专利名称：半夏人工种茎的生产方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养技术领域。具体涉及一种半夏人工成熟种茎的离体快速繁殖方法。
背景技术：
半夏(尸z'恥"/" ^""加e.(Thunb.)BreiO，属天南星科植物，草本，株高15-30cm。幼苗常为单叶， 卵状心形，2-3年后生3小叶的复叶，叶片全缘；叶柄长10-25cm,基部有珠芽。花单性同株，花序柄长 于叶柄，佛焰苞绿色，下部细管状雌花生于花絮基部，雄花生于上端，肉穗花序下部雌花序与佛焰苞合 生达隔膜，单侧着花，雄花序位于隔膜之上，顶部具延长、线形的附属体，超出佛焰苞很长；浆果长圆状 卵形，绿色。花期5-7月，果期8-9月。半夏野生资源主要分布在东北、华北及长江流域，主产四川、湖 北、贵州、河南、安徽、山东、浙江等省，适生于中等偏酸性沙质壤土和海拔2500tn以下的阴生环境，不 耐干旱、喜弱光怕强光、喜温，块茎珠芽膨大期地温以18 2(TC最为适宜。由此看来，野生半夏分布面积 和生长的适宜环境较有限，生长期短，生物量小，但市场需求量大，半夏属于紧缺而极其珍贵的药用植物。
半夏以块茎入药，性味辛、温，有毒。能燥湿化痰，降逆止呕，消痞散结。治湿痰冷饮，呕吐，反胃， 咳喘痰多，胸膈胀满，头晕不眠，外消痛肿。由于半夏有性繁殖系数低，主要靠块茎进行无性繁殖，因些 土传病害如病毒病和根腐病等极易发生，导致产量低下、品质退化，由于其自然繁殖系数低、产量又不高， 规模化种植受到种源供给不足的影响，加之对野生资源的乱采滥挖，已使半夏野生资源濒临枯竭。
目前，在实验室条件下，已经有通过组培快速繁殖半夏苗，并移栽大田成活的成熟技术(张振媛，荆 半夏不同品系的组织培养技术研究，2008硕士论文；郝会军等，半夏组培苗炼苗技术研究，安徽农业科学 2008, 36 (5): 1918-1919和2018),但此法需要进行生根、炼苗、移栽等多步程序，获得半夏块茎的周 期长，生长慢。本发明，为解决这一不足，通过组培技术，改变外植体的诱导发育、生长途径，通过添加 相应的生长调节物质，引导生长发育途径由器官发生途径转向胚状体发生途径，直接通过离体培养获得大 量成熟的半夏人工种茎，用于播种进一步生长膨大，来收获并提高半夏产量。
发明内容
本发明的目的是提供半夏人工种茎生产技术，大量繁殖半夏离体成熟的种茎，作为播种繁殖材料。克 服半夏组培苗在生产应用上的需要生根练苗移栽、不耐储藏和运输等缺点，缓解市场种源紧缺。 本发明是这样实il的，一种半夏的人工种茎生产方法，其步骤如下
(l)无菌苗培养:将野生半夏植株的幼嫩叶片或叶柄灭菌后，将叶片切成0.5-1.0cm2,叶柄切成0.8-lcm
长，接种到无菌苗培养基上，该无菌苗培养基组分及配比为MS基本培养基+ 0.2mg/L萘乙酸(NAA) +
0.5mg/L6-苄氨基嘌呤(6-BA)十活性炭(AC)0-3.0g/L,蔗糖30g/L，琼月旨6-8g/L，调pH至5.8-6.0,培养基的
灭菌采ffl常规方法，即121-126。C下湿热蒸汽灭菌30min,备用'下同。接种后的培养是在2000ux光下培
养，12h/d,培养温度27士rC，得到脱毒无菌苗；(2) 胚状体诱导将步骤(1)获得的脱毒无菌苗，取叶片切成0.5-1.0cm2,叶柄切成0.8-lcm，接到 胚状体诱导培养基上，所述的胚状体诱导培养基组分及配比为MS基本培养基+0.2 mg/L萘乙酸+ 0.5 mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.1 mg/L吲哚乙酸((IAA) + 0.1-0.2 mg/L脱落酸(ABA) +30g/L聚乙二醇(PEG), 蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L,调pH辛.5.8-6.0，或MS基本培养基+0.2 mg/L萘乙酸+0.5 mg/L6-节基氨基嘌 呤，蔗糖30g/L，琼月旨6-8g/L，调pH至5.8-6.0，在20001ux光下培养，12h/d，培养温度27土rC，获得半 夏胚状体(见图1-2);
(3) 种茎诱导将未产生新芽之前的半夏胚状体，转移至诱导培养基上，使其胚状体增殖并发育形成 幼小种茎，所述的种茎诱导培养基的组分及配比为MS基本培养基+ 0.1 mg/L萘乙酸+3.0g/L活性炭 +15^聚乙二醇，蔗糖30g/L,琼脂6-8g/L,调pH至5.8-6.0，在20001ux光下培养，12h/d，培养温度27 ±rc,得到半夏幼小种茎(见图3);
(4) 种茎成熟培养将步骤(3)得到的半夏幼小种茎转移至种茎成熟培养基上，使其培养至成熟， 所述的种茎成熟培养基组分及其配比为MS基本培养基+0.2 mg/L萘乙酸+ 0.5 mg/L6-苄基氨基嘌呤 +0.2-1.0mg/L脱落酸或30-50g/L聚乙二醇，蔗糖30-50g/L，琼S旨6-8g/L，调pH至5.8-6.0，在20001ux光 下培养，12h/d，培养温度27士TC，使成熟种茎直径达到3mm以上。在本发明中判定半夏成熟种茎的标 准是半夏种茎上端中间有芽点，直径大小为3mm以上，种茎的外观颜色为深绿色或略带褐色(见图5-6)。
作为优选方案之一，其中步骤(4)中所述的种茎成熟培养基组分及配比可以设计为MS基本培养基
+0.2 mg/L萘乙酸十0.5 mg/L6-节基氨基嘌呤+().3-0.9mg/L脱落酸，蔗糖30g/L,琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0。
也可以设计为MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+28-40g/L聚乙二醇，蔗糖
50g/L，琼月旨6-8g/L,调pH至5.8-6.0。
本发明将成熟分离的半夏人工种茎直接播种于基质上(一般为通用的蛭石，商购)，置于半阴生长环 境条件，温度13 3CTC,萌发成苗率可达卯％。
本发明的效果
1. 平夏生育期短，鲜嫩外植体获取受时间限制，本发明以获得健壮的脱毒无菌苗为外植体，备用，
接种，可随时取材而不受生长季节变化的限制；
2. 半夏组培快繁殖获得的组培苗移栽前需要进行生根、炼苗等多步程序，获得半夏块茎的周期长， 生长慢，本发明的这种半夏人工种茎培养至成熟仅需60-80天，生命力与抗逆性强，含水量降至 65-75%时即可耐贮藏，不需要经这特殊驯化就可以直接用于播种，适合工厂规模化常年生产。
3. 本发明所获得的半夏人工种茎单粒直径更大(见图7)，发育更成熟'萌发率高。
4. 本发明克服了自然条件下半夏有性繁殖系数低、繁殖周期长、品质易退化、组培苗移栽程序麻烦、 离体块茎不成熟易感病、难萌发等缺点，为工厂化快速生产半夏人工种茎提供了实用技术，可缓 解市场种源的紧缺现状。
图1:是本发明诱导的半夏胚状体I ;图2:是本发明诱导的半夏胚状体II;
图3:是半夏胚状体增殖并发育形成小种茎；
图4:是半夏小种茎逐渐成熟；
图5:是成熟的半夏人工种茎I ;
图6:是成熟的半夏人工种茎II;
图7:是成熟的半夏人工种茎单粒直径次数分布；
具体实施例方式
实施例1
一种半夏的人工种茎生产方法，其步骤如下
(1) 无菌苗培养将湖南桂东县野生半夏植株的幼嫩叶片或叶柄灭菌后，将叶片切成0.5-l.Ocm2，叶 柄切成0.8-lcm长，接种到无菌苗培养基上，该无菌苗培养基组分及配比为MS基本培养基+0.2mg/L萘 乙酸+0.5mg/L6-苄氨基嘌呤+活性炭1.0-3.0g/L，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0，培养基的灭 菌采用常规方法，即121-126'C下湿热蒸汽灭菌30min，备用，下同。接种后的培养是在20001ux光下培养， 12h/d，培养温度27土rc，得到脱毒无菌苗；
(2) 胚状体诱导将步骤(1)获得的脱毒无菌苗，取叶片切成0.5-l.Ocm2，叶柄切成0.8-lcm，接种 到胚状体诱导培养基上，所述的胚状体诱导培养基组分及配比为MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5 mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.05-0.1mg/L吲哚乙酸+ 0.1-0.2 mg/L脱落酸+30g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L,琼脂 6隱8g/L,调pH至5.8-6.0，在2000lux光下培养，12h/d，培养温度27土rC,获得半夏胚状体，其胚状体外 观曾绿色球形状(见图1);
(3) 种茎诱导将未产生新芽之前的半夏胚状体，转移至诱导培养基上，使其胚状体增殖并发育形成 幼小种茎，所述的种茎诱导培养基的组分及配比为MS基本培养基+0.2 mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨 基嘌呤+15g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L,琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0，在20001ux光下培养，12h/d，培养 温度27士rC，得到半夏幼小种茎(见图3);
(4)种茎成熟培养将步骤(3)得到的半夏幼小种茎转移至种茎成熟培养基上，使其培养至成熟， 所述的种茎成熟培养基组分及其配比为MS基本培养基+0.2 mg/L萘乙酸+ 0.5 mg/L6-苄基氨基嘌呤 十0.2mg/L脱落酸，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L,调pH至5.8-6.0，在20001ux光下培养，12h/d,培养温度27 士rC，使成熟种茎直径达到3mm以上。成熟种茎的判定标准半夏种茎的顶端中心有茎痕，直径大小为 3mm以上，种茎的外观颜色为深绿色或略带褐色。 实施例2
根据实施例1所述的基本步骤，其中
5步骤(4)所述的种茎成熟培养基组分及其配比为MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-节基 氨基嘌呤+30g/L聚乙二醇，其他相同。 实施例3
根据实施例1所述的基本步骤，其中
步骤(4)所述的种茎成熟培养基组分及其配比为MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-节基 氨基嘌呤+50g/L聚乙二醇，其他成分及条件同实施例1。 实施例4
根据实施例1所述的基本步骤，其中
步骤(4)所述的种茎成熟培养基组分及其配比为MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-节基 氨基嘌呤+28g/L聚乙二醇，其他成分及条件同实施例1。 实施例5
根据实施例1所述的基本步骤，其中
步骤(4)所述的种茎成熟培养基组分及其配比为MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-节基 氨基嘌呤+0.3mg/L脱落酸，其他成分及条件同实施例1。 实施例6
根据实施例1所述的基本步骤，其中
步骤(4)所述的种茎成熟培养基组分及其配比为MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-节基 氨基嘌呤++0.9111§^脱落酸，其他成分及条件同实施例1。 实施例7
根据实施例1所述的基本步骤，其中 '
步骤(4)所述的种茎成熟培养基组分及其配比为MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-节基 氨基嘌呤++01.0111^脱落酸，其他成分及条件同实施例1。 实施例8
根据实施例1所述的基本步骤，其中
步骤(4)所述的种茎成熟培养基组分及其配比为MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-节基 氨基嘌呤+40g/L聚乙二醇，其他成分及条件同实施例1。
实施例9
根据实施例1所述的基本歩骤，其中
步骤(1)所述的无菌苗培养中，其外植体材料选取中国湖北省荆州地区野生半夏植株，所述的无菌 苗培养基组分及配比为MS基本培养基+ 0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄氨基嘌呤，其他成分及培养条件 同实施例1。
步骤(2)所述的胚状体诱导中，所述的胚状体诱导培养基组分及配比为MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤，诱导获得胚状体(见图2)，其他成分及条件同实施例1 。
步骤(3)所述的种茎诱导中，所述的种茎诱导培养基的组分及配比为MS基本培养基+0.2mg/L萘
乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.5-1.0mg/L脱落酸，其他成分及培养条件同实施例1。
步骤(4)的成熟种茎培养中，所述的种茎成熟培养基组分及其配比为MS基本培养基+1.0mg/L6-苄
基氨基嘌呤+50g/L聚乙二醇，蔗糖50g/L，培养获得成熟人工种茎(见图5)，其他成分及培养条件同实施例1。
实施例10
根据实施例3所述的基本步骤，其中
步骤(2)所述的胚状体诱导培养基组分及配比为MS基本培养基+0.2 mg/L萘乙酸+0.5 mg/L6-苄 基氨基嘌呤+0.1mg/L吲哚乙酸+0.2mg/L脱落酸+15g/L聚乙二醇，其他成分及培养条件同实施例1。
步骤(4)所述的种茎成熟培养基组分及其配比为MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基 氨基嘌呤+0.8mg/L脱落酸，蔗糖30g/L，培养获得成熟半夏人工种茎(见图6)，其他成分及培养条件同实 施例1。
本发明的实施效果见表1和2所示
表1半夏胚状体诱导培养基配比筛选的正交试验(L934)
处理IAA (A)ABA (B)AC (C)PEG (D)湖北半夏的诱湖南半夏诱导率
组导率
1000077.50%78.57%
20O.lmg/L2.0g/L15.0g/L45,00%5.00%
300,2mg/L3.0g/L30,0g/L32.50%17.50%
40.05mg/L02.0g/L30.0g/L70.00%32.50%
50.05mg/LO.lmg/L3.0g/L031.25%12.50%
60.05mg/L0.2mg/L015.0g/L94.44%60,00%
70.1 mg/L03.0g/L15.0g/L32.50%35.00%
80.1 mg/LO.lmg/L030.0g/L90.00o/o100.00%
9O.lmg/L0,2mg/L2.0g/L040.63%23.33%
表2半夏胚状体诱导培养基配比筛选的正交试验结果分析(L934)
处理 IAA (A)ABA (B)AC (C)PEG (D)最优组合
Kl155,00180.00261.94149.38
K2195.69166.25155.63171.94
K3163.13167.5796.25192.5A2B1C1D3
R13.56334.583355.230014.3733C>D>A>B
Kl，101.07146.07238,57114.40
K2，105.00117.5060.83100.00
K3,158,33100.8365.00150.00A3B1C1D3
R,19.086715,080059.246716,6667C>A>D>B
权利要求
1、一种半夏的人工种茎生产方法，其特征在于以下步骤(1)无菌苗培养将野生半夏植株的幼嫩叶片或叶柄灭菌后，将叶片切成0.5-1.0cm2，叶柄切成0.8-1cm长，接种到无菌苗培养基上，该无菌苗培养基组分及配比为MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄氨基嘌呤+活性炭0-3.0g/L，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0，在2000lux光下培养，12h/d，培养温度27±1℃，得到脱毒无菌苗；(2)胚状体诱导将步骤(1)获得的脱毒无菌苗，取叶片切成0.5-1.0cm2，或将叶柄切成0.8-1cm长的茎段，接种到所述的胚状体诱导培养基上，所述的胚状体诱导培养基组分及配比为MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L 6-苄基氨基嘌呤+0.05-0.1mg/L吲哚乙酸+0.1-0.2mg/L脱落酸+30g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0，或MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0，在2000lux光下培养，12h/d，培养温度27±1℃，获得半夏胚状体；(3)种茎诱导将未产生新芽之前的半夏胚状体，转移至诱导培养基上，使其胚状体增殖并发育形成幼小种茎，所述的种茎诱导培养基的组分及配比为MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+15g/L聚乙二醇，调pH至5.8-6.0，或者MS基本培养基+0.1mg/L萘乙酸+3.0g/L活性炭+15g/L聚乙二醇，蔗糖30g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0，在2000lux光下培养，12h/d，培养温度27±1℃，得到半夏幼小种茎；(4)种茎成熟培养将步骤(3)得到的半夏幼小种茎转移至种茎成熟培养基上，使其培养至成熟，所述的种茎成熟培养基组分及其配比为MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.2-1.0mg/L脱落酸，蔗糖30g/L，调pH至5.8-6.0，或MS基本培养基+1.0mg/L6-苄基氨基嘌呤+30-50g/L聚乙二醇，蔗糖50g/L，琼脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0，在2000lux光下培养，12h/d，培养温度27±1℃，使成熟种茎直径达到3mm以上。
2、 根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(4)中所述的种茎成熟培养基组分及配比 为MS基本培养基+0.2 mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+0.3-0.9mg/L脱落酸，蔗糖30g/L,琼 脂6-8g/L，调pH至5.8-6.0。
3、 根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(4)中所述的种茎成熟培养基组分及配比 为MS基本培养基+0.2mg/L萘乙酸+0.5mg/L6-苄基氨基嘌呤+28-40g/L聚乙二醇'蔗糖50g/L'琼 月旨6國8g/L，调pH至5.8-6.0。
全文摘要
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及半夏人工种茎生产方法。该方法包括半夏外植体的选择与消毒，胚状体的诱导与增殖，诱导人工种茎的形成、生长与成熟等步骤。本发明提出了半夏从野生植株到人工种茎生产的相应程序，不同阶段所需要专用培养基等关键技术，能规模化培育生产出成熟的半夏人工种茎，其萌发率可达90％。本发明克服了自然条件下半夏有性繁殖系数低、繁殖周期长、品质易退化、组培苗移栽程序麻烦、离体块茎不成熟难萌发等缺点，为工厂化快速生产半夏人工种茎提供了实用技术，可缓解市场种源的紧缺现状。
文档编号A01H4/00GK101491214SQ20091006106
公开日2009年7月29日 申请日期2009年3月11日 优先权日2009年3月11日
发明者叶双凤, 沫 王 申请人:华中农业大学