微管蛋白抑制剂及其制备方法

专利名称：微管蛋白抑制剂及其制备方法
技术领域：
本文描述的本发明涉及微管蛋白抑制剂(tubulysins)和微管蛋白抑制剂的类似 物，和制备微管蛋白抑制剂和微管蛋白抑制剂的类似物的方法。
背景技术：
微管蛋白抑制剂是一组微管蛋白聚合作用的强力抑制剂。微管蛋白抑制剂用于治 疗包括致病细胞群的疾病和疾病状态，诸如癌症。通常，微管蛋白抑制剂为由示于下表的 N-甲基哌啶酸(Mep)、异亮氨酸(He)、称为微管缬氨酸(tubuvalin) (Tuv)的非天然氨基 酸，以及或者称为微管酪氨酸(tubutyrosine) (Tut，酪氨酸的类似物)的非天然氨基酸或 者称为微管苯丙氨酸(tubuphenylalanine) (Tup，苯丙氨酸的类似物)的非天然氨基酸组
成的线性四肽 两种特别的分枝杆菌在发酵过程中合成高滴度的微管蛋白抑制剂。然而，每种细 菌一般合成微管蛋白抑制因子的混合物，并且该混合物与那些分枝杆菌的每一菌种都不 同。例如，一种细菌，过渡型原囊粘菌(Archangium g印hyra)，产生作为主要成分因子的微 管蛋白抑制剂A、B、C、G和I，可通过其包含的Tut残基鉴定其中的每一种。作为对比，另一 种细菌，碟形囊球粘菌(Angiococcusdisciformis)，产生作为主要成分因子的微管蛋白抑 制剂D、E、F和H，可通过其包含的Tup残基鉴定其中的每一种。这样的细菌发酵物是微管蛋白抑制剂的方便来源。然而，由于分枝杆菌仅产生某 些微管蛋白抑制剂和/或微管蛋白抑制剂的混合物，需要经过内部转化将那些微管蛋白抑 制剂变成想要的医疗和药理应用的因子的方法。此外，需要制备医疗和药理应用的新颖微 管蛋白抑制剂、微管蛋白抑制剂的类似物和微管蛋白抑制剂衍生物的方法。发明简述本文描述制备微管蛋白抑制剂的方法。本文描述的还有微管蛋白抑制剂的类似物 和衍生物。在一个实施方案中，描述了从微管蛋白抑制剂的混合物，诸如由发酵或某些其 它方法产生的微管蛋白抑制剂的混合物，制备一种或多种微管蛋白抑制剂的方法。在另一 个实施方案中，本文描述了从一种或多种微管蛋白抑制剂制备微管蛋白抑制剂混合物的方 法。在另一个实施方案中，本文描述了将一种微管蛋白抑制剂转化为另一种微管蛋白抑制 剂的方法。在另一个实施方案中，本文描述了将一种或多种微管蛋白抑制剂，或微管蛋白抑 制剂的混合物，转化为一种或多种微管蛋白抑制剂的类似物，或微管蛋白抑制剂类似物的 混合物的方法。应该理解的是，如在本文所用的，术语微管蛋白抑制剂共同地和单独地均指 天然存在的微管蛋白抑制剂和本文描述的或可自本文描述的方法制备的微管蛋白抑制剂 的类似物和衍生物。在另一个实施方案中，本文描述了新的微管蛋白抑制剂、微管蛋白抑制剂的类似 物和微管蛋白抑制剂衍生物，以及制备这样的新的微管蛋白抑制剂、微管蛋白抑制剂的类 似物和微管蛋白抑制剂衍生物的方法。在一个实施方案中，所述方法包括用酸处理一种或 多种微管蛋白抑制剂以制备中间体。在另一个实施方案中，所述方法包括随后使中间体与 试剂反应，以从不同的微管蛋白抑制剂的混合物制备微管蛋白抑制剂的混合物、从微管蛋 白抑制剂的混合物制备单一的微管蛋白抑制剂、从单一的微管蛋白抑制剂制备微管蛋白抑 制剂的混合物，或从不同的微管蛋白抑制剂制备单一的微管蛋白抑制剂的步骤。在本文描述的方法的一个实施方案中，中间体是式(la)、(Ib)或(Ic)化合物 其中R、R1、S、T、U、V、W、Y和Z如下文在多个实施方案、方面及其变化中描述。应该理解的是，式(la)、(lb)和(Ic)中间体化合物可形成盐，诸如与残留酸 (residual acid)共轭碱的所成的盐。此外，应该理解的是，亚胺盐(iminium)中间体，诸如 那些式(la)、(Ib)和(Ic)的中间体也可与相应的酰基缩醛胺平衡，其中残酸共轭碱被加至 亚胺盐中间体中。还应该认识到的是，亚胺盐中间体可形成溶剂化物或水合物，其每一个可 与亚胺盐中间体平衡。在任何情况下，不受理论的束缚，相信亲核试剂，诸如RCN、RXH和相 应的阴离子及其盐与亚胺盐中间体反应(不论亚胺盐是否呈现盐、水合物、溶剂化物或酰 基缩醛胺形式)，制备本文描述的化合物，诸如分别为式(2a)、(2b)和(2c)化合物 其中R、R1、R10, S、Τ、U、V、W、Y和Z如下文在多个实施方案、方面及其变化中描述。发明详述本文描述的是使单一的微管蛋白抑制剂或微管蛋白抑制剂化合物的混合物转化 单一的微管蛋白抑制剂化合物或不同的微管蛋白抑制剂化合物的混合物的方法。在一个实 施方案中，本文描述的微管蛋白抑制剂一般指下式的四肽化合物 及其药用盐，此处η 是 1-3 ；V是H、0R2或卤代，而W是H、OR2或烷基，此处R2在每种情况下独立选自H、烷基和 C (0) R3，此处R3是烷基、环烷基、链烯基、芳基或芳烷基，其各自被任选取代；前提是当V和W 都是OR2时，则R2不是H ；或V和W与所连接的碳结合在一起，形成羰基；X = H、(V4烷基、链烯基，其各自被任选取代，或CH2QR9 ；此处Q是-N-、_0-或-S-； R9 = H、CV4烷基、链烯基、芳基或C(O) R10 ；和R10 = CV6烷基、链烯基、芳基或杂芳基；Z是烷基而Y是0 ；或Z是烷基或C (0) R4，而Y不存在，此处R4是烷基、CF3或芳基；R1是H，或R1表示1-3个取代基，所述取代基选自商代、硝基、羧酸基或其衍生物、 氰基、羟基、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、苯酚保护基团、前药部分和0R6，此处R6是 任选取代的芳基、C(0)R7、P(0) (OR8) 2或SO3R8,此处R7和R8在每种情况下独立选自H、烷基、 链烯基、环烷基、杂环基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代，或R8是金属阳离子；且R是OH或离去基团，或R形成羧酸衍生物。在一个变化中，Z是甲基。在另一个变化中，R1是H。在另一个变化中，R1是在C (4) 的OR6，此处R6是H、烷基或COR7。在另一个变化中，V是H而W是OC (O)R3。作为例证的离去基团包括，但不限于卤化物、磺酸盐，诸如三氟甲磺酸盐等、任选 取代的苯氧基，诸如五氟苯氧基等、自酯形成试剂或胺形成试剂形成的中间体，诸如氯甲酸 异丁酯、DCC、HOBt, EDC、PyBOP, BOP, BOP-Cl 等。
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作为例证的羧酸衍生物包括，但不限于酯、酰胺、酰亚胺、酰基酰胼 (acylhydrazides)、腈，及其任选取代的变体。在另一个实施方案中，描述了以下以下通式的微管蛋白抑制剂
η 是 1-3 ；V是H、0R2或卤代，而W是H、OR2或烷基，此处R2在每种情况下独立选自H、烷基或 C (0) R3,此处R3是烷基、链烯基或芳基，前提是当V和W都是OR2时，则R2不是H ；或V和W 与所连接的碳结合在一起，形成羰基；X = H、(V4烷基、链烯基，其各自被任选取代，或CH2QR9 ；此处Q是-N-、_0-或-S-； R9 = H、CV4烷基、链烯基、芳基或C(O) R10 ；和R10 = CV6烷基、链烯基、芳基或杂芳基；Z是烷基或C (0) R4,此处R4是烷基、CF3或芳基；T是H或0R6，此处R6是H、烷基、芳基、COR7、P (0) (OR8) 2或SO3R8,此处R7和R8在每 种情况下独立选自H、烷基、链烯基、环烷基、杂环基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代，或 R8是金属阳离子或R6是苯酚保护基团，或前药部分；S和U各自独立选自H、卤代、硝基、氰基、烷基、卤代烷基、烷氧基和卤代烷氧基；和R是OH或离去基团，或R形成羧酸衍生物。在一个实施方案中，描述了天然微管蛋白抑制剂及其相应的类似物和衍生物。这 样的天然微管蛋白抑制剂一般为由N-甲基哌啶酸(Mep)、异亮氨酸(lie)、称为微管缬氨酸 (Tuv)的非天然氨基酸，以及或者称为微管酪氨酸(Tut，酪氨酸的类似物)的非天然氨基酸 或者称为微管苯丙氨酸(Tup，苯丙氨酸的类似物)的非天然氨基酸组成的线性四肽。在另 一个实施方案中，描述了天然存在的以下通式的微管蛋白抑制剂及其类似物和衍生物 及其药用盐，此处R、R1和Rw如在本文多个实施方案中描述。在一个实施方案中，通过制备式(Ia)中间体化合物，使第一种微管蛋白抑制剂或 作为备选的微管蛋白抑制剂的混合物转化为第二种微管蛋白抑制剂，其中η 是 1-3 ；V是H、0R2或卤代，而W是H、OR2或烷基，此处R2在每种情况下独立选自H、烷基和 C(O)R3,此处R3是各自被任选取代的烷基、环烷基、链烯基、芳基或芳烷基；前提是当V和W 都是OR2时，则R2不是H ；或V和W与所连接的碳结合在一起，形成羰基；X = H、(V4烷基、链烯基，其各自被任选取代，或CH2QR9 ；此处Q是-N-、_0-或-S-；R9 = H、CV4烷基、链烯基、芳基或C(O) R10 ；和R10 = CV6烷基、链烯基、芳基或杂芳基；Z是烷基而Y是0 ；或Z是烷基或C (0) R4，而Y不存在，此处R4是烷基、CF3或芳基；R1是H，或R1表示1-3个取代基，所述取代基选自商代、硝基、羧酸基或其衍生物、 氰基、羟基、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、苯酚保护基团、前药部分和0R6，此处R6是 任选取代的芳基、C(0)R7、P(0) (OR8) 2或SO3R8,此处R7和R8在每种情况下独立选自H、烷基、 链烯基、环烷基、杂环基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代，或R8是金属阳离子；且R是OH或离去基团，或R形成羧酸衍生物。通过在基本无水的条件下将式(2b)微
管蛋白抑制剂或微管蛋白抑制剂的混合物与酸混合制备中间体 及其药用盐，此处η 是 1-3 ；V是H、0R2或卤代，而W是H、OR2或烷基，此处R2在每种情况下独立选自H、烷基和 C(O)R3,此处R3是各自被任选取代的烷基、环烷基、链烯基、芳基或芳烷基；前提是当V和W 都是OR2时，则R2不是H ；或V和W与所连接的碳结合在一起，形成羰基；X = H、(V4烷基、链烯基，其各自被任选取代，或CH2QR9 ；此处Q是-N-、_0-或-S-； R9 = H、CV4烷基、链烯基、芳基或C(O) R10 ；和R10 = CV6烷基、链烯基、芳基或杂芳基；Z是烷基而Y是0 ；或Z是烷基或C (0) R4，而Y不存在，此处R4是烷基、CF3或芳基；R1是H，或R1表示1-3个取代基，所述取代基选自商代、硝基、羧酸基或其衍生物、 氰基、羟基、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、苯酚保护基团、前药部分和0R6，此处R6是 任选取代的芳基、C(0)R7、P(0) (OR8) 2或SO3R8,此处R7和R8在每种情况下独立选自H、烷基、 链烯基、环烷基、杂环基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代，或R8是金属阳离子；且R是OH或离去基团，或R形成羧酸衍生物。然后用式RkiCO2H化合物处理式(Ia)中间体化合物，此处Rltl不同于如在用于制备 第二种式(2a)化合物的第一种微管蛋白抑制剂中存在的R1(l。在一个变化中，Z是甲基。在另一个变化中，R1是H。在另一个变化中，R1是在C(4) 的OR6，此处R6是H、烷基或COR7。在另一个变化中，V是H而W是OC(O)R3。在另一个变化 中，R是0H。在另一个变化中，R形成酯衍生物。在另一个变化中，R形成酰胺衍生物。在 另一个变化中，R形成酰基酰胼衍(acylhydrazide)生物，诸如自胼形成的化合物。在另一个实施方案中，通过制备式(Ib)中间体化合物，使第一种微管蛋白抑制剂 或作为备选的微管蛋白抑制剂的混合物，转化为第二种微管蛋白抑制剂，其中V是H、0R2或 卤代，而W是H、OR2或烷基，此处R2在每种情况下独立选自H、烷基或C0R3，此处R3是烷基、 链烯基或芳基，前提是当V和W都是OR2时，则R2不是H ；或V和W与所连接的碳结合在一 起，形成羰基；Z是CH3或C0R4，而Y不存在；或Z是CH3,且Y是0 ；此处R4是烷基、CF3或芳 基；T是H或OR6,此处R6是H、烷基、芳基、COR7、P (0) (OR8) 2或SO3R8,此处R7和R8在每种情 况下独立选自H、烷基、链烯基、环烷基、杂环基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代，或R8是金属阳离子；且S和U各自独立选自H、卤代、硝基、氰基、烷基、卤代烷基、烷氧基和卤代烷 氧基，或其相应的羧酸衍生物，此处R不是0H。通过在基本无水的条件下，使式(2b)微管蛋 白抑制剂或微管蛋白抑制剂的混合物与酸混合制备中间体
其中Rltl是H、烷基、链烯基、环烷基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代；V是H、0R2 或卤代，而W是H、OR2或烷基，此处R2在每种情况下独立选自H、烷基或C0R3，此处R3是烷 基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基，其各自被任选取代，前提是当V和W都是OR2时，则R2不 是H ；或V和W与所连接的碳结合在一起，形成羰基；Z是CH3或C0R4，而Y不存在；或Z是 CH3,且Y是0 ；此处R4是烷基、CF3或芳基；T是H或OR6,此处R6是H、烷基、芳基、C0R7、P (0) (OR8) 2或SO3R8,此处R7和R8在每种情况下独立选自H、烷基、链烯基、环烷基、杂环基、芳基 和芳烷基，其各自被任选取代，或R8是金属阳离子；且S和U各自独立选自H、卤代、硝基、氰 基、烷基、卤代烷基、烷氧基和卤代烷氧基，或其相应的羧酸衍生物，此处R不是0H。然后，用 式RkiCO2H化合物处理式(Ib)中间体化合物，此处Rltl不同于如在制备式(2b)第二种化合 物的第一种微管蛋白抑制剂的R"1。在另一个实施方案中，通过制备式(Ic)中间体化合物，使第一种微管蛋白抑制剂 或微管蛋白抑制剂的混合物转化为第二种微管蛋白抑制剂，其中T是H或0H。通过在基本 无水的条件下，使式(2c)微管蛋白抑制剂或微管蛋白抑制剂的混合物与酸混合，制备中间 体
(2c)其中T是H或OH和Rltl是H、烷基、链烯基、环烷基、芳基和芳烷基，其各自被任选 取代，或其相应的羧酸衍生物，此处R不是0H。然后用式RkiCO2H化合物处理式(Ic)中间体 化合物，此处Rltl不同于如存在于用于制备式(2c)第二种化合物的起始微管蛋白抑制剂中 的R1。在前述的各个实施方案中，应该理解的是，在某些构型中，微管蛋白抑制剂可转化 为不同的微管蛋白抑制剂的混合物，而不是转化为单一的微管蛋白抑制剂。在这样的实施 方案中，单一的起始微管蛋白抑制剂或微管蛋白抑制剂的混合物，可首先转化为普通的式 (la), (Ib)或(Ic)中间体化合物或这些中间体化合物的混合物，然后将这些中间体化合物 与羧酸混合物反应，以提供想要的微管蛋白抑制剂的混合物。例如，如果需要微管蛋白抑制 剂B和C或其相应的类似物或衍生物的混合物，单一的起始微管蛋白抑制剂，诸如微管蛋白抑制剂A或其相应的类似物或衍生物或作为备选的微管蛋白抑制剂的混合物，可首先转化 为相应的式(la)、(lb)或(Ic)化合物，其中T是0H，然后与羧酸，诸如分别相应于微管蛋 白抑制剂B和C上的适当的基团的丁酸和丙酸的混合物反应。应该认识到的是，可产生基 于用于第二个步骤的相对比例的羧酸统计学上的混合物。或者，还应该认识到的是，动力学 和热力学因素可影响在第二个步骤中获得的微管蛋白抑制剂的最终的比例，从而将不产生 基于羧酸比率的统计学上的微管蛋白抑制剂的混合物。在另一种情况下，应该理解的是，常 规最佳的相对比率的羧酸混合物将从普通的式(la)、(lb)和(Ic)中间体提供想要的微管 蛋白抑制剂的混合物。在另一个实施方案中，可用式R9QH化合物或由其制备的阴离子处理式(Ib)中间
体化合物，以得到下式化合物 其中Q是-N-、-0-或-S- ；R9是H、烷基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基，其各自被 任选取代，或R9是C(O)R20、S(O)2R20或P(O) (OR20)2 ；此处R20在每种情况下独立选自H、烷 基、链烯基、环烷基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代，或R2°是金属阳离子；V是H、OR2或 卤代，而W是H、0R2或烷基，此处R2在每种情况下独立选自H、烷基或C0R3，此处R3是各自被 任选取代的烷基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基，前提是当V和W都是OR2时，则R2不是H ； 或V和W与所连接的碳结合在一起，形成羰基。Z是CH3或C0R4，而Y不存在；或Z是CH3,且 Y是0 ；此处R4是烷基、CF3或芳基；T是H或OR6,此处R6是H、烷基、芳基、COR7、P (0) (OR8) 2 或SO3R8,此处R7和R8在每种情况下独立选自H、烷基、链烯基、环烷基、杂环基、芳基和芳烷 基，其各自被任选取代，或R8是金属阳离子；且S和U各自独立选自H、卤代、硝基、氰基、烷 基、卤代烷基、烷氧基和卤代烷氧基或其相应的羧酸衍生物，此处R不是0H。在另一个实施方案中，可用式R9QH化合物或其阴离子处理式(Ic)中间体化合物，
以得到下式化合物
任选取代，或R9是C(0)R2°、S(0)2R2°或P(O) (OR20)2 ；此处R2tl在每种情况下独立选自H、烷基、 链烯基、环烷基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代，或R2°是金属阳离子；且T是H或OH或 其相应的羧酸衍生物，此处R不是0H。 应该理解的是，可经由相应的式(Ia)中间体和R9QH类似地制备相应的式(2a)化
12合物。在另一个实施方案中，可用腈化合物，R21CN处理式(Ib)中间体化合物，以得到下
式化合物 其中R21是各自被任选取代的烷基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基；V是H、OR2或 卤代，而W是H、0R2或烷基，此处R2在每种情况下独立选自H、烷基或C0R3，此处R3是各自被 任选取代的烷基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基，前提是当V和W都是OR2时，则R2不是H ； 或V和W与所连接的碳结合在一起，形成羰基。Z是CH3或C0R4，而Y不存在；或Z是CH3,且 Y是0 ；此处R4是烷基、CF3或芳基；T是H或OR6,此处R6是H、烷基、芳基、COR7、P (0) (OR8) 2 或SO3R8,此处R7和R8在每种情况下独立选自H、烷基、链烯基、环烷基、杂环基、芳基和芳烷 基，其各自被任选取代，或R8是金属阳离子；且S和U各自独立选自H、卤代、硝基、氰基、烷 基、卤代烷基、烷氧基和卤代烷氧基或其相应的羧酸衍生物，此处R不是0H。在另一个实施方案中，可用腈化合物，R21CN处理式(Ic)中间体化合物，以得到下 式化合物 其中R21是各自被任选取代的烷基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基，和T是H或0H， 或其相应的羧酸衍生物，此处R不是0H。应该理解的是，可经由相应的式(Ia)中间体和R21CN类似地制备相应的式(2a)化 合物。在另一个实施方案中，可用式R22 (TMS) CCH2的链烯基硅烷处理式(Ib)中间体化合
物，以得到下式化合物 其中R22是各自被任选取代的烷基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基；V是H、OR2或 卤代，而W是H、0R2或烷基，此处R2在每种情况下独立选自H、烷基或C0R3，此处R3是各自被任选取代的烷基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基，前提是当V和W都是OR2时，则R2不是H ； 或V和W与所连接的碳结合在一起，形成羰基；Z是CH3或C0R4，而Y不存在；或Z是CH3,且 Y是0 ；此处R4是烷基、CF3或芳基；T是H或OR6,此处R6是H、烷基、芳基、COR7、P (0) (OR8) 2 或SO3R8,此处R7和R8在每种情况下独立选自H、烷基、链烯基、环烷基、杂环基、芳基和芳烷 基，其各自被任选取代，或R8是金属阳离子；且S和U各自独立选自H、卤代、硝基、氰基、烷 基、卤代烷基、烷氧基和卤代烷氧基，或其相应的羧酸衍生物，此处R不是0H。
在另一个实施方案中，可用式R22 (TMS) CCH2的链烯基硅烷处理式(Ic)中间体化合 物，以得到下式化合物 其中R22是各自被任选取代的烷基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基；和T是H或0H， 或其相应的羧酸衍生物，此处R不是0H。应该理解的是，可经由相应的式(Ia)中间体和R22 (TMS)CCH2类似地制备相应的式 (2a)化合物。应该理解的是，在前述的实施方案中，可通过异构化作用形成其它烯烃，这取决于 反应条件和R22的特性。例如，当R22是烷基时，应该认识到的是，在反应条件下，双键可沿着 链烯基链迁移至其它碳原子，包括形成末端或ω-烯烃。在另一个实施方案中，用式R23C(O)CH2Ra化合物处理式(Ib)中间体化合物，以得到 下式化合物 其中R23是H、烷基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基，其各自被任选取代；Ra是C(O) R9> C(O)OR9或CN ；R9选自H、烷基、链烯基、环烷基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代；V是 H、OR2或卤代，而W是H、OR2或烷基，此处R2在每种情况下独立选自H、烷基或C0R3，此处R3 是各自被任选取代的烷基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基，前提是当V和W都是OR2时，则 R2不是H ；或V和W与所连接的碳结合在一起，形成羰基；Z是CH3或C0R4，而Y不存在；或 Z是CH3,且Y是0 ；此处R4是烷基、CF3或芳基；T是H或0R6，此处R6是H、烷基、芳基、C0R7、 P(O) (OR8) 2或SO3R8,此处R7和R8在每种情况下独立选自H、烷基、链烯基、环烷基、杂环基、 芳基和芳烷基，其各自被任选取代，或R8是金属阳离子；且S和U各自独立选自H、卤代、硝 基、氰基、烷基、卤代烷基、烷氧基和卤代烷氧基，或其相应的羧酸衍生物，此处R不是0H。在另一个实施方案中，用式R23C(O)CH2Ra化合物处理式(Ic)中间体化合物，以得到下式化合物
其中R23是H、烷基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基，其各自被任选取代；Ra是C(O) R9> C(O)OR9或CN ；R9选自H、烷基、链烯基、环烷基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代；和T 是H或0H，或其相应的羧酸衍生物，此处R不是0H。应该理解的是，可经由相应的式(Ia)中间体和R23C(O)CH2Ra类似地制备相应的式 (2a)化合物。在另一个实施方案中，用水处理式(Ib)中间体化合物，以得到下式(3b)的第二种
中间体化合物。 其中V是H、0R2或卤代，而W是H、OR2或烷基，此处R2在每种情况下独立选自H、烷 基或C0R3，此处R3是各自被任选取代的烷基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基，前提是当V和 W都是OR2时，则R2不是H ；或V和W与所连接的碳结合在一起，形成羰基；Z是CH3或C0R4， 而Y不存在；或Z是013，且￥是0;此处R4是烷基、CF3或芳基；T是H或0R6，此处R6是H、 烷基、芳基、C0R7、P(0) (OR8)2或SO3R8,此处R7和R8在每种情况下独立选自H、烷基、链烯基、 环烷基、杂环基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代，或R8是金属阳离子；且S和U各自独立 选自H、商代、硝基、氰基、烷基、商代烷基、烷氧基和商代烷氧基，或其相应的羧酸衍生物，此 处R不是0H。在另一个实施方案中，用水处理式(Ic)中间体化合物，以得到式(3c)第二种中间
体化合物物。
其中T是H或0H，或其相应的羧酸衍生物，此处R不是0H。
应该理解的是，可经由相应的式(Ia)中间体和水类似地制备相应的式(3a)化合
在另一个实施方案中，用卤化剂、磺酰化剂、膦酰化剂或磷酰化剂处理式(3b)中间体化合物，以得到下式化合物
其中X3 是卤素、OS(O)2R24, OP(O) (OR24)R24 或 OP(O) (OR24)2 ；此处 R24 在每种情况下 独立选自H、烷基、链烯基、环烷基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代，或R24是金属阳离子； V是H、OR2或卤代，而W是H、OR2或烷基，此处R2在每种情况下独立选自H、烷基或C0R3，此 处R3是各自被任选取代的烷基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基，前提是当V和W都是OR2时， 则R2不是H ；或V和W与所连接的碳结合在一起，形成羰基；Z是CH3或C0R4，而Y不存在；或 Z是CH3,且Y是0 ；此处R4是烷基、CF3或芳基；T是H或0R6，此处R6是H、烷基、芳基、C0R7、 P(O) (OR8) 2或SO3R8,此处R7和R8在每种情况下独立选自H、烷基、链烯基、环烷基、杂环基、 芳基和芳烷基，其各自被任选取代，或R8是金属阳离子；且S和U各自独立选自H、卤代、硝 基、氰基、烷基、卤代烷基、烷氧基和卤代烷氧基，或其相应的羧酸衍生物，此处R不是0H。在另一个实施方案中，用卤化剂、磺酰化剂、膦酰化剂或磷酰化剂处理式(3c)中 间体化合物，以得到下式化合物 其中X3 是卤素、OS (0) 2R24、OP (0) (OR24) R24 或 OP (0) (OR24) 2 ；此处 R24 在每种情况下 独立选自H、烷基、链烯基、环烷基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代，或R24是金属阳离子； 且T是H或0H，或其相应的羧酸衍生物，此处R不是0H。应该理解的是，可经由相应的式(Ia)中间体并用卤化剂、磺酰化剂、膦酰化剂或 磷酰化剂处理，类似地制备相应的式(3a)化合物。在另一个实施方案中，描述了下式(2d)化合物 其中Rltl是H、烷基、环烷基、链烯基、芳基或芳烷基，其各自被任选取代；且T是H 或0Η，或其相应的羧酸衍生物，此处R不是OH ；用三氟乙酸处理之，并且在减压下浓缩该混 合物，以得到中间体亚胺盐化合物。应该理解的是，这样的亚胺盐化合物可以相应的三氟乙 酸盐化合物，及其它的水合物和溶剂化物存在，以及作为如由下式阐述的酰基缩醛胺化合物和其它其它加成加合物存在
使那些式的化合物，或本文描述的其它相应的中间体混合，并通过用TFA和醇处 理(2d)化合物制备，得到相应的下式N，0-缩醛化合物 其中R9是H、烷基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基，其各自被任选取代，或R9是 C(O)R20, S(O)2R2tl或P(O) (OR20)2 ；此处R2tl在每种情况下独立选自H、烷基、链烯基、环烷基、 芳基和芳烷基，其各自被任选取代，或R2°是金属阳离子；和T是H或0H，或其相应的羧酸衍 生物，此处R不是0H。在另一个实施方案中，使式(2d)化合物与三氟乙酸混合，并在减压下浓缩该混合
物，随后使浓缩的混合物与硫醇混合，得到下式N，S-缩醛化合物 其中R9是H、烷基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基，其各自被任选取代，或R9是 C(O)R20、S(O)2R20或P(O) (OR2tl)2，此处R2tl在每种情况下独立选自H、烷基、链烯基、环烷基、 芳基和芳烷基，其各自被任选取代，或R2°是金属阳离子和T是H或0H，或其相应的羧酸衍 生物，此处R不是0H。在另一个实施方案中，使式(2d)化合物与三氟乙酸混合，并在减压下浓缩该混合 物，随后使浓缩的混合物与腈混合，得到下式化合物 其中R21是各自被任选取代的烷基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基，和T是H或0Η， 或其相应的羧酸衍生物，此处R不是0Η。
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在另一个实施方案中，使式(2d)化合物与三氟乙酸混合，并在减压下浓缩该混合 物，随后使浓缩的混合物与酮混合，在Biginelli-型反应中，得到下式化合物 其中R23是H、烷基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基，其可各自被任选取代，Ra是 ((0)矿、((0)( 8或^ R8选自H、烷基、链烯基、环烷基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代， 和T是H或0H，或其相应的羧酸衍生物，此处R不是0H。在另一个实施方案中，使式(2d)化合物与三氟乙酸混合，并在减压下浓缩该混合 物，随后使浓缩的混合物与链烯基硅烷混合，得到下式化合物 其中R22是各自被任选取代的烷基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基；和T是H或0H， 或其相应的羧酸衍生物，此处R不是0H。在另一个实施方案中，使式(2d)化合物与三氟乙酸混合，并在减压下浓缩该混合 物，随后使浓缩的混合物与水混合，得到式(3d)化合物 其在T是OH时也可称为羟基微管蛋白抑制剂D，或当T是OH时称为羟基微管蛋白 抑制剂A，或指其相应的羧酸衍生物，此处R不是0H。在另一个实施方案中，用磺酰卤和碱处理N-羟基甲基微管蛋白抑制剂A或N-羟 基甲基微管蛋白抑制剂D，以得到下式化合物 其中R24是各自被任选取代的烷基、环烷基、链烯基、芳基或芳烷基；和T是H或OH 或其相应的羧酸衍生物，此处R不是0H。
在另一个实施方案中，在亚磷酸三苯酯和咪唑的存在下，用溴或碘处理N-羟基甲 基微管蛋白抑制剂A或N-羟基甲基微管蛋白抑制剂D，以得到下式化合物 其中X4是Br或I ；和T是H或0H，或其相应的羧酸衍生物，此处R不是OH。在另一个实施方案中，描述了下式的微管蛋白抑制剂的共轭物 及其药用盐，此处η是1-3 ；T是H或0R6，此处R6是H、烷基、芳基、C0R7、P (0) (OR8)2 或SO3R8,此处R7和R8在每种情况下独立选自H、烷基、链烯基、环烷基、杂环基、芳基和芳 烷基，其各自被任选取代，或R8是金属阳离子或R6是苯酚保护基团，或前药部分；Z是烷基 或C (0) R4,此处R4是烷基、CF3或芳基；和R是OH或离去基团，或R形成羧酸衍生物。作为 例证的这样的化合物和它们的制备方法的实例在J. Med. Chem. 51，1530-1533(2008)中描 述，该文献的公开通过引用结合于本文。应该理解的是，可在前述式的任何杂原子上通过 除去相应的氢或其它基团形成共轭物，包括，但不限于通过从R(此处R = 0H)、从T (此处 T = OH)等除去氢，形成共轭物。本文描述的共轭物可包括如通常在美国专利申请公布号 2005/0002942 (其公开通过引用结合于本文)中描述的间隔基连接键(spacer linkers)和 /或可除去的连接键(releasable linkers).此外，本文描述的共轭物可包括靶向配体，包 括，但不限于靶向致病细胞群的共轭物的叶酸盐(folate)和叶酸盐的类似物和衍生物，诸 如通常在美国专利申请公布号2005/0002942中描述的那样。在另一个实施方案中，描述了以下通式的微管蛋白抑制剂 及其药用盐，此处η 是 1-3;V是H、0R2或卤代，而W是H、OR2或烷基，此处R2在每种情况下独立选自H、烷基或 COR3,此处R3是烷基、链烯基或芳基，前提是当V和W都是OR2时，则R2不是H ；或V和W与 所连接的碳结合在一起，形成羰基；
X = H、CV4烷基、链烯基，其各自被任选取代，或CH2QR9 ；此处Q是-N-、_0_或_S_ ； R9 = H、CV4烷基、链烯基、芳基或C(O) R10 ；和R10 = CV6烷基、链烯基、芳基或杂芳基；Z是CH3或C0R4，而Y不存在；或Z是CH3,且Y是0 ；此处R4是烷基、CF3或芳基；T是H或OR6，此处R6是H、烷基、芳基、COR7、P (0) (OR8) 2或SO3R8,此处R7和R8在每 种情况下独立选自H、烷基、链烯基、环烷基、杂环基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代，或 R8是金属阳离子；S和U各自独立选自H、卤代、硝基、氰基、烷基、卤代烷基、烷氧基和卤代烷氧基；和R是OH或离去基团，或R形成羧酸衍生物。在美国专利申请公布号2006/0128754 和2005/0239713 (其公开通过引用结合于本文)中描述了另外的微管蛋白抑制剂。在另一个实施方案中，描述了下式的微管蛋白抑制剂 及其药用盐，此处η是1-3 ；T是H或0R6，此处R6是H、烷基、芳基、C0R7、P(0) (OR8)2 或SO3R8,此处R7和R8在每种情况下独立选自H、烷基、链烯基、环烷基、杂环基、芳基和芳烷 基，其各自被任选取代，或R8是金属阳离子，或R6是苯酚保护基团，或前药部分；Z是烷基或 C (0) R4,此处R4是烷基、CF3或芳基；和R是OH或离去基团，或R形成羧酸衍生物。作为例 证的这样的化合物和它们的制备方法的实例在J. Med. Chem. 51，1530-1533(2008)中描述， 该文献的公开通过引用结合于本文。在另一个实施方案中，描述了下式的微管蛋白抑制剂 及其药用盐，此处η、S、Τ、U、V、W、Ζ、R和Rki如在本文的多个实施方案中描述。在另一个实施方案中，描述了下式的微管蛋白抑制剂 及其药用盐，此处n、S、T、U、V、W、Z、QR9和R如在本文的多个实施方案中描述。在 一个变化中，Q是-N-、-0-或-S-；和R9是H、烷基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基，其各自被 任选取代。在另一个变化中，QR9结合在一起形成C (0) R10^S (0) 2R1(i、P (0) (OR10a)2,此处Rw和 ORltla在每种情况下独立选自H、烷基、链烯基、环烷基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代，或Rltla是金属阳离子。在另一个实施方案中，描述了下式的微管蛋白抑制剂 及其药用盐，此处R12表示一个或多个取代基，所述取代基选自各自被任选取代的 烷基、链烯基、环烷基、芳基和芳烷基；且此处η、S、Τ、U、V、W、Z和R如在本文的多个实施方 案中描述。应该理解的是，可通过异构化作用形成其它烯烃，这取决于反应条件和R1的特 性。例如，当R1是烷基时，应该认识到的是，在该反应条件下，双键可沿着链烯基链迁移至 其它碳原子，包括形成末端或ω-烯烃。在另一个实施方案中，描述了下式的微管蛋白抑制剂 及其药用盐，此处R13 是 C (0) R10、C (0) OR10 或 CN ；且此处 η、S、Τ、U、V、W、Ζ、R 和 R10 如在本文的多个实施方案中描述，此处Rki在每种情况下是独立选择的。在另一个实施方案中，描述了下式的微管蛋白抑制剂 及其药用盐，此处η、S、Τ、U、V、W、Z和R如在本文的多个实施方案中描述。在另一个实施方案中，描述了下式的微管蛋白抑制剂及其药用盐，此处X3 是卤素、OS(O)2R10, OP(O) (ORltla)Rltl 或 OP(0) (OR10a)2 ；此处 Rki 和Rltla在每种情况下独立选自H、烷基、链烯基、环烷基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代， 或Ricia是金属阳离子；且此处η、S、Τ、U、V、W、Z和R如在本文的多个实施方案中描述。用于制备本文描述的共轭物的另外的微管蛋白抑制剂，在Peltier等“微管蛋白抑制剂 D 的总合成(The Total Synthesis ofTubulysin D) J. Am. Chem. Soc. 128 16018-19 (2006) ”中描述，其公开在此通过引用结合于本文中。在前述的各个实施方案中，应该理解的是，在一个变化中，各式化合物在指定的不 对称骨架碳原子上具有以下绝对构型 如本文所描述的，微管蛋白抑制剂化合物可为微管蛋白聚合作用的抑制剂，并且 也可为DNA-烷化剂(alkylators)。因此，本文描述了治疗包括致病细胞群的疾病和疾病状 态，诸如癌症的方法。
实施例通用方法经由注射器将三氟乙酸(TFA，0. 20mL)加入到无水二氯甲烷(DCM，0. 80mL)中的微 管蛋白抑制剂混合物(20mg，含微管蛋白抑制剂A、B、C、G、I和羟基微管蛋白抑制剂)的浅 棕色溶液中。于室温和氩气下搅拌40分钟后，向该溶液中加入相应的亲核试剂(例如，但 不限于H20、MeOH、l-丙醇、乙二醇、3-甲基丁醇、丙硫醇、2-硫烷基乙醇、1，2-乙二硫醇 (ethanedithiol)、乙酸、丁酸、反式-4-氯-2- 丁烯酸)，0. 20mL用于所有硫醇而0. 50mL由 于所有其它的，并且于BUchi旋转蒸发仪(BUchi Rotavapor)中减压下浓缩该溶液，然后采 用油泵的方法再浓缩之。将粗产物溶解于二甲基亚砜(DMS0，1.0mL)中，并采用制备型HPLC 纯化，获得白色固体样产物。通用制备型HPLC 参数柱Waters XTerra Prep MS C18 10 μ m，19x250mm ；流动 相A :2. OmM磷酸钠缓冲液，pH 7. 0 ；流动相B 乙腈；方法用30分钟从10% B至80% B，流 速=26mL/min。实施例.天然微管蛋白抑制剂的互变。将TFA(1. OmL)加至微管蛋白抑制剂的混 合物(105mg微管蛋白抑制剂A、B、C、G、I和羟基微管蛋白抑制剂A)于无水DCM(5. OmL)中 的浅棕色溶液中，将得到的浅棕色_绿色样的溶液于室温、氩气下搅拌50分钟。LC/MS指 示，微管蛋白抑制剂混合物转化为羟基-微管蛋白抑制剂。向该溶液中加入丁酸(10mL)， 并且使该溶液经蒸发第一次浓缩至小容量，以去除TFA和DCM，然后于真空下再浓缩约1小 时至稠厚油。HPLC分析指示羟基微管蛋白抑制剂中间体完全转化为微管蛋白抑制剂B。将 粗产物溶解于 DMSO (1. 2mL)中，并通过制备型 HPLC，于 Waters XTerra Prep MS C18 10 μ m, 19x250mm柱上，使用以25mL/分钟经20分钟从25% B至50% B梯度(A 2. OmM磷酸盐缓冲 液，pH 7. 0 ；B =ACN)纯化。收集11. 5至13. 5分钟的流分并使之冻干至86mg的白色固体， 其含77mg的微管蛋白抑制剂B和9. Omg的磷酸钠盐。通过HPLC在实验全程监测互变，与 参比标准样品比较，显示仅转化为微管蛋白抑制剂B。应该理解的是，其它微管蛋白抑制剂 的混合物可类似地转化为单一的微管蛋白抑制剂。还应该理解的是，此种和其它的微管蛋 白抑制剂的混合物可类似地转化为除了微管蛋白抑制剂B外的不同的微管蛋白抑制剂。
实施例.天然微管蛋白抑制剂的互变。重复前述实施例中的条件用于(a)使微管 蛋白抑制剂A转化为微管蛋白抑制剂B，(b)使微管蛋白抑制剂A转化为微管蛋白抑制剂 I，(c)使微管蛋白抑制剂A和B的混合物转化为微管蛋白抑制剂B，和(d)使微管蛋白抑制 剂A、B和I的混合物转化为微管蛋白抑制剂B。在每种情况下，微管蛋白抑制剂B的得率 >90%。应该理解的是，在实施例(a)至(d)的每一个中，相应的微管蛋白抑制剂可转化 为除了微管蛋白抑制剂B外的不同的微管蛋白抑制剂。还应该理解的是，微管蛋白抑制剂 B可类似地转化为不同的微管蛋白抑制剂。在某些情况下，也可分离N-羟基甲基取代的微 管蛋白抑制剂。令人惊奇的发现是，该半酰胺(hemiaminal)在天然pH下是稳定的并且不
被分解为游离胺和甲醛。
羟基微管蛋白抑制剂A的1H NMR频谱与其结构相一致；MS的m/z = 760。在该实 验中得到的微管蛋白抑制剂B的1H NMR频谱与其结构相一致；MS的m/z = 830。实施例。甲氧基微管蛋白抑制剂(EC0313)。
将TFA(0. 20mL)加至于无水DCM(0. 80mL)中的微管蛋白抑制剂B(21. Omg)溶液 中，并将该混合物于室温、氩气下搅拌1小时。将MeOH(l. OmL)加至搅拌的溶液中，并在Ih 后蒸发溶剂。通过制备型HPLC，于Waters XTerra Prep MS C18 10 μ m，19x250mm柱上，使 用以IOmL/分钟经25分钟从20% B至50% B梯度(A 1. OmM磷酸盐缓冲液，pH 7. 0 ;B ACN)将残余物纯化。收集18. 8至22. 3分钟的流分并使之冻干至18. Omg的白色固体，其 含15. 5mg的标题化合物和2. 5mg的磷酸钠盐。在该实验中得到的甲氧基微管蛋白抑制剂 的1H NMR频谱与其结构相一致；MS的m/z = 774。 实施例.2-羟基乙氧基微管蛋白抑制剂(EC0346)
TFA(75 μ L)加至于无水DCM(0. 30mL)中的微管蛋白抑制剂B(4. 8mg)溶液中，
并将该混合物于室温、氩气下搅拌1小时。将乙:
(0. 30mL)加至搅拌的溶液中，并在30min 后蒸发溶剂。通过制备型 HPLC，于 Waters Phenomenex Luna C18IOym 4. 6x250mm 柱 上，使用以2. 5mL/分钟经20分钟从10% B至80% B梯度(A :1. OmM磷酸盐缓冲液，pH 7. 0 ； B =ACN)将残余物纯化。收集6. 3至6. 7分钟的流分并使之冻干至4. 9mg的白色固体，其含 4. Smg的标题化合物和0. Img的磷酸钠盐。在该实验中得到的2-羟基乙氧基微管蛋白抑制 剂的1H NMR频谱与其结构相一致；MS的m/z = 804。 将TFA (60 UL)加至于无水DCM (0. 54mL)中的微管蛋白抑制剂B (6. 9mg)溶液中， 并将该混合物于室温、氩气下搅拌30分钟。将1，2-乙二硫醇(2.0yL)加至搅拌的溶液中， 并在 5h 后蒸发溶剂。通过制备型 HPLC，于 Waters XTerra Prep MS C18 IOym 19x 250mm 柱，使用以25mL/分钟经20分钟从10% B至80% B梯度(A :2. OmM磷酸盐缓冲液，pH 7.0; B =ACN)将残余物纯化。收集9. 5至10. 7分钟的流分并使之冻干至7. 7mg的白色固体，其 含3. 4mg的标题化合物和4. 3mg的磷酸钠盐。在该实验中得到的2-巯基乙硫基微管蛋白 抑制剂的1H NMR频谱与其结构相一致；MS的m/z = 836。实施例.异-丁酰氨基微管蛋白抑制剂(EC0585) 含因子A、B、C、G、I的微管蛋白抑制剂和羟基微管蛋白抑制剂(R分别=C(O) CH2CH (CH3) 2 > C (0) CH2CH2CH3^ C (0) CH2CH3、C (0) CH = C (CH3) 2、C (0) CH3 和 H)的混合物转化为 单一的微管蛋白抑制剂。向于异戊腈(150yL)中的微管蛋白抑制剂混合物(25mg)溶液中 加入含TFA(30 μ L)、浓H2SO4 (20 μ L)和异戊腈(150 μ L)的溶液。于室温搅拌22小时后，用 2. OmM磷酸钠缓冲液(pH = 7. 0，15mL)猝灭反应，并注入制备型HPLC中纯化。柱Waters XTerra Prep MSC18 10 μ m, 19x 250mm ；流动相 A :2. OmM 磷酸钠缓冲液，pH 7. 0 ；流动相 B 乙腈；方法用30分钟从10% B至80% B，流速=26mL/min。收集从17. 22-18. 36分钟的 流分并使之冻干以产生EC0585的白色固体(16mg)。在该实验中得到的异_ 丁酰氨基微管 蛋白抑制剂的1H NMR频谱与其结构相一致；MS的m/z = 843。实施例.N-高烯丙基微管蛋白抑制剂EC0550 含因子A、B、C、G、I的微管蛋白抑制剂和羟基微管蛋白抑制剂(R分别=C(O) CH2CH(CH3) 2、C (0) CH2CH2CH3^C(O) CH2CH3^C(O) CH = C (CH3) 2、C (0) CH3 和 H)的混合物转化为单 一的微管蛋白抑制剂。于室温下，将TFA(0. 15mL)加至于无水DCM(0. 60mL)中的微管蛋白抑 制剂混合物(19mg)溶液中。于室温、氩气下搅拌40分钟后，用无水Me0H(0.50mL)猝灭反 应。于真空，在BUchi旋转蒸发仪(Biichi Rotavapor)上与无水Me0H(2x)和无水DCM(2x) 共同蒸发30分钟，再在真空下与无水MeOH和无水DCM(2x)共同蒸发1. 5小时，浓缩溶液。 将残余物溶解于无水DCM(0. 75mL)中，向其中加入烯丙基三甲基硅烷(0. 30mL)，在冰浴中 冷却，并向其中加入BF3*Et20(0. 23mL)。于氩气下、冰浴中搅拌反应混合物30分钟，然后移 去冷却物，于室温再搅拌反应混合物2小时又50分钟。浓缩反应混合物，并经制备型HPLC 纯化残余物。柱Waters XTerra PrepMS C18 10 μ m，19x 250mm ；流动相 A 2. OmM 磷酸钠缓 冲液，pH7. O ；流动相B 乙腈；方法用30分钟从15% B至80% B，流速=26mL/min。收集 从14. 41-15. 17分钟的流分并使之冻干以得到EC0550的白色固体(IOmg)。在该实验中得 到的N-高烯丙基(homoallyl)微管蛋白抑制剂的1H NMR频谱与其结构相一致；MS的m/z =784。实施例.微管蛋白抑制剂B酰胼EC0347的合成。
于-15°C，借助注射器将N，N-二异丙基乙胺(DIPEA、6. IyL)和氯甲酸异 丁酯(3. O μ L)顺序加至于无水EtOAc (2. OmL)中的微管蛋白抑制剂B (0. 15mg)溶液 中。于_15°C、氩气下搅拌45分钟后，使反应混合物冷却至-20°C，并向其中加入无水胼 (5.0yL)。于-20°C、氩气下搅拌反应混合物3小时，用l.OmM磷酸钠缓冲液(ρΗ 7.0、 1. OmL)猝灭并注入制备型 HPLC 用于纯化。柱Waters XTerra PrepMS C18 10 μ m, 19x 250mm ；流动相A =LOmM磷酸钠缓冲液，ρΗ7· 0 ；流动相B 乙腈；方法用20分钟从10% B 至80% B，流速=25mL/min。收集从15. 14-15. 54分钟的流分并使之冻干以产生EC0347的 白色固体(2. 7mg)。在该实验中得到的微管蛋白抑制剂B酰胼的1H NMR频谱与其结构相一 致；MS 的 m/z = 844。 于0°C，将 DIPEA(0. 60mL)加至于无水 DCM(5. OmL)中的 HOBt-A (685mg、91 % )混 悬液中，氩气下搅拌2分钟，并且向其中加入无水胼(0. IOmL) 0于0°C、氩气下，搅拌反应混 合物10分钟并于室温中再搅拌30分钟，过滤，并将滤液经快速色谱法(硅胶，于DCM中的 2% MeOH)纯化，得到澄清稠厚油样EC0311 (371mg)，静置使其固化。实施例.EC0312的合成。 于-15°C，借助注射器将DIPEA (36 μ L)和氯甲酸异丁酯(13 μ L)先后加至于无水 EtOAc (2. OmL)中的微管蛋白抑制剂B(82mg)溶液中。于_15°C、氩气下搅拌45分钟后，向 反应混合物中加入无水EtOAc(l. OmL)中的EC0311溶液。于_15°C、氩气下搅拌得到的溶 液15分钟和于室温下再搅拌45分钟，浓缩和残余物经快速色谱法(硅胶，于DCM中的2至 8% MeOH)纯化，得到白色固体样EC0312(98mg)。在该实验中得到的EC0312的1H匪R频谱 与其结构相一致；MS的m/z = 1057。实施例.依据本文描述的方法制备以下化合物。 在该实验中得到的EC0575的1H匪R频谱与其结构相一致；MS的m/z = 862。 在该实验中得到的EC0560的1H匪R频谱与其结构相一致；MS的m/z = 820。 在该实验中得到的EC0356的1H NMR频谱与其结构相一致；MS的m/z = 817。
E 在该实验中得到的EC0611的1H NMR频谱与其结构相一致；MS的m/z = 802。 在该实验中得到的EC0623的1H NMR频谱与其结构相一致；MS的m/z = 818。应该认识到的是，前述实施例仅为本文描述的方法的示例性说明，且可作许多常 规修正以制备另外的微管蛋白抑制剂化合物及其类似物和衍生物。例如，可使用另外的醚 形成醇，包括但不限于醇，诸如乙醇、丙醇、仲-丁醇等，多元醇，诸如乙二醇、聚乙二醇、丙 二醇、聚丙二醇、丙三醇等，包括烷基及其酰基衍生物、氨基醇，诸如氨基乙醇、氨基丙醇、聚 氨基烷基乙醇等，包括烷基及其酰基衍生物及其它。类似地，另外的硫醇、羧酸、氨基酸、胺 类等可用作亲核体以捕获式(1)和(3)的中间体亚胺盐化合物。方法实施例.细胞DNA合成的抑制。采用预测药物抑制叶酸盐受体阳性KB细胞 的生长能力的体外细胞毒性试验，评价本文描述的化合物。于37°C，在缺乏或存在至少100 倍过量的叶酸下，将KB细胞暴露于一系列浓度范围的叶酸盐-药物共轭物最多7h。然后用 新鲜培养基漂洗细胞，并于37°C在新鲜培养基中孵育72小时。采用3H-胸苷掺入试验评估 细胞生存能力。方法实施例.体外浓度-依赖的细胞毒性活性。将细胞浓密地接种在24-孔 Falcon板中，并允许其形成几乎汇合成片的单层细胞过夜。在加入测试品之前三十分钟， 从所有孔吸出用过的培养基并换入新鲜的无叶酸盐的RPMI (FFRPMI)。注意，指定的孔接受 含100 μ M叶酸的培养基；在后者孔中的细胞用于测定靶向特异性，因为过量的叶酸(能够
CN 101909441 A
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27竞争FR结合)的存在产生的细胞毒性活性将表示与FR-特异输送无关的总活性的部分。 在一次用含10%热灭活的胎牛血清的ImL新鲜FFRPMI漂洗后，每一孔接受含缺乏或存在 ΙΟΟμΜ游离叶酸(结合位点竞争剂)的、渐增浓度的测试品(每个样品4个孔)的ImL培养 基。处理的细胞于37°C脉经冲2h，用0. 5mL的培养基漂洗4次，然后追踪(chased)进ImL 的新鲜培养基长达70h。从所有孔吸出用过的培养基并换入含5 μ Ci/mL3H-胸苷的新鲜培 养基。在37°C再孵育2h后，用0. 5mL的PBS洗涤细胞3次，然后每孔用0. 5mL冰冷的5% 三氯乙酸处理。15min后，吸出三氯乙酸，并且通过加入0. 5mL的0. 25N氢氧化钠溶解细胞 材料15min。将450 μ L的各个溶解的样品转移至含3mL的Ecolume闪烁合剂的闪烁计数瓶 中，然后在液体闪烁计数仪中计数。最终结果表示为相对于未处理对照品的3H-胸苷结合 的百分比。如下表中所示，剂量依赖性细胞毒性是可检测的，并且在大多数情况下，IC5tl值 (减少50%的3H-胸苷结合至新合成的DNA所需的药物共轭体浓度)在低的纳摩尔范围内。 此外，这些共轭物的细胞毒性在过量的游离叶酸存在下被减少，提示观察到的杀细胞作用 是通过结合叶酸盐受体介导的。
方法实施例.肿瘤模型和疗法。四至七周龄小鼠(Balb/c或nu/nu品系)购自 Harlan Sprague Dawley, Inc. (Indianapolis，IN)。由于正常啮齿类动物食物含高浓度的叶酸(6mg/kg食物)，在植入肿瘤之前，使在本研究中的所用的小鼠保持无叶酸盐_膳 食(Harlan膳食#TD00434) 1周，以实现血清叶酸盐浓度接近正常人血清范围。为了接种 肿瘤细胞，将于100 μ L中的IxlO6M 109细胞或IxlO6KB细胞在背中区域行皮下组织注射。 每2-3天在两个垂直方向用卡钳测量肿瘤大小，并将它们的体积计算为0. 5xLxff2,此处L =长轴测量值(mm)和W=与L垂直的轴的测量值(mm)。然后依据下述发表的方法计算 细胞杀伤对数(LCK)和处理组与对照组的比值(T/C)(见，如，Lee等〃 BMS-247550 一种 与类似于紫杉醇的作用模式起作用，但具有优越的抗肿瘤效果的新的大环内酯类抗肿瘤药 类似物(BMS-247550 :a novel epothilone analog with a mode of action similarto paclitaxel but possessing superior antitumor efficacy) “ Clin CancerRes 7 1429-1437(2001) ；Rose,“紫杉酚-基组合化学疗法及其它体内临床前抗肿瘤研究 (Taxol-based combination chemotherapy and otherin vivo preclinical antitumor studies) " J Natl Cancer Inst Monogr 47-53(1993))。每天以 PBS 新鲜制备给药溶液， 并通过小鼠的尾侧静脉给药。重要的是，给药剂量在皮下注射肿瘤为50-100mm3体积时开 始。 通过经心脏穿刺收集血液并且提交血清用于血尿素氮(BUN)、肌酐、总蛋 白、AST-SG0T、ALT-SGPT 加 Ani-Lytics，Inc. (Gaithersburg, MD)的标准血液细胞 板(cell panel)的独立分析，评估持久的药物毒性。此外，由Animal Reference Pathology Laboratories (ARUP ；Salt Lake City, Utah)的经美国医疗专科委员会认证的 (board-certified)病理学家实施对福尔马林固定的心、肺、肝、脾、肾、肠、骨骼肌和骨(胫 骨/腓骨)进行组织病理学评价。
权利要求
一种方法，该方法用于将下式的第一种化合物其中n是1 3；V是H、OR2或卤代，而W是H、OR2或烷基，此处R2在每种情况下独立选自H、烷基或C(O)R5，此处R5在每种情况下独立选自烷基、环烷基、链烯基、芳烷基和芳基；前提是当V和W都是OR2时，则R2不是H；或V和W与所连接的碳结合在一起，形成羰基；Z是烷基而Y是O；或Z是烷基或C(O)R4，而Y不存在，此处R4是烷基、CF3或芳基；R1是H，或R1表示1 3个取代基，所述取代基选自卤代、硝基、羧酸基或其衍生物、氰基、羟基、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、苯酚保护基团、前药部分和OR6，此处R6是任选取代的芳基、C(O)R7、P(O)(OR8)2或SO3R8，此处R7和R8在每种情况下独立选自H、烷基、链烯基、环烷基、杂环基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代，或R8是金属阳离子；R是OH或离去基团，或R形成羧酸衍生物；以及R10是烷基或链烯基，其各自被任选取代；转化为下式的第二种化合物其中n是1 3；V是H、OR2或卤代，而W是H、OR2或烷基，此处R2在每种情况下独立选自H、烷基或C(O)R5，此处R5在每种情况下独立选自烷基、环烷基、链烯基、芳烷基和芳基，前提是当V和W都是OR2时，则R2不是H；或V和W与所连接的碳结合在一起，形成羰基；X是氢、C1 4烷基、链烯基，其各自被任选取代，或CH2QR9；此处Q是 N 、 O 或 S ；R9是氢、C1 4烷基、链烯基、芳基或C(O)R10；而R10是C1 6烷基、链烯基、芳基或杂芳基；其中当X是C(O)R10时，在第二种化合物中的R10与在第一种化合物中的R10不同；Z是烷基而Y是O；或Z是烷基或C(O)R4，而Y不存在，此处R4是烷基、CF3或芳基；R1是H，或R1表示1 3个取代基，所述取代基选自卤代、硝基、羧酸基或其衍生物、氰基、羟基、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、苯酚保护基团、前药部分和OR6，此处R6是任选取代的芳基、C(O)R7、P(O)(OR8)2或SO3R8，此处R7和R8在每种情况下独立选自H、烷基、链烯基、环烷基、杂环基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代，或R8是金属阳离子；且R是OH或离去基团，或R形成羧酸衍生物；该方法包括在基本无水的条件下使第一种化合物与酸混合的步骤。FPA00001174765300011.tif,FPA00001174765300012.tif
2. 一种方法，该方法用于将多个下式化合物 其中 η 是 1-3 ；V是H、0R2或卤代，而W是H、OR2或烷基，此处R2在每种情况下独立选自H、烷基或C (0) R5，此处R5在每种情况下独立选自烷基、环烷基、链烯基、芳烷基和芳基；前提是当V和W都 是OR2时，则R2不是H ；或V和W与所连接的碳结合在一起，形成羰基；Z是烷基而Y是0 ；或Z是烷基或C (0) R4,而Y不存在，此处R4是烷基、CF3或芳基； R1是H，或R1表示1-3个取代基，所述取代基选自商代、硝基、羧酸基或其衍生物、氰基、 羟基、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、苯酚保护基团、前药部分和0R6，此处R6是任选 取代的芳基、C(0)R7、P(0) (OR8) 2或SO3R8,此处R7和R8在每种情况下独立选自H、烷基、链烯 基、环烷基、杂环基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代，或R8是金属阳离子； R是OH或离去基团，或R形成羧酸衍生物；以及R10在每种情况下独立选自烷基和链烯基，其各自被任选取代；转化为基本上单一的下其中 η 是 1-3 ；V是H、0R2或卤代，而W是H、OR2或烷基，此处R2在每种情况下独立选自H、烷基或C (0) R5，此处R5在每种情况下独立选自烷基、环烷基、链烯基、芳烷基和芳基，前提是当V和W都 是OR2时，则R2不是H ；或V和W与所连接的碳结合在一起，形成羰基；X是氢、C1^4烷基、链烯基，其各自被任选取代，或CH2QR9 ；此处Q是-N-、-0-或-S- ；R9 是氢、烷基、链烯基、芳基或C(O)Rw ；和R10是。烷基、链烯基、芳基或杂芳基；Z是烷基而Y是0 ；或Z是烷基或C (0) R4,而Y不存在，此处R4是烷基、CF3或芳基；R1是H，或R1表示1-3个取代基，所述取代基选自商代、硝基、羧酸基或其衍生物、氰基、 羟基、烷基、卤代烷基、烷氧基、卤代烷氧基、苯酚保护基团、前药部分和0R6，此处R6是任选 取代的芳基、C(0)R7、P(0) (OR8) 2或SO3R8,此处R7和R8在每种情况下独立选自H、烷基、链烯 基、环烷基、杂环基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代，或R8是金属阳离子；且R是OH或离去基团，或R形成羧酸衍生物；该方法包括在基本无水的条件下使多个第一种化合物与酸混合的步骤。
3.权利要求1或2的方法，其中η= 2和R = 0H。
4.权利要求1或2的方法，其中V是H而W是OR2。
5.权利要求1或2的方法，其中Y不存在和Z是烷基。
6.权利要求3的方法，其还包括加入式RkiCO2HK合物的步骤。
7.权利要求3的方法，其还包括加入式R9QH化合物或其阴离子的步骤，其中Q 是-N-、-0-或-S- ；R9是H、烷基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基，其各自被任选取代，或R9 是C(0)R2°、S(O)2R2q或P(O) (OR20)2 ；此处R2q在每种情况下独立选自H、烷基、链烯基、环烷 基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代，或R2°是金属阳离子。
8.权利要求3的方法，其还包括加入式R21CN化合物的步骤，其中R21是烷基、链烯基、 环烷基、芳基或芳烷基，其各自被任选取代的。
9.权利要求3的方法，其还包括加入式R22(TMS) CCH2化合物的步骤，其中R22是烷基、链 烯基、环烷基、芳基或芳烷基，其各自被任选取代。
10.权利要求3的方法，其还包括加入式R23C(O)CH2Ra化合物的步骤，其中R23是H、烷 基、链烯基、环烷基、芳基或芳烷基，其各自被任选取代；Ra是C(O) R9、C (O)OR9或CN ；R9选自 H、烷基、链烯基、环烷基、芳基和芳烷基，其各自被任选取代。
11.权利要求3的方法，其还包括加水的步骤。
12.权利要求3的方法，其还包括(a)加水形成羟基化合物；和(b)用卤化剂、磺酰化 剂、膦酰化剂或磷酰化剂处理羟基化合物的步骤。
全文摘要
本文描述了制备微管蛋白抑制剂的方法。该方法用于制备预定的微管蛋白抑制剂的混合物、从微管蛋白抑制剂的混合物中制备单一的微管蛋白抑制剂和用于将一种微管蛋白抑制剂转化为不同的微管蛋白抑制剂。本文描述的微管蛋白抑制剂用于治疗包括致病细胞群的疾病和疾病状态。
文档编号A01N43/40GK101909441SQ200880123654
公开日2010年12月8日 申请日期2008年10月23日 优先权日2007年10月25日
发明者C·P·利蒙, I·R·弗拉霍夫, 王羽 申请人:恩多塞特公司