专利名称：：一种无激素规模化培养生产铁皮石斛胚芽干品的方法
技术领域：
：本发明属铁皮石斛胚芽干品的制备领域，特别是涉及一种无激素规模化培养生产铁皮石斛胚芽干品的方法。
背景技术：
：石斛作为传统名贵中药材历来受医学界的重视，由于它的特殊疗效功能，受到医学家的推崇。石斛对生产环境条件较为苛刻，生长缓慢，生物产量极为低下，加上人们长期无节制采挖，生态环境的恶化，使整个药用石斛类植物面临濒灭境地，其中尤以铁皮石斛，又名霍山石斛(中药大辞典1985)为优。对于铁皮石斛(Dendrobiumo伍cinaleKimuraetMigo)胚芽干品，迄今为止尚未见无激素规模化培养生产的方法。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种无激素规模化培养生产铁皮石斛胚芽干品的方法，该方法步骤简单，生产周期时间短，成本低，对环境友好，适合工业化生产，解决了铁皮石斛资源短缺的问题。本发明的一种无激素规模化培养生产铁皮石斛胚芽干品的方法，包括(1)外植体的培养和接种将铁皮石斛原种植株培养成3-5cm高，带3-5片叶，具3-4节间的成年株，釆集外植体用自来水反复冲洗至无泡沫为止，然后将其灭菌，切去全叶和植物基部0.30.6cm，接种到M2固体培养基，于暗培养条件下，24。C士rC，诱导休眠芽的生长3545天；(2)胚状体的继代增殖将休眠芽诱导成功后，移到光培条件下2000Lx，1620小时光照，长到0.81.2cm时剥离休眠芽，移入到M2液体培养基(去掉固体中的琼脂粉)中，每7天继代一次，24°C±1°C，自然室内光强度，经45-50天后，诱导出胚状体；(3)无激素一级培养及筛选取上述胚状体接种到M2液体培养基中，进行一级液体扩大培养，每10天继代一次，每次继代按l:2扩大群体，经3—5个周期后，挑选形态生长正常、绿色、外形大小相近的培养系，用M0液体培养基，每10天继代一次，进行5~8次的继代培养，得成熟细胞系；(4)无激素二级通气培养将上述成熟细胞系接种到MO液体培养基，并加入一级培养后的条件培养基(原母瓶的老培养基)，进行二级通气扩大培养，每天提供14-16小时光照或采取太阳自然光，培养15~20天；(5)无激素终极通气培养选择20升培养容器，每个容器装液量为16升，其中14升为新鲜的M0液体培养基，2升为步骤(4)培养时的条件培养基(原母瓶的老培养基)，选择步骤(4)得到的种子进行接种，保持2000-2500Lx光强度，按38-40度斜面于专制培养架上培养15~20天，收集鲜品；(6)鲜成品的后处理将上述鲜品收集后，用纯净水冲洗一遍后漓干、称重，然后于506(TC干燥，按250g、500g、1000g或5000g定量包装，经a射线灭菌后，8'C-12。C保存。步骤(1)中所述的M2固体培养基为1/2MS大量元素+全量铁盐+全量微量+全量有机成分+蔗糖30g/L+CH(水解酪蛋白)500mg/L+萘乙酸NAA2mg/L+细胞分裂素BA0.2mg/L+100g香蕉汁+琼脂粉4.8g/L，PH5.8，常规灭菌；步骤(1)中所述的灭菌为50%乙醇浸润3-5秒一20%"84"液7-8分钟一0.1%升汞液中12-15分钟一灭菌水冲洗几遍后，吸干水分；步骤(2)和(3)中所述的M2液体培养基为1/2MS大量之素+全量铁盐+全量微量+全量有机成分+蔗糖30g/L+CH(水解酪蛋白)500mg/L+萘乙酸NAA2mg/L+细胞分裂素BA0.2mg/L，PH5.8，常规灭菌；步骤(4)中所述的MO液体培养基为1/2MS大量之素+全量铁盐+全量微量+全量有机成分+蔗糖30g/L，PH5.8，常规灭菌；步骤(4)中所述的条件培养基为石斛在步骤(3)中的MO液体培养基中培养10~15天后的老培养基；步骤(5)中所述的条件培养基为石斛在步骤(4)中的MO液体培养基中培养10~15天后的老培养基；步骤(5)中所述的专制培养架为每个架子占地1M2，装三层，一排3个20L容器，每个架子放置18个。本发明采用MS的大量元素和微量元素作用于培养物的矿物营养；糖作为植物细胞的碳源，提供建成细胞壁一纤维素的来源，同时对培养基形成一定的渗透压，以便培养物启动生长；CH(水解酪蛋白)作为有机氮的补充；香蕉汁可以补充维生素类物质，改良生长状态。5有益效果本发明的方法步骤简单，生产周期时间短，成本低，对环境友好，适合工业化生产，解决了铁皮石斛资源短缺的问题。图1为无激素通气培养铁皮石斛千品原料生产流程图。具体实施例方式下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例1(一)外植体的准备、培养基制作、接种(1)选取长有3-5片叶，茎粗0.3-0.5成年铁皮石斛株体；(2)外植体灭菌程序外植体采集后，放在250ml小三角瓶，滴上洗洁精l-2滴，用自来水反复冲洗至无泡沫为止。在超净台上按下述步骤进入灭菌程序50%乙醇浸润3-5秒一20%"84"液7-8分钟一0.1%升汞液中12-15分钟一灭菌水冲洗几遍后，放到渗水无菌纸上吸干附着水；(3)培养基制作、准备选"MS"基本成分，用1/2大量元素+铁全+微全+全有机常规+蔗糖30g/L+100g香蕉汁10Q/。/L+琼脂粉4.8g/LPH5.8，常规灭菌，然后分装到150ml三角瓶中(预先灭菌)，每升分装18-20瓶(简称M2固，液体只是去掉琼脂，简称M2);(4)外植体接种将(2)中材料于接种纸上，无菌切去叶片和顶芽及基部0.5cm茎段，每瓶接l-3段，放到24'C士rC暗培养条件下诱导休眠，隔天检査污染情况，救出未污染的；(5)经35-45天培养后，将(4)中的培养物上陆续诱导出休眠芽，移到光培条件下2000Lx，16小时光照，等长到0.5-lcm长时，切取休眠芽，放到150ml三角瓶中，每瓶5-7个点，加M2至75ml线，放到每分钟80转的回转式摇床，经45-50天左右，陆续长出胚状体(胚芽)，每10天继代一次，直至长满一层，随着胚状体"球"增大，不时地用接种器人工切破球体，使其加快增殖；(二)摇床一级液体扩增培养(1)收取上述液体中培养的胚状体(胚芽)，从150ml小三角瓶转移到500ml三角瓶中，加M2至200ml线，每10天继代一次，每次继代时按1:2扩大群体；(2)胚状技术参数的测定在500ml—级培养阶段，必须完成以下几项技术参数的测定，才能决定产业化生产用的培养系。a."比生物生长速率"的测定(以下简称"生长速率")高等植物培养系(细胞，胚状体等)要达到产业化要求，人们认为其生长速率起码5.7mg/g'd，即每毫升培养，每天增长5.7mg鲜重，对产业化才有实际意义。这项技术参数，测定贯穿在产业化生产全过程，不断测定，不断筛选。我们目前的培养系稳定在7.2-8.5mg/g，d水平。b.测定方法和计算公式每个500ml三角瓶接种15g鲜品(接种大小影响结果)，加液200ml(重量g)继代后10天(IO天周期的确定是根据铁皮石斛多糖含量要求和增殖量决定的)，称鲜重。c.然后计算结果收获鲜重—15g+200+l(^mg/g*d铁皮石斛多糖测定定期(按不同季节，按比量)送专业权威机构检测，目前该培养多糖含量稳定在8-11%，是人工栽培3年生植株含量的85-90%;d.得干率测定每个成熟培养系在每次收获以后，漓干后，称鲜重，烘干后得到干重；计算干重+鲜重=%，我们的得干率在9%±1%;(三)无激素培养系的筛选(在500ml—级培养阶段进行)(1)选择上述在M2培养基上，能最佳状态满足上述几项技术参数培养系作为筛选的起始材料，每瓶接种15g鲜重，加入MO(M2去掉外源激素，其余不变)；(2)以10天继代一次，经过5-8次继代培养后，进入(二)(2)同样检测各项技术参数程序，选择符合各项参数的培养系作为下一阶段培养的起始材料；(四)无激素二级通气培养(1)收(三)(2)的成熟系，以l对l接种方式，从500ml三角瓶培养10天后的培养物和条件培养基(原母瓶培养基)一起转接到1000ml三角瓶中，加入新鲜的MO培养基到800ml线；(2)上述1000ml三角瓶，装上装有0.45u孔经，直径25mm空气过滤，按每二个1000ml三角瓶为一组的并联式连接，即一个进气口空气过滤器负责两个瓶，一个排气过滤器负担两个瓶的排气出口，然后接上5瓦通气泵，进气口底部接上，鱼缸换气砂头，每个泵负担16个1000ml三角瓶；通气后，每天提供14-16小时光照或采取太阳自然光，每20天一个培养周期，培养1520天；(五)无激素终极培养(成品培养生产)为了解决污染及污染造成种子成本，选择20升，现成桶装水桶作为终极培养容器；每个容器终极装液量为16升，其中14升为新鲜的M0液体，2升为(四)2.培养时的条件培养基(原母瓶培养基)，用(四)2.的6个1000ml三角瓶的培养物作种子，接种后，用(四)2.的通气装置，每个5瓦通气泵，负责4个20L容器的通气量，保持2000-2500Lx光强度，按38-40度斜面在专制培养架上，每个架子占地1M2，装三层，一排3个20L容器，每个架子放置18个，20天后终止培养，每个容器能收获3.2-3.7公斤鲜品；(六)干成品的收获灭菌从20L容器中收获的鲜品，经纯净水冲洗一遍后，漓干或用电扇吹2-3小时，然后，分装成薄层，放到抽气烘干箱中55'C-58'C，一次性烘干。干品按250g、500g、1000g、5000g不同定量包装，分别集装在纸箱中，经Y射线灭菌后，8'C-12'C保存待运。以下是本发明中所涉及的培养基的具体成分列表.，全量无机盐类明细<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>权利要求1.一种无激素规模化培养生产铁皮石斛胚芽干品的方法，包括(1)外植体的培养和接种将铁皮石斛原种植株培养成3-5cm高，带3-5片叶，具3-4节间的成年株，采集外植体用自来水反复冲洗至无泡沫为止，然后将其灭菌，切去全叶和植物基部0.3～0.6cm，接种到M2固体培养基，于暗培养条件下，24℃±1℃，诱导休眠芽的生长35～45天；(2)胚状体的继代增殖将休眠芽诱导成功后，移到光培条件下2000Lx，16～20小时光照，长到0.8～1.2cm时剥离休眠芽，移入到M2液体培养基，每7天继代一次，24℃±1℃，自然室内光强度，经45-50天后，诱导出胚状体；(3)无激素一级培养及筛选取上述胚状体接种到M2液体培养基，进行一级液体扩大培养，每10天继代一次，每次继代按1∶2扩大群体，经3-5个周期后，挑选形态生长正常、绿色、外形大小相近的培养系，用M0液体培养基，每10天继代一次，进行5～8次的继代培养，得成熟细胞系；(4)无激素二级通气培养将上述成熟细胞系接种到M0液体培养基进行二级通气扩大培养，并加入一级培养后的条件培养基，每天提供14-16小时光照或采取太阳自然光，培养15～20天；(5)无激素终极通气培养选择培养容器，每个容器装液量为16升，其中14升为新鲜的M0液体培养基，2升为步骤(4)培养时的条件培养基，选择步骤(4)得到的种子进行接种，保持2000-2500Lx光强度，按38-40度斜面于专制培养架上培养15～20天，收集鲜品；(6)鲜成品的后处理将上述鲜品收集后，用纯净水冲洗一遍后漓干、称重，然后于50～60℃干燥，按250g、500g、1000g或5000g定量包装，经γ射线灭菌后，8℃-12℃保存。2.根据权利要求1所述的一种无激素规模化培养生产铁皮石斛胚芽干品的方法，其特征在于步骤(1)中所述的M2固体培养基为1/2MS大量元素+全量铁盐+全量微量+全量有机常规+蔗糖30g/L+水解酪蛋白CH500mg/L+a-萘乙酸NAA2mg/L+细胞分裂素BA0.2mg/L+100g香蕉汁/L+琼脂粉4.8g/L，PH5.8，常规灭菌。3.根据权利要求1所述的一种无激素规模化培养生产铁皮石斛胚芽干品的方法，其特征在于步骤(1)中所述的灭菌为50%乙醇浸润3-5秒一20%"84"液7-8分钟一0.1%升汞液中12-15分钟一灭菌水冲洗几遍后，吸干水分。4.根据权利要求1所述的一种无激素规模化培养生产铁皮石斛胚芽干品的方法，其特征在于步骤(2)和(3)中所述的M2液体培养基为1/2^3大量元素+全量铁盐+全量微量+全量有机常规+蔗糖30g/L+水解酪蛋白CH500mg/L+a-萘乙酸NAA2mg/L+细胞分裂素BA0.2mg/L+100g香蕉汁/L，PH5.8，常规灭菌。5.根据权利要求1所述的一种无激素规模化培养生产铁皮石斛胚芽干品的方法，其特征在于步骤(4)中所述的MO液体培养基为1/2MS大量元素+全量铁盐+全量微量+全量有机常规+蔗糖30g/L，PH5.8，常规灭菌。6.根据权利要求1所述的一种无激素规模化培养生产铁皮石斛胚芽干品的方法，其特征在于步骤(4)中所述的条件培养基为石斛在步骤(3)中的MO液体培养基中培养10~15天后的老培养基。7.根据权利要求1所述的一种无激素规模化培养生产铁皮石斛胚芽干品的方法，其特征在于步骤(5)中所述的条件培养基为石斛在步骤(4)中的MO液体培养基中培养10~15天后的老培养基。8.根据权利要求1所述的一种无激素规模化培养生产铁皮石斛胚芽干品的方法，其特征在于步骤(5)中所述的专制培养架为每个架子占地1M2，装三层，一排3个20L容器，每个架子放置18个。全文摘要本发明涉及一种无激素规模化培养生产铁皮石斛胚芽干品的方法，包括(1)外植体的培养和接种；(2)胚状体的继代增殖；(3)无激素一级液体培养及筛选；(4)无激素二级通气培养；(5)无激素终极20L通气培养；(6)鲜成品的后处理。该方法步骤简单，生产周期时间短，成本低，对环境友好，适合工业化生产，解决了铁皮石斛资源短缺的问题。文档编号A01H4/00GK101558740SQ20091005166公开日2009年10月21日申请日期2009年5月21日优先权日2009年5月21日发明者汤佳静,郭建荣,艳陶申请人:上海汤振生物技术有限公司