专利名称：高效复合微生物豆粕发酵剂的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物发酵剂的制备方法，尤其是涉及高效复合微生物豆粕发酵
剂的制备方法，属于生物酶解发酵技术领域。
背景技术：
豆粕是大豆榨油后的副产物，其粗蛋白含量高达40% _50%，营养丰富，成本低 廉，而且蛋白质和氨基酸的组成合理，广泛用作动物的饲料。但是豆粕中含有大量的抗营 养因子，不但影响了蛋白质的利用效率，而且会引起幼年动物的肠道损伤，导致幼年动物断 奶后腹泻，显著影响动物的健康和成活。解决的办法是在豆粕中加入豆粕发酵剂，用以消 除或降低豆粕中的抗营养因子。目前采用的豆粕发酵剂主要有三种一是前一批发酵的豆 粕饲料；二是以前豆粕发酵时使用的覆盖物中霉菌残留物；三是高热过度生长的真菌菌丝 体。这些发酵剂的活力不均，生长缓慢，且常遭受其他微生物污染，出现难以预测的发酵，甚 至导致全部发酵失败。因此，在发酵前需对豆粕进行高温灭菌，再用乳酸酸化基质，以防染 菌；发酵中通常还需通入空气，成本很高。
发明内容
本发明的目的在于克服上述缺陷，提供一种高效复合微生物豆粕发酵剂的制备方 法。 本发明的目的是通过下述技术方案予以实现 —种高效复合微生物豆粕发酵剂的制备方法，包括下述步骤 1)菌种优化筛选 分别将嗜酸性乳杆菌、乳酸乳杆菌、酿酒酵母、产朊假丝酵母、枯草芽胞杆菌、地衣 芽胞杆菌进行菌株耐酸、耐胆汁盐、耐高铜和耐温驯化；
①菌株的耐酸驯化pH 3. 0-3. 5，筛选出耐酸菌株； ②耐胆酸驯化在培养基中加入不同浓度的胆酸盐，对菌株进行驯化；③耐高铜选育在含200-250mg/kg铜的MRS肉汤培养基中生长； 耐温驯化将活化后的菌体培养物接种至LB、 TB液体培养基中，培养一定时间
后在40-6(TC水浴中加热一定时间，随后继续将培养物置于37t:培养； 2)摇瓶混合培养 菌株培养采用葡萄糖或玉米淀粉、鱼粉或酵母粉、无机盐等组成的培养基，在摇瓶 中进行； ①嗜酸性乳杆菌培养MTB培养基的组成为葡萄糖80-90g/L、蔗糖8-10g/L、蛋白 胨3-5g/L、酵母粉2-25g/L、柠檬酸钠10-12g/L、 KH2P04 2 . 2-2 . 4g/L、 K2HP04 10-12g/L，在 26-37t:下进行深层液体发酵； ②乳酸乳杆菌培养GTB培养基的组成为葡萄糖60-70g/L、牛肉膏8-10g/L、酵母 粉10-15g/L、MgS04 1. 2-1. 6g/L、NaCl 2. 2-2. 5g/L、 KH2P04 2 . 2-2 . 4g/L、 K2HP04 10-12g/L，起始pH值为6-6. 5，培养温度为26-35t:，接种量为3% ; ③乳酸杆菌的混合培养将培养后的嗜酸性乳杆菌和乳酸乳杆菌放入MTB培养基 中混合培养，通过调节发酵中菌种的配比，采用两段培养温度35、37t:，培养时间18-24小 时； ④酿酒酵母培养培养基组成为酪蛋白胨12-15g/L、酵母粉12-15g/L、葡萄糖
25-30g/L、 KH2P04 2 . 2-2 . 4g/L、 K2HP04 3H20 15-16. 34g/L，培养温度为26_30°C ; ⑤产朊假丝酵母培养培养基组成为葡萄糖20-25g/L、酵母粉10-12g/L、
(NH4)2HP04 2. 5-3g/L、 KH2P04 2 . 2—2 . 4g/L、 K2HP04 3H20 15—16. 34g/L ; ⑥枯草芽胞杆菌培养培养基组成为豆粕10-12g/L、玉米粉18-21g/L、鱼粉
7-7. 3g/L、MgS04 18-2. lg/L， pH为5. 5-6. l，温度为26_35°C ; ⑦地衣芽胞杆菌培养培养基组成为豆粕8-10g/L、玉米粉20-25g/L、鱼粉 6. 5-7. 0g/L、MgS04 2. 2-2. 5g/L， pH为4. 6-5. l，温度26-33. 5°C ;
3)10L发酵罐培养 将摇瓶培养的结果分别放入10L发酵罐中放大培养；
4)制作微生物复合保护剂 保护剂由脱脂乳粉、半胱氨酸、谷氨酸钠组成，其浓度为脱脂乳粉80-85g/L、半胱
氨酸0. 04-0. 05mol/L、谷氨酸钠25_30g/L ;将保护剂加入嗜酸性乳杆菌和乳酸乳杆菌中，
在真空冷冻干燥后，将其在4t:下进行贮藏； 5)低温喷雾干燥 低温喷雾干燥温度为20-38°C ; 6)配制豆粕发酵剂 将嗜酸性乳杆菌3. 0-4. 0亿CFU/g、乳酸乳杆菌2. 0_3. 0亿CFU/g、枯草芽孢杆菌 10. 0-12. 0亿CFU/g、地衣芽孢杆菌5. 0-6. 0亿CFU/g、啤酒酵母3. 0-3. 5亿CFU/g、产朊假 丝酵母2. 0-3. 0亿CFU/g混合均匀即可，高效豆粕发酵剂总菌数^ 25亿CFU/g ;
优选为嗜酸性乳杆菌3. 5亿CFU/g、乳酸乳杆菌2. 5亿CFU/g、枯草芽孢杆菌11. 0 亿CFU/g、地衣芽孢杆菌5. 5亿CFU/g、啤酒酵母3. 0亿CFU/g、产朊假丝酵母2. 5亿CFU/g ;
本发明高效复合微生物豆粕发酵剂的制备方法与现有技术相比具有以下优点
1)科学选取枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、乳酸乳杆菌、啤酒酵母和 产朊假丝酵母六种微生物，利用它们的综合作用达到豆粕发酵时抑制杂菌生长，消除豆粕 抗营养因子、胀气因子，提高蛋白利用率，改善适口性，同时微生物合成有利于动物生长的 多种维生素和酶、次级代谢产物等，同时兼具有微生态制剂的作用，具有改善动物肠道微生 态平衡，剌激免疫系统反应，提高免疫力、降低胆固醇水平，减少饲料中酸化剂、抗生素的使 用等作用； 2)对每种微生物进行优化筛选和驯化，使之具有耐酸、耐盐、耐温及耐胆汁的优良 特性； 3)对所选微生物的培养基、培养条件进行优化控制，保证各个菌种的高密度生长，
降低了发酵成本，发酵剂的活力均匀，生长快速，不易遭受其他微生物污染； 4)在嗜酸乳杆菌和乳酸乳杆菌中加入了保护剂，并在菌体的可耐受温度下采用喷
雾技术对菌体进行干燥，大大降低了成本，探明了培养条件、收获期、冷冻速率、残留水分及复水条件对干燥菌体存活率的影响，保证了产品中菌体的活性。所生长的菌粉易于包装运 输，是微生物制剂的发展方向。
具体实施方式
实施例1 本发明高效复合微生物豆粕发酵剂的制备方法，包括下述步骤
1)菌种优化筛选 分别将嗜酸性乳杆菌、乳酸乳杆菌、酿酒酵母、产朊假丝酵母、枯草芽胞杆菌、地衣 芽胞杆菌进行菌株耐酸、耐胆汁盐、耐高铜和耐温驯化；
①菌株的耐酸驯化pH 3. 5，筛选出耐酸菌株； ②耐胆酸驯化在培养基中加入不同浓度的胆酸盐，对菌株进行驯化；
③耐高铜选育在含250mg/kg铜的MRS肉汤培养基中生长； 耐温驯化将活化后的菌体培养物接种至LB、 TB液体培养基中，培养一定时间 后在40、45、50、55、6(TC水浴中加热一定时间，随后继续将培养物置于37。C培养；
2)摇瓶混合培养 菌株培养采用葡萄糖或玉米淀粉、鱼粉或酵母粉、无机盐等组成的培养基，在摇瓶 中进行； ①嗜酸性乳杆菌培养MTB培养基的组成为葡萄糖90g/L、蔗糖10g/L、蛋白胨5g/ L、酵母粉25g/L、柠檬酸钠12g/L、KH2P04 2 . 4g/L、 K2HP04 12g/L，在37。C下进行深层液体发 酵； ②乳酸乳杆菌培养GTB培养基的组成为葡萄糖70g/L、牛肉膏10g/L、酵母粉15g/ L、 MgS04 1. 6g/L、 NaCl 2. 5g/L、 KH2P042. 4g/L、 K2HP04 12g/L，起始pH值为6. 5，培养温度为 35°〇，接种量为3% ; ③乳酸杆菌的混合培养将培养后的嗜酸性乳杆菌和乳酸乳杆菌放入MTB培养基 中混合培养，通过调节发酵中菌种的配比，采用两段培养温度35、37t:，培养时间24小时；
④酿酒酵母培养培养基组成为酪蛋白胨15g/L、酵母粉15g/L、葡萄糖30g/L、 KH2P04 2 . 4g/L、K2HP04 3H2016. 34g/L，培养温度为30°C ; ⑤产朊假丝酵母培养培养基组成为葡萄糖25g/L、酵母粉12g/L、 (NH4)2HP043g/ L、 KH2P04 2 . 4g/L、 K2HP04 3H20 16. 34g/L ; ⑥枯草芽胞杆菌培养培养基组成为豆粕12g/L、玉米粉21g/L、鱼粉7.3g/L、 MgS04 2. lg/L， pH为6. l，温度为35°C ; ⑦地衣芽胞杆菌培养培养基组成为豆粕10g/L、玉米粉25g/L、鱼粉7.0g/L、 MgS04 2. 5g/L， pH为5. l，温度为33. 5°C ;
3) 10L发酵罐培养 将摇瓶培养的结果分别放入10L发酵罐中放大培养；
4)制作微生物复合保护剂 保护剂由脱脂乳粉、半胱氨酸、谷氨酸钠组成，其浓度为脱脂乳粉85g/L、半胱氨酸 0. 05mol/L、谷氨酸钠30g/L ;将保护剂加入嗜酸性乳杆菌和乳酸乳杆菌中，在真空冷冻干
燥后，将其在4t:下进行贮藏；
5)低温喷雾干燥 低温喷雾干燥温度为26°C ; 6)配制豆粕发酵剂 将嗜酸性乳杆菌3. 5亿CFU/g、乳酸乳杆菌2. 5亿CFU/g、枯草芽孢杆菌11. 0亿 CFU/g、地衣芽孢杆菌5. 5亿CFU/g、啤酒酵母3. 0亿CFU/g、产朊假丝酵母2. 50亿CFU/g混 合均匀即可，高效豆粕发酵剂总菌数为28亿CFU/g。
权利要求
一种高效复合微生物豆粕发酵剂的制备方法，其特征在于包括下述步骤1)菌种优化筛选分别将嗜酸性乳杆菌、乳酸乳杆菌、酿酒酵母、产朊假丝酵母、枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌进行菌株耐酸、耐胆汁盐、耐高铜和耐温驯化；①菌株的耐酸驯化pH 3.0-3.5，筛选出耐酸菌株；②耐胆酸驯化在培养基中加入不同浓度的胆酸盐，对菌株进行驯化；③耐高铜选育在含200-250mg/kg铜的MRS肉汤培养基中生长；④耐温驯化将活化后的菌体培养物接种至LB、TB液体培养基中，培养一定时间后在40-60℃水浴中加热一定时间，随后继续将培养物置于37℃培养；2)摇瓶混合培养菌株培养采用葡萄糖或玉米淀粉、鱼粉或酵母粉、无机盐等组成的培养基，在摇瓶中进行；①嗜酸性乳杆菌培养MTB培养基的组成为葡萄糖80-90g/L、蔗糖8-10g/L、蛋白胨3-5g/L、酵母粉2-25g/L、柠檬酸钠10-12g/L、KH2PO4 2.2-2.4g/L、K2HPO4 10-12g/L，在26-37℃下进行深层液体发酵；②乳酸乳杆菌培养GTB培养基的组成为葡萄糖60-70g/L、牛肉膏8-10g/L、酵母粉10-15g/L、MgSO4 1.2-1.6g/L、NaCl 2.2-2.5g/L、KH2PO4 2.2-2.4g/L、K2HPO4 10-12g/L，起始pH值为6-6.5，培养温度为26-35℃，接种量为3％；③乳酸杆菌的混合培养将培养后的嗜酸性乳杆菌和乳酸乳杆菌放入MTB培养基中混合培养，通过调节发酵中菌种的配比，采用两段培养温度35、37℃，培养时间18-24小时；④酿酒酵母培养培养基组成为酪蛋白胨12-15g/L、酵母粉12-15g/L、葡萄糖25-30g/L、KH2PO4 2.2-2.4g/L、K2HPO4·3H2O 15-16.34g/L，培养温度为26-30℃；⑤产朊假丝酵母培养培养基组成为葡萄糖20-25g/L、酵母粉10-12g/L、(NH4)2HPO4 2.5-3g/L、KH2PO4 2.2-2.4g/L、K2HPO4·3H2O 15-16.34g/L；⑥枯草芽胞杆菌培养培养基组成为豆粕10-12g/L、玉米粉18-21g/L、鱼粉7-7.3g/L、MgSO4 18-2.1g/L，pH为5.5-6.1，温度为26-35℃；⑦地衣芽胞杆菌培养培养基组成为豆粕8-10g/L、玉米粉20-25g/L、鱼粉6.5-7.0g/L、MgSO4 2.2-2.5g/L，pH为4.6-5.1，温度26-33.5℃；3)10L发酵罐培养将摇瓶培养的结果分别放入10L发酵罐中放大培养；4)制作微生物复合保护剂保护剂由脱脂乳粉、半胱氨酸、谷氨酸钠组成，其浓度为脱脂乳粉80-85g/L、半胱氨酸0.04-0.05mol/L、谷氨酸钠25-30g/L，将保护剂加入嗜酸性乳杆菌和乳酸乳杆菌中，在真空冷冻干燥后，将其在4℃下进行贮藏；5)低温喷雾干燥低温喷雾干燥温度为20-38℃；6)配制豆粕发酵剂将嗜酸性乳杆菌3.0-4.0亿CFU/g、乳酸乳杆菌2.0-3.0亿CFU/g、枯草芽孢杆菌10.0-12.0亿CFU/g、地衣芽孢杆菌5.0-6.0亿CFU/g、啤酒酵母3.0-3.5亿CFU/g、产朊假丝酵母2.0-3.0亿CFU/g混合均匀即可；高效豆粕发酵剂总菌数≥25亿CFU/g。
2. —种如权利要求1所述的高效复合微生物豆粕发酵剂的制备方法，其特征在于 所述嗜酸性乳杆菌为3. 5亿CFU/g、乳酸乳杆菌为2. 5亿CFU/g、枯草芽孢杆菌为11. 0亿CFU/g、地衣芽孢杆菌为5. 5亿CFU/g、啤酒酵母为3. 0亿CFU/g、产朊假丝酵母为2. 5亿CFU/g。
全文摘要
本发明涉及一种高效复合微生物豆粕发酵剂的制备方法，属于生物酶解发酵技术领域，其制备方法包括分别将嗜酸性乳杆菌、乳酸乳杆菌、酿酒酵母、产朊假丝酵母、枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌进行优化筛选、摇瓶混合培养、10L发酵罐培养、制作微生物复合保护剂、低温喷雾干燥、配制豆粕发酵剂等步骤，本发明能有效地抑制杂菌生长，消除或显著降低了豆粕中的抗营养因子、胀气因子，提高了蛋白利用率，增强了免疫力，具有耐酸、耐盐、耐温及耐胆汁的优良特性，其制备方法简单，成本低廉，生产的产品质量稳定可靠，适用范围广。
文档编号A23K1/14GK101715876SQ20091005891
公开日2010年6月2日 申请日期2009年4月13日 优先权日2009年4月13日
发明者冯建国 申请人:四川渴望生物科技有限公司