经诊断为患有非溶酶体贮积病症的突 触核蛋白病的受试者中，直接地或通过施用编码GBA多肽的核酸分子施用非蛋白酶型溶酶 体酶多肽，例如GBA多肽。
GBA被称为葡糖苷酶，13 ，酸；酸性13 _葡糖苷酶；酸性P -葡糖苷酶；葡糖脑苷
脂酶；葡糖神经酰胺酶；和GBAP。该基因正常地编码溶酶体膜蛋白质，其裂解糖基神经酰 胺(也称为葡糖脑苷脂)，一种糖脂新陈代谢中的中间物，的P-糖苷键。它还可以裂解作 为第二底物的葡萄糖基鞘氨醇来产生葡萄糖和鞘氨醇(Sidransky， Mol GenetMet， 2004， pp6-15)。这个基因中的突变可以引起高歇病，一种特征为葡萄糖脑苷脂和葡萄糖基鞘氨 醇的积累的溶酶体贮积病。选择性剪接产生了编码所述蛋白质的多种转录产物变体。存 在着五种mRNA变体(它们在5' UTR中不同)，它们中最长的在GenBank数据库登记号 Nos. NM_001005749. 1 (mRNA)和NP_001005749. 1 (氨基酸)中列出。关于GBA的信息可以在 Entrez Gene数据库中GeneID :2629中找至U。 所述方法还可以包括通过施用GBA活化多肽，例如皂化蛋白原(PS)和/或它的衍
10生物、皂化蛋白A(SA)、皂化蛋白B(SB)、皂化蛋白C(SC)和皂化蛋白D(SD)来提高所施用的 GBA多肽或任何内源GBA的活化。 皂化蛋白原基因编码高度保守的糖蛋白，其作为具有神经营养活性的全长蛋白质 分泌，或在内涵体/溶酶体区室中由组织蛋白酶D和其他蛋白酶蛋白水解加工成4种皂化 蛋白A、 B、 C和D (Leonova等 ， J. Biol. Chem， 1996， 271 :17312-17320 ;Hiraiwa等，Arch. Biochem. Biophys. ， 1997,341 :17-24)。皂化蛋白A_D主要定位在溶酶体区室，在此它们促 进具有短寡聚糖基团的鞘糖脂的分解代谢。皂化蛋白C在低pH值条件下将GBA蛋白质锚 定在溶酶体膜的内侧面，因而容许GBA适当地折叠用于正确的底物相互作用(Salvioli等， 2000，FEBS. Lett. 472 :17-21)。此外，皂化蛋白C保护GBA蛋白质免于溶酶体蛋白酶的蛋白 水解降解(Sun等，J. Biol. Chem. ，2003,278 :31918-31923)。这种蛋白质的生物学重要性被 一事实强调了 ，即，在皂化蛋白原基因中的无效突变和/或在基因的皂化蛋白C区域中的点 突变可以导致临床的高歇病，尽管存在野生型GBA(Pamplos等，Acta. Neuropathol. ， 1999， 97 :91-97 ;Tylki-Szymanska，2007， Clin. Genet. ，72 :538-542 ;Rafi等，1993， Somat. Cell Mol. Genet. ， 19 :1-7)。 此外，最常见的GBA突变体N370S的体内低活性可以被认为是由于它不能与皂化 蛋白C和阴离子磷脂相互作用(Salvioli等，Biochem. J. ，2005,390 :95-103)。皂化蛋白原 的选择性剪接产生了编码不同的同种型的多种转录产物变体。皂化蛋白原(变体高歇病和 变体异染性脑白质营养不良)在Entre Gene数据库中以GeneID :5660描述了 。它的同种 型的序列可在GenBank中获得，如下皂化蛋白原同种型a前蛋白原NM_002778. 2 (mRNA) 和NP_002769. l(氨基酸)；皂化蛋白原同种型b前蛋白原NM_001042465. 1 (mRNA)和 NP_001035930. l(氨基酸);和皂化蛋白原同种型c前蛋白原NM_001042466. 1 (氨基酸)和 NP_001035931. 1042465. 1(mRNA)。 GBA多肽和GBA编码核酸分子，以及GBA活化多肽和相应的核酸分子，可以使用已 知的技术施用，包括在此描述的技术。例如，GBA多肽编码核酸分子可以利用在此描述的基 因治疗来施用。 施用蛋白酶型溶酶体酶多肽 在可选择的方法中，被诊断为患有不是LSD的突触核蛋白病的受试者，可以用溶 酶体蛋白酶多肽，例如组织蛋白酶D多肽治疗。这样的蛋白酶可以直接地施用，或通过施用 编码期望的蛋白酶的核酸分子来施用。 —般地，蛋白酶型溶酶体酶属于天冬氨酰蛋白酶，例如组织蛋白酶D(或组织蛋白 酶E)和半胱氨酰蛋白酶(例如，组织蛋白酶F和组织蛋白酶L)的类别。因而，本发明包括， 特别是，用与组织蛋白酶原D或组织蛋白酶原E多肽相关的蛋白酶型溶酶体酶，或作为选择 用与组织蛋白酶原F或组织蛋白酶原L多肽相关的蛋白酶型溶酶体酶，或编码组织蛋白酶 D、组织蛋白酶E、组织蛋白酶F或组织蛋白酶L的核酸分子，或编码它们的前蛋白原多肽形 式的核酸分子，来治疗突触核蛋白病的新的方法。 蛋白酶的组织蛋白酶家族包括大约十二种成员，其通过它们的结构和它们裂解的 蛋白质来区分。大多数成员在溶酶体中存在的低PH值下变得活化。因而，这个家族的活性 几乎完全在那些细胞器中存在。组织蛋白酶D基因(CTSD)编码由二硫化物连接的重链和 轻链的二聚体组成的溶酶体天冬氨酰蛋白酶，所述重链和轻链都由单个蛋白质前体产生。
11作为肽酶C1家族的成员的这种蛋白酶具有类似于、但狭窄于胃蛋白酶A的特异性。人类 基因的序列信息可以在GenBank中作为智人(Homo sapiens)组织蛋白酶D (CTSD) ， mRNA : NM_001909获得。 在组织蛋白酶家族内，仅一种其他的已知成员(除了组织蛋白酶D之外)具有天 冬氨酰蛋白酶活性，它是组织蛋白酶E。它被转录成2种变体。人类变体的序列信息可以在 GenBank中作为智人组织蛋白酶E (CTSE) ， mRNA :NM_001910. 2和NM_148964. 1获得。
在组织蛋白酶家族内，各种其他成员具有半胱氨酸蛋白酶活性，例如组织蛋白酶 C、L、F和W。在这许多半胱氨酸蛋白酶组织蛋白酶中，F和W酶形成独立的亚群，根据它们的 染色体位置、序列同源性和剪接模式(Wex等，1999， Biochem. Biophys. Res. Co匪n. ，259 : 401-407)。组织蛋白酶F在脑以及心脏、骨骼肌和其他组织中表达(Wang等，1998， J. Biol. Chem. ，273 :32000-32008)。在小鼠中组织蛋白酶F基因的敲除导致具有神经胶质增生、神 经元损失和自体荧光微粒的积累的晚期发作的神经疾病(Tang等，2006， Mol. CellBiol， 26 :2309-2316)，其被认为是人类成年人发作的神经元蜡样质脂褐质沉积症的模型。人类基 因的序列信息可以在GenBank中作为智人组织蛋白酶E(CTSE) ， mRNA :NM_003793. 3获得。
组织蛋白酶D或F多肽以及组织蛋白酶D或F编码核酸分子都可以使用已知的技 术，包括在此描述的技术来施用。例如，组织蛋白酶D编码核酸分子可以利用在此描述的基 因治疗来施用。 施用其他溶酶体酶多肽 可以被施用来提高溶酶体内a S的降解加工的其他多肽的实例包括；天冬氨酰氨 基葡糖苷酶；a _半乳糖苷酶A ;棕榈酰蛋白硫酯酶；三肽基肽酶；溶酶体跨膜蛋白质；半 胱氨酸转运蛋白；酸性神经酰胺酶；酸性a-L-岩藻糖苷酶；保护蛋白/组织蛋白酶A;酸 性P _半乳糖苷酶；艾杜糖醛酸_2-硫酸酯酶；a _L_艾杜糖苷酸酶；半乳糖脑苷脂酶、酸 性a _甘露糖苷酶；酸性13 -甘露糖苷酶；芳基硫酸酯酶B ;芳基硫酸酯酶A ;N_乙酰半乳 糖胺_6-硫酸酯；酸性13 -半乳糖苷酶；N-乙酰葡萄糖胺-1-磷酸转移酶；酸性鞘磷脂酶； NPC-1 ; a -葡糖苷酶；|3 -氨基己糖苷酶B ;乙酰肝素N_硫酸酯酶；a -N-乙酰氨基葡糖苷
酶；乙酰-CoA ; a -氨基葡糖苷；N-乙酰葡萄糖胺-6-硫酸酯；a _N_乙酰氨基半乳糖苷酶； a -N-乙酰氨基半乳糖苷酶；a -神经酰胺；|3 -葡糖醛酸酶；P -氨基己糖苷酶A ;葡糖脑苷 脂酶；泛素C-末端水解酶-LI ;和酸性脂肪酶。 所述蛋白质和多肽可以是溶酶体降解酶或促进突触核蛋白或突触核蛋白聚集物 降解的非溶酶体蛋白质。这些蛋白质和它们的编码序列是本领域公知的。 一般地，将使用 蛋白质和它们的编码序列的人类形式，而对于在动物模型中起作用，动物直向同源物可能 是期望的。可以使用一种或更多种这样的酶。
增强和诱导a -突触核蛋白的自体吞噬 在本发明的另一个方面，增强和/或诱导自体吞噬的试剂，例如雷帕霉素或雷帕 霉素类似物与溶酶体酶共同施用来实现大于叠加的治疗效果，所述溶酶体酶例如GBA多 肽、或非GBA型溶酶体蛋白酶，例如，组织蛋白酶D多肽。 自体吞噬是涉及细胞自身的成分通过溶酶体机制的降解的分解代谢过程。它是在 细胞生长、发育和稳态中起到正常作用的紧密调节的过程，帮助维持细胞产物的合成、降解 和随后的再循环之间的平衡。它是饥饿的细胞将营养物从不必要的过程再分配到更关键的过程的主要机制。 存在着各种自体吞噬过程，所有的都共有通过溶酶体的细胞内成分的降解。自体 吞噬的最为公知的机制包括细胞的目标区域周围膜的形成，从细胞质的其余部分分隔出内 容物。产生的泡囊然后与溶酶体融合，随后降解内容物。 自体吞噬可以广泛地分成三种类型巨自体吞噬(macroautophagy)、微自体吞噬 和伴侣蛋白介导的自体吞噬(i)巨自体吞噬涉及自身密封来吞入细胞溶质成分(蛋白质 和/或完整细胞器)的从头形成的膜的形成，其在与溶酶体融合之后降解；(ii)微自体吞 噬是材料向溶酶体内的直接内陷；和(iii)伴侣蛋白介导的自体吞噬(CMA)涉及以特异性 肽序列标记的特定细胞溶质蛋白质的降解。CMA在降解什么方面是高度选择性的，仅降解某 些蛋白质而非细胞器。CMA对组织例如肝脏、肾脏和许多类型的培养细胞中大约30%的细 胞溶质蛋白质的降解负责。 伴侣蛋白分子结合标记的蛋白质，并经由受体复合物转运标记的蛋白质到溶酶 体。在CMA中，仅那些具有共有肽序列的蛋白质得以通过伴侣蛋白的结合被识别。这种CMA 底物/伴侣蛋白复合物然后移动到溶酶体，在此，CMA受体溶酶体相关膜蛋白识别所述复 合物；通过内侧其他蛋白质的帮助，蛋白质被解折叠并转位跨越溶酶体膜。可溶的野生型 a _突触核蛋白已经被报道通过这种机制降解(Cuervo等 (2004) ， Science, 305 :1292)。
自体吞噬是日常的正常细胞生长和发育的一部分，其中雷帕霉素的哺乳动物靶 (mT0R)起到重要的调节作用。饥饿抑制mTOR活性，引起各种细胞反应，包括细胞在早期Gl 阶段的停滞、蛋白质合成的抑制作用、营养物转运蛋白周转、转录改变和自体吞噬。雷帕霉 素是抑制mT0R活性的公知的试剂。本领域已知的任何雷帕霉素类似物或mT0R抑制物可 以用于在此描述的方法。例如，依维莫司、环孢菌素和FK506可以使用，并测试它们的自体 吞噬剌激能力。虽然这样的类似物和抑制物可能不都具有雷帕霉素的自体吞噬剌激活性， 这种活性可以在这些化合物中容易地测定。促进自体吞噬的试剂包括伴侣蛋白蛋白质，和 结合并护送底物到溶酶体的化合物。可以剌激自体吞噬的其他化合物包括hsc70、 N-辛 基-4-印i-e-井冈霉烯胺和甘油。 一种或更多种这样的试剂可以用于在此描述的增强自 体吞噬的方法。 任何促进突触核蛋白的降解或引起突触核蛋白复合物的解聚集作用的溶酶体酶， 单独地或与其他溶酶体酶或试剂组合地，可以用于本发明。
施用方法 —般地，在此描述的方法包括向需要、或被确定需要这样的治疗的受试者施用治 疗有效量的在此描述的治疗化合物。 如在上下文中使用的，"治疗"是指改善突触核蛋白病病症的至少一种症状，和/或 引起受试者中aS蛋白质的水平方面可测量的降低。类似地，施用"治疗有效量"或"有效 量"的在此描述的组合物用于突触核蛋白病的治疗，将产生a S蛋白质的降低的水平，和/ 或引起突触核蛋白病病症的一种或更多种症状的改善。这种数量可以相同或不同于"预防 有效量"，其是抑制，例如预防，疾病或疾病症状的发作所必需的数量。 有效量可以以一次或更多次施用、应用或剂量施用。组合物的治疗有效量取决于 选择的组合物。组合物可以从每天一次或更多次到每周一次或更多次地施用；包括每隔一 天一次。熟练技术人员将理解，某些因素将影响有效地治疗受试者所需的剂量和时机，包括但不限于，疾病或病症的严重度、早先的治疗、受试者的一般健康状态和/或年龄、和存在 的其他疾病。此外，使用治疗有效量的在此描述的组合物治疗受试者可以包括单次治疗或 一系列的治疗。 化合物的剂量、毒性和治疗效力可以被测定，例如，通过细胞培养物或实验动物中 的标准药物学操作，例如，用于测定LD50(对50%的群体致死的剂量)和ED50(对50%的 群体治疗有效的剂量)的那些。在有毒和治疗效果之间的剂量比例是治疗指数，它可以被 表示为LD50/ED50的比例。展现了高治疗指数的化合物是优选的。当使用展现了毒性副作 用的化合物时，应当小心地设计递送系统，所述递送系统将这些化合物靶向受感染组织以 最小化对未感染细胞的潜在损害，从而降低副作用。 从细胞培养分析和动物研究获得的数据可被用于配制用于人类的剂量范围。这些 化合物的剂量优选地处在包括很小或没有毒性的ED50的循环浓度范围内。取决于采用的 剂型和使用的给药途径，剂量可以在这个范围内变动。对于在本发明的方法中使用的任何 化合物，可以最初地从细胞培养分析来估计治疗有效剂量。可以在动物模型中配制剂量来 达到包括在细胞培养中测定的IC50(即，达到症状的半最大抑制的测试化合物的浓度)的 循环血浆浓度范围。这种信息可用于更精确地测定人类中有用的剂量。可以通过例如高效 液相色谱法测定血浆中的水平。
关于剂量的更具体的信息在下文讨论。
多肽和小分子的施用 如果期望，可以全身地施用跨越血脑屏障的试剂。做为选择，试剂例如在此描述 的多肽和小分子，可以直接地递送到其中细胞显示了 aS积累的身体中的位点。不跨越 血脑屏障的试剂可以例如利用通过脑功能区定位(stereotactic)导引来便利化的直接 注射来施用到脑部。这样的试剂还可以经由脑室内的(intraventricular)或实质内的 (intr即arenchymal)途径施用。 在其他实施方式中，编码期望的多肽的核酸分子可以以例如含有多肽编码基因的 病毒载体的形式递送。病毒递送可以在一定条件下，所述条件有利于转基因在特定的中枢 或周围神经细胞中的表达，例如，在脑室衬里的室管膜或其他胶质细胞。室管膜细胞可以被 转导来表达转基因和将编码的蛋白质产物分泌到脑脊液(CSF)中。 在此描述的多肽可以掺入药物组合物中，所述药物组合物对于治疗，例如抑制、减 弱、预防或改善突触核蛋白病是有用的。所述药物组合物可以施用给患有突触核蛋白病病 症的受试者，或处于发展所述缺陷的风险中的人。所述组合物应当含有处在药学上可接受 的载体中的治疗或预防数量的多肽。药物载体可以是任何适合于将多肽递送到患者的相容 的、无毒的物质。无菌水、醇类、脂肪和蜡可以用作载体。药学上可接受的佐剂、缓冲剂、分散 剂等等，也可以掺入到药物组合物中。所述载体可以与适合于通过脑室内注射或输注(所 述形式也可以适合于静脉内或鞘内的施用)，或其它，施用的任何形式的多肽组合。
适合的载体包括，例如，生理盐水、抑菌剂水、Cremophor EL (BASF，
Parsippany， N. J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)、其他盐水溶液、葡萄糖溶液、甘油溶液、水和 油乳剂，例如用石油、动物、植物或合成来源的油制造的那些(花生油、豆油、矿物油或芝麻 油)。在某些实施方式中，人工的CSF被用作载体。 一般地，载体将是无菌的和无热原的。 所述药物组合物中多肽的浓度可以广泛地变化，即，从总成分的按重量计算至少约0. 01%，
14到按重量计算O. 1%、到约1%重量、到多达按重量计算20%或更多。 对于在此描述的多肽或其他试剂的脑室内的施用，所述组合物必需是无菌的并应 当是流体。必须在制造和储存条件下是稳定的，并且必须保存于对抗微生物例如细菌和真 菌的污染作用之下。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟苯甲酸、氯代丁醇、酚、抗 坏血酸、硫柳汞等等，来实现对微生物作用的预防。在很多情况下，有用的是在组合物中包 括等渗试剂，例如，糖类、多元醇如甘露醇、山梨醇和氯化钠。 施用的速率是这样，从而单剂量的施用可以作为快速浓注(bolus)施用。单剂量 也可以在约1-5分钟、约5-10分钟、约10-30分钟、约30-60分钟、约1_4小时内输注，或消 耗超过四、五、六、七或八小时。这可以花费超过1分钟、超过2分钟、超过5分钟、超过10 分钟、超过20分钟、超过30分钟、超过1小时、超过2小时或超过3小时。虽然快速浓注的 脑室内施用是有效的，缓慢的输注是特别有效的。不受任何特定的工作原理的限制，相信的 是，由于CSF的周转(turn-over)，缓慢的输注是有效的。 虽然文献中的估计值和计算值是变化的，CSF被认为在人类中在约4、5、6、7或8小 时内周转。在一个实施方式中，缓慢的输注时间应当被计量，从而它大约等于或大于CSF的 周转时间。周转时间可能取决于受试者的物种、大小和年龄，但是可以使用本领域已知的方 法来测定。输注也可以在一天或更多天的时间内持续。患者可以治疗一个月一次、两次、或 三次或更多次，例如，每周地，例如每两周地。输注可以按照脑部或内脏器官中疾病的底物 的重新积累所指示的，在受试者的生命过程中重复。重新积累可以通过本领域公知的用于 鉴定和量化相关底物的任何技术来测定，所述技术可以对取自脑部和/或来自一种或更多 种内脏器官的一种或更多种样品进行。这样的技术包括酶的分析和/或免疫分析，例如，放 射免疫分析或ELISA。 缓慢的心室内输注提供了在至少脑部中、以及潜在地在内脏器官中，所施用的多 肽(例如，酶)的减低数量的底物。在脑部、肺部、脾脏、肾脏和/或肝脏中积累的底物例如 a S蛋白质的降低可以是显著的。可以实现大于10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、 80%或90%的降低。实现的降低在患者与患者之间，或甚至在单个患者的器官与器官之间 不必然是均匀的。降低可以通过本领域公知的任何技术来测定，例如，通过酶分析和/或免 疫分析技术，如在此其他地方讨论的。 在说明性的实施方式中，施用伴随着所述多肽向受试者或患者的侧脑室的一个或 两个中的输注。通过输注到侧脑室中，所述多肽被递送到脑部中的位点，在其中产生最大数 量的CSF。所述多肽还可以输注到脑部的超过一个脑室中。治疗可以由每个目标位点的单 次输注组成，或可以是重复的。可以使用多个输注/注射位点。例如，多肽所施用的脑室可 以包括侧脑室和第四脑室。在某些实施方式中，除了第一施用位点之外，含有所述多肽的组 合物被施用到另一个位点，所述另一个位点可以是所述第一施用位点的对侧或同侧的。注 射/输注可以是单次或多次，单侧的或双侧的。 为了特异性地将含有所述多肽的溶液或其他组合物递送到中枢神经系统的特 定区域，例如，特定的脑室，例如，脑部的侧脑室或第四脑室，它可以通过脑功能区定位的 (stereotaxic)显微注射来施用。例如，在手术的当天，患者具有固定就位的脑功能区定位 框架基座(旋紧到颅骨上)。具有脑功能区定位框架基座的大脑(与参考(fiduciary)标 记相容的MRI)使用高分辨率MRI成像。MRI图像然后转移到运行脑功能区定位软件的计算机。 一系列冠状的、矢状的和轴向的图像用于确定载体注射的目标位点和轨迹。软件直接 将轨迹转换为适合于脑功能区定位框架的3维坐标。在进入位点上方钻出钻孔，用以给定 的深度插入的针头定位脑功能区定位装置。然后注射药学上可接受的载体中的多肽溶液。 可以使用其他的施用途径，例如，在直接可视化的或其他非脑功能区定位的应用之下的浅 皮层应用。 递送缓慢的输注的一种途径是使用泵。这样的泵是商业上可获得的，例如，来自 Alzet (Cupertino, CA)或Medtronic (Minneapolis, MN)。泵可以是可植入的。施用酶的另 一种方便的途径是使用套管或导管。套管或导管可以用于时间上分开的多次施用。套管和 导管可以脑功能区定位地植入。期待的是，多次施用将用于治疗患有突触核蛋白病病症的 典型患者。导管和泵可以单独地或组合地使用。
核酸分子的施用和基因治疗 在此描述的核酸分子，例如编码GBA或组织蛋白酶D多肽的核酸分子，可以使用多 种不同的方法递送。例如，基因转移可以由DNA病毒载体，例如腺病毒(Ad)或腺病毒相关病 毒(AAV)来介导。载体构建体是指包括病毒基因组或其部分以及转基因的多核苷酸分子。 腺病毒(Ad)是相对良好地表征的、病毒的同源的组，包括超过50种血清型。参见，例如，国 际PCT申请N0.W0 95/27071。 Ad容易生长，不需要整合到宿主细胞基因组中。重组Ad衍
生的载体，特别是降低重组的潜力和野生型病毒的产生的那些，也已经被构建。参见，国际 PCT申请N0.W0 95/00655和W0 95/11984。野生型AAV具有整合到宿主细胞的基因组中的 高感染性和特异性。参见，Hermonat and Muzyczka(1984)Proc. Natl. Acad. Sci. ， USA， 81 : 6466-6470和Lebkowski等 (1988)Mol. Cell. Biol，8 :3988-3996。 递送在此描述的核酸分子的适合的亲神经的(neurotrophic)病毒载体包括，但 不限于，腺相关病毒载体(AAV)、单纯性疱疹病毒载体(美国专利No. 5， 672， 344)和慢病毒 载体。 在新的方法中，可以使用任何血清型或假型的AAV。在本发明的某些实施方式中使 用的病毒载体的血清型选自由AAV1 、 AAV2、 AAV3、 AAV4、 AAV5、 AAV6、 AAV7和AAV8构成的组 (参见，例如，Gao等.(2002)PNAS，99 :11854 11859 ;and Viral Vectors for GeneTher即y : Methods and Protocols, ed. Machi da ， Humana Press, 2003)。可以使用除了在此列出的 那些之外的其它血清型。此外，假型AAV载体也可以在此处描述的方法中使用。假型AAV 载体是在第二 AAV血清型的衣壳中含有AAV血清型的基因组的那些；例如，含有AAV2衣壳 和AAV1基因组的AAV载体，或含有AAV5衣壳和AAV2基因组的AAV载体(Auricchio等.， (2001)Hum.Mol. Genet. ，10(26) :3075-81)。 AAV载体来自对哺乳动物不致病的单链的(ss)DNA细小病毒(paroviruses)(在 Muzyscka(1992)Curr. Top. Microb. Immunol. ，158 :97-129中综述)。简要地，基于AAV的 载体除去了 r印和cap病毒基因，它们占据了病毒基因组的96%，留下两个侧翼的145碱 基对(bp)的反向末端重复(ITR)，其被用于启动病毒DNA复制、包装和整合。在不存在辅 助病毒的情况下，野生型AAV整合到人类宿主细胞基因组中，优先的位点特异性在染色体 19ql3. 3，或者它可以游离地维持。单个的AAV颗粒可以容纳最高达5kb的ssDNA，因而留下 约4. 5kb用于转基因和调节元件，这一般是足够的。然而，例如，在美国专利NO. 6， 544， 785 中描述的反式剪接系统，可以近乎加倍这种限制。
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在说明性的实施方式中，AAV是AAV2。许多血清型的腺相关病毒，特别是AAV2， 已经作为基因治疗载体被广泛地研究和表征。本领域技术人员熟悉功能性的基于AAV的 基因治疗载体的制备。关于AAV产生、纯化和制备用于施用到人类受试者的各种方法的 许多参考文献可以在大范围的公开文献中找到(参见，例如，Viral Vectors forGene Ther即y :Methods and Protocols, ed. Machida， Humana Press, 2003)。另夕卜，在美国专禾U NO. 6， 180， 613和6， 503， 888中已经描述了耙向CNS的细胞的基于AAV的基因治疗。其他 示范性的AAV载体是编码人类蛋白质的重组的AAV2/l、AAV2/2、AAV2/5， AAV2/6、 AAV2/7和 AAV2/8血清型载体。 在此处描述的某些方法中，载体包括与启动子可操作连接的转基因。所述转基因 编码生物学活性分子，例如，GBA多肽，其在CNS中的表达引起突触核蛋白病的至少部分矫 正。 在真核细胞中转基因表达的水平基本上由转基因表达盒内的转录启动子决定。 显示了长期活性，以及是组织和甚至细胞特异性的启动子在某些实施方式中使用。启动 子的实例包括，但不限于，巨细胞病毒(CMV)启动子(K即litt等.(1994)Nat. Genet. ，8 : 148-154) 、CMV/人类P 3珠蛋白启动子(Mandel等 (1998) J. Neurosci. ， 18 :4271-4284)、 GFAP启动子(Xu等 (2001)Gene Ther. ，8 :1323-1332) 、 1. 8kb神经元特异性烯醇酶(NSE) 启动子(Klein等.(1998) Exp. Neurol， 150 :183-194)、鸡P肌动蛋白(CBA)启动子 (Miyazaki (1989)Gene， 79 :269-277)、 P _葡糖醛酸酶(GUSB)启动子(Shipley等(1991) Genetics, 10 :1009-1018)，以及泛素启动子，例如，分离自人类泛素A、人类泛素B和人类泛 素C的那些，如在美国专利No.6，667， 174中所描述的。为了延长表达，其他调节元件可以 另外地可操作连接到所述转基因，例如，旱獭肝炎病毒调节后元件(Woodchuck H印atitis Virus Post Regulatory Element,WPRE) (Donello等(1998) J. Virol，72 :5085-5092)，或牛 生长激素(BGH)多聚腺苷酸位点。 对于某些CNS基因治疗应用，控制转录活性是必需的。为此，利用病毒载体的基因 表达的药理学调节可以通过包括各种调节元件和药物应答启动子来获得，例如，在Haberma 等.(1998)Gene Ther. ，5 :1604-16011 ;and Ye等.(1995) Science, 283 :88-91中所描述的。
高滴度的AAV制品可以利用本领域已知的的技术产生，例如，在美国专利 NO. 5， 658， 776禾口 Viral Vectors for Gene Therapy :Methods andProtocols， ed. Machida， Humana Press, 2003中描述的。
剂量 对于疾病的治疗，多肽，例如，GBA或组织蛋白酶多肽或在此描述的其他试剂的合
适剂量，将取决于要治疗的疾病的种类、疾病的严重度和进程、多肽或试剂是用于预防性还
是治疗性目的、早先的治疗、患者的临床历史、对酶或试剂的反应、以及主治医师的判断。 在组合治疗方法中，在此描述的组合物以治疗有效的或协同的数量施用。治疗协
同的数量是以高于当单独施用两种多肽/试剂时叠加的方式，显著降低或消除与特定疾病
相关的状况或症状所必需的，与一种或更多种其他多肽或试剂组合的一种或更多种多肽或
其他试剂的数量。 虽然剂量可以取决于疾病和患者而变化，多肽一般以约O. l到约1000毫克每50kg 患者每次施用的数量施用给患者，可以每周地、每月地或以需要的其他时间间隔来重复。在
17一个实施方式中，所述多肽以约1到约500毫克每50kg患者每月的数量施用给患者。在其 他实施方式中，所述多肽以约5到约300毫克每50kg患者每月、或约10到约200毫克每 50kg患者每月的数量施用给患者。 取决于疾病的类型和严重度，所述多肽或试剂可以被施用，从而提供的局部浓度 是约100pg/ml到约100 ii g/ml， Ing/mL到约95 ii g/mL， 10ng/ml到约85 ii g/ml， lOOng/ml 至U约75 ii g/ml ，约lOOng/ml至lj约50 ii g/ml ，约1 ii g/ml至lj约25 ii g/ml ，约1 ii g/ml至lj约 15 u g/ml ，约1 u g/ml到约10 u g/ml ，或约1 u g/ml到约4 u g/ml 。 当所述多肽或试剂通过病毒病毒颗粒的基因治疗来递送时，剂量可以是从约 2X 106到约2X 1012drp，约2X 107到约2X 10"drp，约2X 108到约2X 101Qdrp (DNaSe抗性 颗粒)每单位剂量。在某些实施方式中，组合物中的载体的浓度或滴度是至少(a)5、6、7、 8、9、10、15、20、25或50 (X 1012gp/ml) ; (b) 5、6、7、8、9、 10、 15、20、25或50 (X 109tu/ml);或 (c)5、6、7、8、9、10、15、20、25或50 (X 1010iu/ml)。 术语"基因组颗粒(gp)"或"基因组等价物"当涉及病毒滴度使用时，是指含有重 组AAV DNA基因组的病毒颗粒的数量，不考虑感染性或功能性。在特定的载体制品中的基 因组颗粒的数量可以由在此处的实施例中描述的操作，或例如，在Clark等.(1999)Hum. GeneTher. ，10 :1031-1039 ;Veldwijk等.(2002)Mol. Ther. ，6 :272-278中描述的来测量。
术语"感染单位(iu)"、"感染性颗粒"或"复制单位"如涉及病毒滴度使用的，是指 通过例如在McLaughlin等.(1988) J. Virol， 62 :1963-1973中描述的感染性中心分析，也称 为复制中心分析所测量的，感染性的和有复制能力的重组AAV载体颗粒的数量。
术语"转导单位(tu)"如涉及病毒滴度使用的，是指例如在此处的实施例中描 述的，或例如在Xiao等 (1997)Exp. Neurobiol. ， 144 :113-124 ;或在Fisher等 (1996) J.Viro1，70 :520-532 (LFU分析)中描述的功能分析中所测量的，引起功能性转基因产物的 产生的感染性重组AAV载体颗粒的数量。 当所述多肽或试剂通过蛋白质或化学疗法施用时，所述剂量可以从约0. lmg到约 50mg，约0. lmg到约25mg，约0. lmg到约10mg，约0. 5mg到约5mg，约0. 5mg到约2. 5mg每单
位剂量。 在此描述的多肽和试剂可以作为单剂量施用或重复地施用。对于持续几天或更长 时间的重复施用，取决于其条件，持续进行治疗直到产生期望的对疾病症状的抑制。可以通 过传统的技术和分析来容易地监测本发明的疗法的进展。
药物组合物"药物组合物"或"药物"意图包括活性成分或试剂的组合，例如，酶多肽，和任选地 载体或其他材料，例如，化合物或组合物，其是惰性的(例如，可检测的试剂或标记)或活性 的，例如佐齐U、稀释齐U、粘合齐U、稳定齐U、缓冲液、盐、亲脂性溶齐U、防腐齐IJ、佐剂等等，或两种 或更多种这些物质的混合物。 载体优选的是药学上可接受的。它们可以包括药物的赋形剂和添加剂、蛋白质、 肽、氨基酸、脂质和碳水化物(例如，糖类，包括单糖、二糖、三糖、四糖和寡聚糖；衍生的糖 类，例如糖醇、醛糖酸，酯化的糖类等等；以及多糖或糖聚合物)，其可以单独地或组合地存 在，包含单独地或按照重量或体积的1-99. 99%地组合地。示范性的蛋白质赋形剂包括血清 白蛋白，例如人血清白蛋白(HSA)、重组人白蛋白(rHA)、明胶、酪蛋白，等等。也可以在缓冲
18能力上起作用的代表性的氨基酸/抗体成分包括丙氨酸、甘氨酸、精氨酸、甜菜碱、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸、赖氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、阿司帕坦，等等。碳水化物赋形剂也意图包括在本发明的范围内，其实例包括但不限于，单糖，例如果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖，等等；二糖，例如乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖，等等，多糖，例如棉子糖、松三糖、麦芽糊精、葡聚糖、淀粉，等等，以及糖醇，例如甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、拉克替醇、木糖醇山梨醇(葡糖醇)和肌醇。 术语载体还包括缓冲液或pH调整试剂或含有它们的组合物；一般地，缓冲液是从有机酸或碱制得的盐。代表性的缓冲液包括有机酸盐，例如柠檬酸、抗坏血酸、葡糖酸、碳酸、酒石酸、丁二酸、乙酸或邻苯二甲酸的盐，Tris、氨基丁三醇盐酸盐或磷酸盐缓冲液。其他载体包括聚合的赋形剂/添加剂，例如聚乙烯吡咯烷酮，菲科尔(ficoll)(聚合的糖类)、葡萄糖结合剂(dextrate)(例如，环糊精，例如2_羟基丙基-.quadrature,环糊精)、聚乙二醇、调味剂、抗微生物剂、甜味剂、抗氧化剂、抗静电剂、表面活性剂(例如，聚山梨醇酯，例如"吐温20"⑧和"吐温80"⑧)、脂质(例如，磷脂、脂肪酸)、类固醇(例如，胆固醇)和螯合剂(例如，EDTA)。 如在此使用的，术语"药学上可接受的载体"包含与药物施用相容的任何标准药物载体，例如盐水、溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和吸收延迟试剂，等等，磷酸盐缓冲盐水溶液、水和乳剂，例如油/水或水/油乳剂，和各种类型的润湿剂。补充的活性化合物也可以掺入到组合物中。根据本发明制造和/或使用的、包括特定的多肽、核酸分子或其他试剂的组合物和药物可以包括稳定剂和防腐剂，和任何在此描述的载体，其他的条件是它们对于体内使用是可接受的。其他载体、稳定剂和佐剂的实例，参见Martin REMINGTON' SPHARM. SCI. ，15th Ed. (Mack Publ. Co. ，EaSton(1975)and Williams&Williams, (1995)，和"PHYSICIAN' S DESK REFERENCE, " 52ndecL ，Medical Economics,Montvale， N. J. (1998)。 在此描述方法包括药物组合物的制造和用途，所述药物组合物可以包括通过在此
描述的筛选方法鉴定的化合物作为活性成分。还包括的是所述药物组合物本身。例如，在
此描述的组合物可以包括提高GBA或PS/SC的一种或两种的活性或水平的试剂。 药物组合物一般被配制为与它们预定施用途径相容。施用途径的实例包括胃肠外
的，例如，静脉内的、皮内的、皮下的、口服(例如，吸入)、经皮的(局部的)、经粘膜的和直
肠的施用。 配制适合的药物组合物的方法是本领域已知的，参见，例如，Drugsand thePharmaceutical Sciences :a Series of Textbooks and Monographs (Dekker， NY)系列中的书籍。例如，用于胃肠外的、皮内的或皮下的应用的溶液或悬浮液可以包括以下成分，无菌的稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、不挥发的油类、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗细菌试剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如，乙二胺四乙酸；缓冲液，例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，以及用于调整张力的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。pH值可以使用酸或碱调整，例如，盐酸或氢氧化钠。胃肠外的制品可以封装到由玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。
适合于注射的药物组合物可包括无菌水溶液(在水可溶时)或分散体，以及用于无菌可注射溶液或分散体的临时制备的无菌粉剂。对于静脉内施用，适合的载体包括，生理ELTM(B A SF ;Parsi卯any，N. J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况下，组合物应当是无菌的，并应当是流体，达到存在容易的可注射性的程度。它在制造和储存条件下应该是稳定的，并且必须保存于对抗微生物例如细菌和真菌的污染作用之下。载体可以是溶剂或分散介质，其含有，例如，水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等等)、以及其适合的混合物。例如，通过使用包衣例如卵磷脂、在分散体的情况下通过维持所需的粒子大小、以及通过使用表面活性剂，可以维持适当的流动性。可以通过各种抗细菌和抗真菌剂，例如，对羟苯甲酸、氯代丁醇、酚、抗坏血酸、硫柳汞等等，来实现对微生物作用的预防。在很多情况下，优选的是在组合物中包括等渗试剂，例如，糖类、多元醇如甘露醇、山梨醇、氯化钠。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝和明胶，可以实现可注射组合物的延长的吸收。 通过将活性化合物以所需的数量掺入到具有以上列举成分的一种或组合的适合的溶剂中，根据需要，继之以过滤灭菌，来制备无菌可注射溶液。 一般地，通过将活性化合物掺入到含有碱性分散介质以及来自以上列举那些的其他所需成分的无菌载体中，来制备分散体。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂来说，优选的制备方法是真空干燥和冻干技术，其产生活性成分加上来自其早先无菌过滤溶液的任何其他期望成分的粉剂。
口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用的载体。对于口服治疗施用来说，活性化合物可以与赋形剂混合，以片剂、锭剂或胶囊例如明胶胶囊的形式使用。口服组合物也可以使用用作嗽口剂的流体载体来制备。药学上相容的结合试剂、和/或佐剂材料可以包括为组合物的部分。片剂、药丸、胶囊、锭剂等等可以含有任何以下的成分，或类似性质的化合物粘合剂，例如微晶纤维素、西黄蓍树胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖，崩解剂，例如
藻酸、Primogel⑧或玉米淀粉；润滑齐U，例如硬脂酸镁或Sterotes⑧；助流剂，例如，胶体
二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；调味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。
对于通过吸入施用，化合物可从压縮容器或分配器以气溶胶喷雾来递送，所述压縮容器或分配器含有适合的推进剂，例如气体，如二氧化碳，或喷雾器。这样的方法包括在美国专利No. 6， 468， 798中描述的那些。 在此描述的治疗化合物的全身性施用也可以通过是经粘膜或经皮的方式。对于经粘膜或经皮施用，适合于需透过的障碍物的渗透剂可以用于制剂中。这种渗透剂一般是本领域已知的，包括，例如，对于经粘膜施用，洗涤剂、胆汁盐、和羧链孢酸衍生物。经粘膜施用可以通过使用鼻喷雾剂或栓剂来实现。对于经皮施用，如本领域一般已知的，活性化合物被配制到软膏剂、油膏剂、凝胶剂或乳膏剂中。 药物组合物也可以以用于直肠递送的栓剂(例如，具有常规的栓剂基质，例如可可脂和其他甘油酯)或滞留灌肠剂的形式制备。 是或包括核酸的治疗化合物可以通过适合于核酸试剂，例如DNA疫苗的施用的任何方法来施用。这些方法包括基因枪、生物注射器和皮肤贴片，以及无针头的方法，例如在美国专利No. 6， 194， 389中公开的微粒DNA疫苗技术，以及如美国专利No. 6， 168， 587中公开的使用粉末形式的疫苗的哺乳动物经皮无针头的疫苗接种。另外，鼻内递送是可能的，特别是，在Hamajima等，(1998) Clin. Immunol. Immunopathol， 88 (2) ， 205-10中描述了。也可以使用脂质体(例如，在美国专利6，472，375中描述的)和微胶囊。也可以使用生物可降解的可耙向微粒递送系统(例如，在美国专利No. 6， 471， 996中描述的)。
20
在一个实施方式中，使用载体制备治疗化合物，所述载体将保护所述治疗化合物对抗从身体的快速消除，例如控释制剂，包括植入物和微胶囊化的递送系统。可以使用生物可降解的、生物相容的聚合物，例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原、聚正酯(polyorthoesters)、聚乳酸。这样的制剂可以使用标准技术制备。这些材料也可以商业地获自Alza Corporation禾口 Nova Pharmaceuticals, Inc。月旨质体悬浮液(包括具有针X寸病毒抗原的单克隆抗体、靶向受感染细胞的脂质体)也可以用作药学上可接受的载体。这些可以根据本领域技术人员已知的方法来制备，例如，如美国专利No. 4， 522， 811中描述的。
所述药物组合物可以与施用的说明一起被包括在容器、包装或分配器中。
试剂盒 根据本发明的试剂盒是独立部件的组装物。虽然它们可以包装在单个容器中，它们可以被独立地分装。甚至单独的容器也可以分到不同的区室中。 一般地，一套说明书将伴随着试剂盒，并提供了用于递送所述酶，例如，脑室内地递送GBA多肽的说明书。所述说明书可以是印刷的形式，电子形式，指导视频或DVD的形式，在光盘、在软磁盘上，在包装中提供的地址的互联网上，或这些方式的组合。其他成分，例如稀释齐U、缓冲液、溶齐U、胶带、螺丝和维护工具可以在所述酶、一个或更多个套管或导管和/或泵之外提供。[OH2] 筛选方法 还包括在此的是筛选测试化合物，例如，多肽、多核苷酸、无机或有机的大分子或小分子测试化合物的方法，来鉴定在治疗不与溶酶体贮积病相关的突触核蛋白病病症，例如原发的突触核蛋白病中有用的试剂。特别是，所述新的筛选分析被设计以定位充当野生型或突变型GBA的GBA活化试剂的新的化合物。 如在此使用的，"小分子"是指分子量低于约3，000道尔顿的小的有机的或无机的分子。一般地，对于本发明有用的小分子具有低手3，000道尔顿(Da)的分子量。所述小分子可以是，例如，至少约100Da到约3， 000Da(例如，约100到约3，000Da、约100到约2500Da、约100到约2， 000Da、约100到约1， 750Da、约100到约1， 500Da、约100到约1， 250Da、约100到约1， 000Da、约100到约750Da、约100到约500Da、约200到约1500、约500到约1000、约300到约1000Da、或约100到约250Da)。 测试化合物可以是，例如，天然产物或组合化学库的成员。 一组各种分子应当被用来覆盖各种功能，例如，电荷、芳香性、氢键键合、柔性、大小、侧链长度、疏水性和刚性。适合于合成小分子的组合技术是本领域已知的，例如，由Obrechtand Villalgordo， Solid—S叩portedCombinatorial and Parallel Synthesisof Small—Molecular—WeightCompound Libraries, Pergamon—Elsevier ScienceLimited(1998)所例示的，包括那些例如"分裂和合并(split and pool)"或"平行"合成技术，固相和溶液相技术和编码技术(参见，例如Czarnik， (1997) Curr. Opin. Chem. Bio.，1 :60-6)。此外，许多小分子库是商业上可获得的。许多适合的小分子测试化合物在美国专利No. 6， 503， 713中列出了 ，通过完全引用合并在此。 利用本发明的方法筛选的库可以包含多种测试化合物类型。给定的库可以包含一组结构上相关的或不相关的测试化合物。在某些实施方式中，测试化合物是肽或拟肽分子。在某些实施方式中，测试化合物是核酸。 在某些实施方式中，测试化合物和它的库可以通过系统地改变第一测试化合物，
21例如，结构上类似于目标多肽的已知的天然结合配体第一测试化合物，或被鉴定为能够结合目标多肽的第一小分子，的结构，例如，利用本领域已知的方法或在此描述的方法，并将所述结构与产生的生物学活性相关联，例如，结构-活性关系研究，来获得。本领域技术人员将理解，对于产生这样的结构-活性关系，存在着多种的标准方法。因而，在某些情况下，所述工作基本上是经验性的，在其他实施方式中，内源多肽或其部分的三维结构可以被用作小分子化合物的合理设计的出发点。例如，在一个实施方式中，例如利用在此描述的方法筛选小分子的一般库。 在某些实施方式中，测试化合物被用于测试样品，例如，细胞或活组织或器官，评估测试化合物的一种或更多种效力。在例如培养的或原代细胞中，测试化合物提高GBA或PS/SC的水平和/或活性的能力可以被测定。在此描述的基于MES细胞的模型可以被用于这样的筛选分析。举例来说，利用MES细胞培养平板(96-或384孔的)，基于小分子的化学物质库以1 P M的测试浓度施加36-48小时的时间。细胞被裂解并通过夹心ELISA分析，例如，如在此处附图3A到3D中示出的，来测定这些化合物对每个反应孔中的a -突触核蛋白蛋白质浓度的净影响。 在某些实施方式中，所述测试样品是，或来自于(例如，来自它的样品)在此描述的突触核蛋白病病症的体内模型。例如，可以使用动物模型，例如，啮齿动物模型，例如小鼠或大鼠模型。特别地，突触核蛋白病的MaSliah小鼠模型是适合的(可从JSW Research,Graz， Austria商业上获得)(参见，MaSliah等 ， Science, 2000 Feb 18 ;287 (5456):1265-9)。 评估这些效力的每一种的方法是本领域已知的。例如，调节蛋白质的表达的能力可以在基因或蛋白质水平上评估，例如，使用定量的PCR或免疫分析方法。在某些实施方式中，高通量方法，例如本领域已知的蛋白质或基因芯片(参见，例如Ch. 12， Genomics,in Griffiths等.，Eds. Modern genetic Analysis,1999， W. H. Freeman and Company;Ekins and Chu，1999 Trends in Biotechnology, 17 :217-218 5MacBeathand Schreiber，2000 Science,289(5485) :1760-1763 ;Simpson， Proteinsand Proteomics :A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress ;2002 ;Hardiman， Microarrays Methodsand Applications :Nuts &Bolts， DNA Press, 2003)可以用于检测对在此描述的多肽的两种、三种、四种、五种或更多种的影响。 通过在此描述的方法筛选的、和被确定提高GBA或PS/SC的水平和/或活性，或降
低aS聚集物的水平的测试化合物，可以被认为是候选化合物。随后在例如病症的体内模
型，例如突触核蛋白病病症的动物模型中筛选的、被确定具有对所述病症、例如对所述病症
的一种或更多种症状具有期望的效果的候选化合物，可以被认为是候选治疗试剂。 一旦在
临床环境中筛选，候选治疗试剂是治疗试剂。候选化合物、候选治疗试剂和治疗试剂可以任
选地被优化和/或衍生化，并与生理可接受的赋形剂配制来形成药物组合物。 因而，在第一筛选中被鉴定为"命中"(例如，提高GBA或PS/SC的水平和/或活性
的测试化合物)的测试化合物可以被选择和系统性地改变，例如，使用合理的设计，来优化
结合亲和性(affinity)、亲合力(avidity)、特异性或其他参数。这样的优化也可以利用在
此描述的方法来筛选。因而，在一个实施方式中，本发明包括利用本领域已知的方法和/或
在此描述的方法筛选化合物的第一库，鉴定该库中的一个或更多个命中，将那些命中进行系统性结构改变来产生与所述命中结构上相关的化合物的第二库，利用在此描述的方法筛 选所述第二库。 被鉴定为命中的测试化合物可以被认为是在治疗此处描述的突触核蛋白病病症 方面有用的候选治疗化合物。对于测定"命中"的结构有用的各种技术可以用于在此描述 的方法，例如，NMR，质谱法、装备有的电子俘获检测器的气相色谱法、荧光和吸收光谱法。因 而，本发明还包括通过在此描述的方法鉴定为"命中"的化合物，以及它们的施用方法和在 治疗、预防或延迟在此描述的病症的发展或进行方面的用途。 被鉴定为候选治疗化合物的测试化合物可以进一步通过向在此描述的突触核蛋 白病病症的动物模型施用来筛选。可以监视动物在病症方面的改变，例如，在病症的参数方 面，例如，与临床结局相关的参数方面的改善。
实施例 在以下实施例中进一步描述了本发明，其不限制本发明的范围，本发明的范围在 权利要求中描述。 实施例1 :鞘糖脂在体外与a -突触核蛋白生物化学相关 在这个实施例中进行的实验展现了 ，在a -突触核蛋白蛋白质和人类脑神经节苷 脂之间稳定复合物的存在，其最终变为GBA酶的底物。 神经节苷脂是复合的鞘糖脂，其含有葡萄糖脑苷脂单位作为它们的化学结构的部 分(参见，例如Dreisewerd等，(2005) Anal Chem. ， 77， 4098-107)。结果，葡萄糖脑苷脂单位 构成了在神经节苷脂的连续合成_降解循环中的构建块和降解产物。 一组良好表征的、脑 衍生的神经节苷脂(参见Schlossmacher等，(2005) N. E. J. M. ， 352， 728-731，和Dreisewerd 等.(2005))与重组a-突触核蛋白蛋白质的体外共同孵育，导致了在高度变性SDS/PAGE 条件下稳定的复合物的形成，如Western印迹所显示的，促使16kDa a -突触核蛋白复合物 朝向19-20kDa更高分子量a-突触核蛋白蛋白质/葡萄糖脑苷脂复合物的电泳移动(附
图1)。 附
图1是Western印迹的呈现，展现了在体外人类脑神经节苷脂和a -突触核蛋 白蛋白质之间稳定的19-20kDa复合物(aS/G)的时间依赖性形成。人类脑衍生的神经节 苷脂(G)与重组人类a-突触核蛋白蛋白质(aS;野生型)在4t:共孵育最长至72小时 的各个时间段，之后进行SDS/PAGE。作为阴性对照(C)，水与重组人类a-突触核蛋白蛋白 质孵育72小时。在19-20kDa处迁移的上部条带的时间依赖性出现，在与神经节苷脂孵育 而不是与水孵育的样品中被观察到，被解释为稳定的a-突触核蛋白蛋白质-神经节苷脂 (aS/G)复合物。未复合的a-突触核蛋白蛋白质的存在由分子量16kDa的条带指示。
这些和相关的发现表明，a-突触核蛋白蛋白质可以与含有葡萄糖脑苷脂的复合 脂质以一定方式作用，所述方式是高度稳定的和对SDS的存在是相对抗性的。
实施例2 :葡萄糖脑苷脂在体外与a -突触核蛋白蛋白质生物化学相关
人类组织衍生的或合成的葡萄糖脑苷脂(aka作为葡萄糖神经酰胺；GC)在4。C与 重组人类a-突触核蛋白蛋白质(aS;野生型)共同孵育最长至72小时的各个时间段，之 后进行SDS/PAGE。作为阴性对照(C)，水与重组人类a-突触核蛋白蛋白质孵育72小时。 大约19-22kDa处迁移的上部条带的时间依赖性出现应当在与葡萄糖脑苷脂孵育的样品中注意到。未复合的a-突触核蛋白蛋白质的存在由分子量16kDa的条带指示。 这些和相关的发现表明，a-突触核蛋白蛋白质可以与葡萄糖脑苷脂以一定方式
作用，所述方式是高度稳定的和对SDS的存在是相对抗性的。 实施例3 :葡萄糖鞘氨醇在体外与a -突触核蛋白蛋白质生物化学相关 人类组织衍生的或合成的葡萄糖鞘氨醇(aka作为葡萄糖基鞘氨醇；Gs)与重组人
类a-突触核蛋白蛋白质(aS;野生型)在4t:共同孵育最长至72小时的各个时间段，之
后进行SDS/PAGE。作为阴性对照(C)，水与重组人类a-突触核蛋白蛋白质孵育72小时。
大约19-22kDa处迁移的上部条带的时间依赖性出现应当在与葡萄糖鞘氨醇孵育的样品中
注意到。未复合的a-突触核蛋白蛋白质的存在由分子量16kDa的条带指示。 这些和相关的发现表明，a-突触核蛋白蛋白质可以与葡萄糖鞘氨醇以一定方式
作用，所述方式是高度稳定的和对SDS的存在是相对抗性的。 实施例4 :用于a-突触核蛋白蛋白质表达的、表达多巴胺的神经细胞培养系统的 建立 表达多巴胺的啮齿动物中脑细胞培养物系统(MES23.5细胞)被用于a _突触核 蛋白蛋白质过量表达系统的建立。早先，这些细胞已经被Sharon等人使用来创造过量表达 aS的稳定的细胞系。然而，这些作者注意到，稳定的aS转染的MES23.5细胞克隆在传代 2个月或更久之后逐渐地放松aS表达(Sharon R，等，(2001)PNAS 98,9110-9115)。为了 避免这个问题，在本研究中，MES23. 5细胞每次使用Lipofectamine⑧2000(Invitrogen Corp)瞬时转染。由于MES23. 5细胞仅仅松散地附着到组织培养塑料皿，细胞在聚_D_赖 氨酸包被的塑料皿上培养，是一种早先未在文献中使用的方法。此外，Invitrogen Corp建 议当细胞> 80%汇合时用Lipofectamine 2000转染，在这项研究中经验性地发现的是，当 细胞50-60%汇合时转染大大地改善了转染效率(通过姐妹反应孔中编码绿色荧光蛋白 (GFP)的质粒的转染效率来测量的，在荧光显微镜下在转染24小时后目测)。
如在附图2A中示出的，MES23. 5细胞用在CMV启动子控制下的全长的a S编码 SNCA cDNA质粒瞬时转染。细胞用0、0. 25、0. 5、1、5和10 y g (每10cm皿)质粒转染。24小 时后，细胞用Tris缓冲盐水洗涤，在140mM NaCl、50mM Tris-HCl，pH 8. 0、1mM EDTA、0. 5% Triton-X100和IX蛋白酶抑制物中裂解。溶胞产物在4。C在100， 000Xg离心30分钟，取 出上清液的上部2/3，在硅化试管中在-8(TC冷冻。使用lmM DTT作为还原剂在SDS/PAGE 运行样品。a S蛋白质的表达在转染后24小时通过Western印迹确认，其中细胞溶胞产物 使用针对aS蛋白质的单克隆抗体(syn-l抗体，BD Transduction Labs)来探测。显示了 表达是取决于转染的质粒初始数量的，最高到5-10 ii g每10cm皿的饱和数量。
实施例5 :利用MES23. 5细胞用于a -突触核蛋白和选择的溶酶体蛋白质的伴随 表达的探索研究 在这个实施例中进行的实验(附图2B中所示)展现了在细胞GBA蛋白质方面提 高的水平可以降低神经a-突触核蛋白蛋白质的水平。MES23. 5细胞用0. 5 ii g a S编码SNCA cDNA每10cm皿加上1. 25、2. 5或5 ii g (低、
中或高)GBA编码cDNA，在不存在或存在5ii g皂化蛋白原编码cDNA的情况下转染。实验 的所有分支使用空的载体cDNA平衡到总共10. 5 ii g cDNA每10cm皿。在CMV启动子之下 的GBA和皂化蛋白原编码cDNA质粒、以及pCMV-XL5空载体购自0riGene Technologies,
24Inc (在分离和混合制备之后，克隆被完全测序证实)。24小时后，细胞被裂解，并探测GBA 和aS蛋白质水平。附图2B3中的上部画面是指示缺乏和存在共同转染的皂化蛋白原的情 况下GBA蛋白质表达的Western印迹的呈现。使用单克隆抗体8E4探测GBA。在不存在皂 化蛋白原的情况下，GBA以稍微基因剂量依赖性的方式发生过量表达。在存在皂化蛋白原 过量表达的情况下，GBA信号本身被降低。这种观察结果可以通过在GBA活化期间的修饰、 导致它在这些SDS/PAGE/Western印迹条件下被采用的单克隆抗体的降低的可识别性，通 过在它被PS/SC活化之后更快的GBA的溶酶体内降解速率来解释，或者，考虑到三种不同的 带有外源cDNA的质粒的伴随递送，它可以作为总体降低的cDNA转录和翻译率的结果而发 生。 附图2B的下部画面显示了，在不存在共同转染的皂化蛋白原的情况下，在最大数 量的共转染的GBA cDNA的情况下，GBA降低了共同表达的a _突触核蛋白蛋白质水平。这 种观察到的GBA的a-突触核蛋白蛋白质降低效力通过皂化蛋白原的共表达被大大地强化 了，由在甚至更低浓度(低度和中度)的转染的GBA编码cDNA之下a-突触核蛋白蛋白质 水平的强烈降低所表明。附图2C中的柱形图展现了附图2B中显示的数据的半定量的概述。
总之，断定的是，在这些离体(ex vivo)细胞培养条件下，提高的GBA活性可以降 低a-突触核蛋白稳态水平，特别是在存在提高的PS/SC的情况下。因而，这种策略可以用 于降低体内a-突触核蛋白稳态水平，包括，在处于a-突触核蛋白含量的严重升高的水平 的风险中、或已经受其影响的人类脑部，例如在患有突触核蛋白病病症的受试者中。因此， 提高体内的GBA活性和/或PS/SC水平的策略代表了帕金森氏病(PD)和相关的突触核蛋 白病的神经保护性治疗的新的通路。 实施例6 :定量测定转染的MES23. 5细胞中a -突触核蛋白浓度的第一种(first in kind)敏感和精确的ELISA系统的建立 对于进一步的实验和研究，希望的是降低对Western印迹方法的依赖，它是低通 量的并具有有限的动态范围，作为替代创造一种定量的夹心ELISA(酶联免疫吸附分析)系 统用于a S的中度通量定量，具有改进的敏感性、优化的特异性和动态范围。
针对重组的全长人类aS产生来自6只兔子的血清，并在0penBiosystems， Inc. (http://www. openbiosystems. com)上亲禾口纯4t。重纟且a S已纟圣丰皮HP1X禾口 MS表征并进畔亍 氨基酸组成和蛋白质浓度分析。对于ELISA，384孔MaxiSorp平板(Nunc, Inc)用在包被缓 冲液(具有0. 2% NaN3的NaHC03，pH 9. 6)中稀释的50 y 1/孔捕获多克隆Ab (hSA_2)来包 被。在用PBS/0. 05% Tween-20 (PBS-T)洗涤之后，平板在封闭缓冲液(1. 125%鱼皮明胶； PBS-T)中在37t:下封闭2小时。在4次洗涤之后，加载样品在4t:孵育12小时。生物素化的 Syn-lmAb(作为分析Ab)使用200 y g硫代-NHS-LC生物素(Pierce)产生，在封闭缓冲液中 稀释并在37t:下添加到平板2小时。在4次洗涤之后，在封闭缓冲液中稀释的ExtrAvidin 磷酸酶(Sigma)在37t:应用1小时。通过使用FaSt-P-硝基苯基磷酸酶(Sigma)进行显 色，每5分钟在0D 405nm动态地监测直到60分钟。 各种浓度的高度纯化的、重组的人类a S(r-haS)用作标准物来建立ELISA敏感性 和分析范围，如在附图3A中显示的(r2 > 0. 98)。
为了以低细胞毒性优化"DNA :Lipofectamine 2000"比例，MES23. 5细胞用
0. 25、0. 5或1 ii g a S编码野生型人类SNCA cDNA加空载体cDNA直到总共5. 5 y g DNA每
2510cm皿来转染。转染后24小时，如上述收获细胞溶胞产物。对于细胞溶胞产物的连续稀释 物，含有来自载体转染的孔的0.5%溶胞产物的封闭缓冲液用作稀释剂，其也用于产生空白 和重组人类aS的相应的标准曲线。检查饱和度动力学，用于在标准物和样品稀释物处于 对数阶段时的时点的鉴定。 当通过ELISA分析这些细胞溶胞产物时，记录了MES-a S细胞中的浓度，其显示了 在连续稀释之后预计的平行关系，并且是SCNAcDNA剂量依赖性的(这两个方面在附图3B 的图形中显示)，以及第一次允许精确的计算活细胞中表达的a S蛋白质浓度的总量(如附 图3C中所示)。 还确认的是，在细胞表达的这些精细化的条件下，MES23. 5和MES-syn细胞的生 存力没有改变，如通过作为细胞渗漏的标志物、条件培养基中LDH(乳酸脱氢酶，正常细 胞溶质酶)所测量的，和通过作为完整细胞新陈代谢的标志物、MTT((3-(4，5-二甲基噻 唑-2-基)-2，5-联苯四唑鎗溴化物)向甲U替的细胞转变所测量的。对于这些标准的毒性
分析，并行地进行了导致100%细胞裂解(o. i%Triton-X ioo处理)的阳性对照。结果
在附图3D中示出。还确定的是，对于所有实验中选择的cDNA浓度范围，MES- a S和MES-载 体细胞在MTT分析中是完全代谢活性的，显示了没有细胞溶质衍生的LDH向转染和未转染 细胞的条件培养基中的释放。因而，两项分析都展现了细胞的完整性。
实施例7 :在GBA中突触核蛋白病病相关的、以及催化位点定点突变促进了多巴胺 能MES细胞中a-突触核蛋白的积累 实施例6中描述的优化的细胞表达/ELISA读出系统被用于检查突变的GBA蛋白 质的过量表达对MES23. 5细胞中a S水平的影响。 MES细胞用0. 5 ii g每10cm皿的带有a S编码SNCA cDNA的质粒加上5 ii g每10cm 皿的野生型或突变的人类GBA编码质粒转染。使用的GBA变体是野生型、N370S、 D409H、 L444P、E235A和E340A。这5种GBA突变体利用Quickchange⑧试剂盒(Stratagene)通过 定点诱变来产生，并验证序列。N370S、D409H和L444P已知(以纯合的或复合的杂合状态) 以杂合的状态在高歇病中、在帕金森病患者和/或患有Lewy体痴呆的患者中存在。E235A 和E340A突变GBA蛋白质已知不在人类中存在。它们分别涉及GBA酶的酸性/碱性催化剂 和亲核剂，早先显示是无催化活性的，尽管被适当地正确地运输到溶酶体中(Fabrega等， 2000，Glycobiology，vol 10，pp 1217-1224)。 转染后24小时，MES细胞被如上所述地裂解，通过ELISA分析所有溶胞产物。如 在概述了几项ELISA实验(附图4中示出)的复合柱形图中展示的，当将a-突触核蛋白 稳态方面的变化与平行加载的重组a-突触核蛋白蛋白质的已知数量比较时，记录的是在 这些条件下野生型GBA(而不是皂化蛋白原)的与aS的共同表达(5iig/10cm皿)不显著 地改变a S水平(109. 7+/-9. 88%的载体cDNA对照水平)。这与上文的实施例5中观察到 的结果相比较。观察到的矛盾可以反映两个范例中转染的总DNA的差异(附图2B ;附图2C
对比附图4)，从而导致dna :Lipofectamine 2000比例的改变，以及共同表达的皂化蛋
白原(皂化蛋白C)的作用方面的差异。因而可想像的是，野生型GBA对这些MES23.5细胞 中的aS水平具有可变的影响，取决于aS进入溶酶体的比率以及超过一种溶酶体酶的组 成或活化状态。 相比之下，带有疾病相关的N370S、 D409H或L444P的GBA突变体与a S的
26共转染(5yg每10cm皿) 一致地导致细胞内a-突触核蛋白积累，其是对照水平的 121. 1+/-4. 98%、269. 4+/-56. 6%和172. 7+/_23. 02% (平均值+/_平均值标准误差，n = 4(-6)，来自5个独立实验)，如在附图4的柱形图中所展现的。这些结果第一次帮助解释 了，为什么具有N370S、 D409H或L444P突变的人对散发的帕金森氏病更为敏感。令人感兴 趣的是，一般产生高歇病(GD)的最轻形式的突变，S卩，N370S，仅仅促进aS的轻微积累，而 与更严重的GD表型相关的那些促进更突出的细胞内aS积累(参见，例如，附图4中的GBA 突变D409H)。 为了研究GBA突变对aS浓度的促积累效应是由于引起更一般化的细胞应激的运 输缺陷、还是由于溶酶体内酶的功能的损失，我们接下来采用了正确地运输到溶酶体、但是 展现了酶功能的完全丧失的两种突变体。GBA的带有E235A和E340A错义突变的变体与a S 的共转染(5iig每10cm皿)产生了细胞内a-突触核蛋白水平，其分别是对照载体DNA水 平的231. 0+/-37. 14%禾口 156. 4+/-19. 65% (平均值+/_sem， n = 4(_6)，来自5个独立实 验)，如在附图4中显示的柱形图中展现的。 根据这些实验的结果，看起来这种非蛋白酶型溶酶体酶的活性丧失至少部分地对 a S积累效应起作用，其是由人类疾病相关的GBA突变体诱导的。 实施例8 :组织蛋白酶D的表达一致地和显著地以剂量依赖性方式降低a -突触 核蛋白蛋白质水平 在实施例6中描述的系统被用于检查蛋白酶型溶酶体酶，S卩，组织蛋白酶D，对共 转染的aS水平的影响。 MES23. 5细胞转染了 0. 5 y g每10cm皿的携带编码a S的野生型人类SNCA cDNA 的质粒(在附图6显示的Western印迹中称为MES-hSNCA WT细胞)，加1. 25、2. 5或5 y g 每10cm皿的人类组织蛋白酶D编码CTSD cDNA质粒，其购自OriGene Technologies, Inc.， 处于CMV启动子的控制下。在分离和maxipr印之后，组织蛋白酶D克隆被全序列证实。每 个转染分支用空载体DNA平衡直到总共5. 5 ii gDNA每10cm皿。转染后24小时，细胞被裂 解，产生的溶胞产物通过在此描述的夹心ELISA来分析。 如附图5中展现的，人类组织蛋白酶D的共表达降低了细胞内a-突触核蛋白蛋 白质水平。这以CTSD cDNA剂量依赖性方式发生，因为共转染的组织蛋白酶D的提高的 数量引起了细胞内a-突触核蛋白水平的渐进性的降低。当将a-突触核蛋白稳态方面 的改变与平行加载的重组a-突触核蛋白蛋白质的已知水平比较时，计算出的是，组织蛋 白酶D过量表达的最高浓度(5iig/10cm皿)产生了是对照水平的25. 3+/_7.0%的细胞 内总a-突触核蛋白水平(n= ll，来自3个独立实验)。组织蛋白酶D过量表达的更低 的水平(1. 25ii g/10cm皿和2. 5ii g/10cm皿)产生了分别是对照水平的68+/-17. 7%和 53+/-16.8%的细胞内a-突触核蛋白水平(n = 2，来自2个独立实验)。类似地，人类组 织蛋白酶D能够降低共转染的大鼠a S的水平，使用相同的范例。 为了展现组织蛋白酶D的aS降低效力实际上测量为高达可检测的细胞内aS 浓度总量的百分之75，和为了显示后者的效力不是由于所选的ELISA系统，通过Western 印迹确认了结果。如附图6所示，细胞溶胞产物用2种不同的抗突触核蛋白抗体独立地探 测早先描述的单克隆的syn-l和兔多克隆7071AP (Periquet等，(2007) J. Neurosci. ， 27 : 3338-46)。
重要地，组织蛋白酶D与a S的共表达24小时不导致任何可见的更低或更高分子 量种类的产生，如通过syn-1和7071AP所显现的。当使用第三抗体，兔多克隆、亲和纯化的 hSA-2时(数据未显示)，和当印迹在更长的暴露下过度显现时，获得了相同的结果。
为了确认组织蛋白酶D的效力在体内发生，而不在细胞裂解过程期间发生，强力 的组织蛋白酶D抑制物胃酶抑素A的效力通过它在细胞裂解缓冲液中的存在来检查。如在 附图5的图形柱条中显示的(左侧前两个柱)，在裂解缓冲液中包含胃酶抑素A不改变溶胞 产物中检测的a S的数量，从而展现了上文附图5和6中描述的结果不是细胞裂解过程的 假象。 为了确认组织蛋白酶D对于MES23. 5细胞中a S的降低的效果是特异性的，而 不是由于细胞代谢和完整性方面的一般性降低，对已经用最高数量的组织蛋白酶D编码 cDNA (5 ii g/10cm皿)共转染的MES-syn细胞进行MTT和LDH分析。使用0. 1 %Triton-X 100的细胞的裂解充当阳性对照，代表最大的细胞死亡。用CTSD cDNA共转染的MES-syn 细胞展现了正常的MTT信号，其与对照载体转染的细胞没有不同(分别101.3+/-3.91%和 100+/-4.05%;n = 6，来自2个独立实验)。类似地，用组织蛋白酶D共转染的MES-syn细 胞展现了与对照载体转染的细胞相同的LDH信号。 为了检查组织蛋白酶D是否也可以降低带有错义突变的aS蛋白质的水平， MES23. 5细胞用低数量(0. 5 y g/10cm皿)的、编码a -突触核蛋白A30P、 E46K或A53T变 体，以及S129D和S129A突变体的SNCA cDNA转染，所述A30P、 E46K或A53T变体与人类中 的家族性的帕金森疾病相关联。在丝氨酸129残基上aS的磷酸化已知是体内aS聚集物 的病理学标志(Anderson J等，2006， J Biol Chem， vol 281， pp29739-29752.) 。 Ser残基 向ASp的突变本领域已知模拟了持续的、基于丝氨酸的磷酸化。a S的不能磷酸化的S129A 突变体也被包括用于比较。 如在附图7的柱形图中显示的，当与空载体DNA的共表达相比较时，组织蛋白酶D 编码CTSD cDNA(5ii g/10cm皿)与A30P、E46K、A53T、 S129D或S129A a S的共同表达引起 了对所有检查的aS蛋白质的相似程度的aS水平降低。当比较a-突触核蛋白稳态方面 的改变和平行加载的重组a-突触核蛋白蛋白质的良好表征的水平时，估计的是，组织蛋 白酶D过量表达(在5iig/10cm皿的cDNA浓度下)产生了细胞内a-突触核蛋白水平，对 于A30P、 E46K、 A53T、 S129D或S129Aa S多肽，分别是相关的对照水平的23. 98+/_3. 57%、 33. 08+/-18. 51%、39. 21+/-14. 63%、34. 84+/-11. 36%和34. 31+/-13. 39% (n = 2(_3)，来 自2-3个独立实验)。 这个结果表明，(a)组织蛋白酶D也能够降解在家族性PD中存在的a S的突变形 式，以及(b) aS的Ser 129残基处的磷酸化或脱磷酸化不改变由组织蛋白酶D对a S展现 的蛋白水解的("突触核蛋白酶")活性。 值得注意的，aS的残基D98和Q99代表了在伴侣蛋白介导的自体吞噬(CMA)期间 由Lamp2a受体识别的基序；Cuervo等，2004， Science, vol 305，pp 1292-1295)。为了研究 这种基序在组织蛋白酶D诱导的aS降低作用方面的重要性，MES 23.5细胞也用编码突变 a S变体的cDNA(O. 5 y g/10cm皿)转染，其中D98和Q99残基都通过定点诱变改变为丙氨 酸(即，a S的DQ/AA变体)。当比较DQ/AA- a S稳态方面的改变与平行加载的重组a _突 触核蛋白蛋白质的良好表征的水平时，估计的是，组织蛋白酶D过量表达(5iig/10cm皿)
28产生了是载体对照水平的22. 14+/-5. 32%的细胞内DQ/AA a S水平(n = 3，来自3个独立
实验；未显示)。根据这些结果，看起来a-突触核蛋白也通过lamp2a介导的CMA以外的
方法进入溶酶体，或者组织蛋白酶D展现了和/或诱导了溶酶体外活性突触核蛋白酶活性。 实施例9:组织蛋白酶F的表达降低a-突触核蛋白蛋白质水平 在实施例6中描述的系统被用于检查另一种溶酶体组织蛋白酶，S卩，组织蛋白酶
F，对共转染的aS水平的影响。 MES23. 5细胞转染了 0. 5ii g/10cm皿的aS编码SCNA cDNA质粒、加5 ii g/10cm皿 的人类组织蛋白酶F编码人类CTSF质粒，其购自OriGene Technologies, Inc.，处在CMV启 动子的控制下。在分离和maxipr印之后，组织蛋白酶F克隆被全序列证实。转染后24小 时，细胞被裂解，通过夹心ELISA分析溶胞产物。 转染后二十四小时，共同表达的人类组织蛋白酶F蛋白质降低了细胞内a-突触 核蛋白蛋白质浓度，如通过夹心ELISA所测量的。当比较a-突触核蛋白稳态水平方面的改 变与平行加载的重组a-突触核蛋白蛋白质的良好表征的水平时，估计的是，组织蛋白酶F 过量表达(5iig/10cm皿)产生了对照水平的51.7+/_14. 1%的细胞内a-突触核蛋白水平 (n二3，来自2个独立实验)。 为了确认组织蛋白酶F对降低a S的效果是特异性的，而不是由细胞完整性方面 一般性的降低所引起，对用组织蛋白酶F编码CTSFcDNA共转染(5y g/10cm皿)的MES-syn 细胞进行LDH分析。使用O. l%Trit0n-X 100的细胞的裂解充当细胞毒性的阳性对照，促 进最大的细胞死亡。用组织蛋白酶F共转染的MES-syn细胞展现了小于或等于对照载体转 染的细胞的LDH信号(数据来自2个独立实验，未显示)。
实施例10 :提高的GBA活性防止小鼠模型中a -突触核蛋白的积累
其中野生型人类a-突触核蛋白蛋白质在脑部适中地过度产生的小鼠模型被用 作脑部细胞体中a-突触核蛋白蛋白质积累的模型。中枢神经系统中的GBA活性水平通过 用isofagomine (IFG)或isofagomine样物质处理小鼠，或通过在小鼠中施用或过量表达 GBA蛋白质来提高，isofagomine是一种已经显示了在小鼠和人类中提高GBA活性的亚氨基 糖(Lieberman R等.，(2007) Nat Chem Biol. Feb ;3(2) :101-7.)。提高的GBA活性防止了 中枢和/或外周神经系统的神经细胞中a-突触核蛋白蛋白质的年龄依赖性的积累。
实施例11 :提高的GBA活性提供了帕金森病小鼠模型中的治疗效果
通过显示在测试动物的脑中a -突触核蛋白聚集物的降低的积累，神经元中提高 的GBA活性的治疗效果在新的家族性帕金森氏病模型C3H-Tg (SNCA) 83Vle中确认了 。这种 小鼠模型表达处于小鼠朊病毒(prnp)蛋白质启动子的控制下的突变的A53T人类a -突触 核蛋白。prnp启动子已经显示了在中枢神经系统的大多数神经元中实现高水平的基因表 达。到8月龄，纯合的B6 ;C3H-Tg (SNCA) 83Vle小鼠开始发展进行性的表型和年龄依赖性的 胞质内神经元包含物，类似于在患有突触核蛋白病的患者中所见的那些。提高GBA活性防 止了脑部细胞体中a-突触核蛋白的年龄依赖性积累，并且降低了疾病表型。
实施例12 :提高的组织蛋白酶D活性防止小鼠模型中a-突触核蛋白的积累
其中野生型或突变体人类a-突触核蛋白蛋白质在脑部适中地过度产生的小鼠 模型可被用作人类脑部细胞体中a-突触核蛋白蛋白质积累的模型。组织蛋白酶D活性通 过全身地处理小鼠，或通过用组织蛋白酶D活性的小分子活化物或稳定剂的脑部或脑功能区定位地(stereotactically)输注，或通过体内施用或过量表达组织蛋白酶D蛋白质或它 的前蛋白原来提高。提高的组织蛋白酶D活性防止了脑部细胞体中a-突触核蛋白蛋白质 的年龄依赖性积累。当然，相同的测试可以使用其他组织蛋白酶多肽、前多肽和用编码它们 的多核苷酸来进行。 实施例13 :提高的组织蛋白酶D活性提供了帕金森病小鼠模型中的治疗效果
通过显示在测试动物的脑中a-突触核蛋白聚集物的降低的积累，神经元中提高 的组织蛋白酶D活性的治疗效果在新的家族性帕金森氏病模型C3H-Tg(SNCA)83Vle中确认 了。这种小鼠模型表达处于小鼠朊病毒(prnp)蛋白质启动子的控制下的突变的A53T人类 a-突触核蛋白。prnp启动子已经显示了在中枢神经系统的大多数神经元中实现高水平的 基因表达。到8月龄，纯合的B6 ;C3H-Tg(SNCA)83Vle小鼠开始发展进行性的表型和年龄依 赖性的胞质内神经元包含物，类似于在患有a突触核蛋白病的患者中所见的那些。提高的 组织蛋白酶D活性防止了脑部细胞体中a-突触核蛋白的年龄依赖性积累，并且降低了疾 病表型。当然，这个模型可以用于按照类似方式测试其他组织蛋白酶。
其他实施方式 已经描述了本发明的许多实施方式。尽管如此，要理解的是，可以进行各种修改而 不背离本发明的精神和范围。因此，其他实施方式在以下的权利要求的范围之内。
权利要求
一种治疗患有突触核蛋白病、而不患有临床上诊断的溶酶体贮积病的受试者的方法，所述方法包括以有效降低所述受试者的中枢或外周神经系统、或这两者中、或受试者的溶酶体区室中α-突触核蛋白的水平的量向受试者施用以下的任何一种或更多种酸性β-葡糖脑苷脂酶(GBA)多肽，编码酸性β-葡糖脑苷脂酶(GBA)多肽的多核苷酸，GBA多肽活化多肽，编码GBA多肽活化试剂的多核苷酸，组织蛋白酶D多肽，组织蛋白酶原D多肽，和编码组织蛋白酶D或组织蛋白酶原D多肽的多核苷酸。
2. 权利要求1的方法，其中所述突触核蛋白病是原发的突触核蛋白病。
3. 权利要求2的方法，其中所述突触核蛋白病包括以下的任何一种或更多种帕金森 氏病(PD);散发的或可遗传的Lewy体痴呆(DLB);伴有突触核蛋白沉积的纯自主神经衰竭 (PAF);多系统萎縮症(MSA);伴有脑部铁积累的遗传性神经变性；和老年的偶发的Lewy体 疾病。
4. 权利要求l的方法，其中所述突触核蛋白病是继发性的突触核蛋白病。
5. 权利要求4的方法，其中所述突触核蛋白病包含以下的任何一种或更多种Lewy体 变体的阿尔茨海默氏病；Down' s综合征；进行性核上麻痹；Lewy体特发性震颤；有或者没 有痴呆的家族性帕金森氏综合征；有或者没有帕金森氏综合征的tau基因和progra皿lin 基因关联的痴呆；克-雅病；牛海绵状脑病；继发性的帕金森病；由神经毒素暴露引起的帕 金森氏综合征；伴有a-突触核蛋白沉积的药物诱发的帕金森氏综合征；散发的或可遗传 的脊髓小脑性共济失调；肌萎縮性侧索硬化(ALS);和自发性的的快速眼动睡眠行为失常。
6. 权利要求l的方法，其中所述GBA活化多肽包含皂化蛋白原多肽、皂化蛋白A多肽、 皂化蛋白B多肽、皂化蛋白C多肽和皂化蛋白D多肽的任何一种或更多种。
7. 权利要求6的方法，其中所述GBA活化多肽包含皂化蛋白C多肽。
8. 权利要求l的方法，其中编码GBA活化多肽的多核苷酸包含编码皂化蛋白原多肽、皂 化蛋白A多肽、皂化蛋白B多肽、皂化蛋白C多肽和皂化蛋白D多肽的任何一种或更多种的 多核苷酸。
9. 权利要求l的方法，进一步包括施用一种或更多种提高a-突触核蛋白复合物的自 体吞噬的试剂。
10. 权利要求9的方法，其中所述试剂包含mT0R抑制物。
11. 权利要求9的方法，其中所述试剂包含雷帕霉素或雷帕霉素类似物。
12. 权利要求9的方法，其中所述试剂包含依维莫司、环孢菌素、FK506、 hsc70、 N-辛 基-4-印i-P -井冈霉烯胺和甘油的一种或更多种。
13. 权利要求9的方法，其中所述试剂包含小分子、大分子、肽、抗体、核酸或其生物学 活性片段。
14. 以下任何一种或更多种在制备用于突触核蛋白病治疗的药物的方法中的用途 酸性P _葡糖脑苷脂酶(GBA)多肽，编码酸性13 -葡糖脑苷脂酶(GBA)多肽的多核苷酸，GBA多肽活化多肽，编码GBA多肽活化试剂的多核苷酸，组织蛋白酶D多肽，组织蛋白酶原D多肽，禾口编码组织蛋白酶D或组织蛋白酶原D多肽的多核苷酸。
全文摘要
本发明一般地涉及在临床上未诊断为溶酶体贮积病的受试者中治疗突触核蛋白病，以及相关的制造药物的方法和筛选方法。
文档编号A01N43/62GK101754682SQ200880025136
公开日2010年6月23日 申请日期2008年5月16日 优先权日2007年5月16日
发明者L·施哈布丁, M·施罗斯-马赫, S·H·程, V·库伦 申请人:布里格姆妇女医院