专利名称：一种大花红景天的组培育苗方法
技术领域：
本发明涉及一种植物的组培育苗方法，具体涉及一种大花红景天的组培育苗方 法。
背景技术：
大花红景天(Rhodiola crenulata)为景天科(Crassulaceae)红景天属 (Rhodiola L.)多年生草本植物，其生长于西藏高原海拔3500-5000米的雪山中，并经受 长期缺氧、干燥及强紫外线等恶劣环境的影响，形成了独特的营养成分，其中含有丰富的甙 类、黄酮、多种维生素和微量元素，还含有机体必需的17种氨基酸，被誉为“高原人参”，是 国家2005版药典中唯一收录的红景天类药材。研究表明，大花红景天具有抗缺氧、抗疲劳、 抗辐射、延缓机体衰老等多种功能。大花红景天大多为天然资源，其生存环境恶劣，生长缓慢且年产量低。种子繁殖因 其结实率低，果内种子量少且多败育，萌发率仅为5%-10%，自然更新困难，加上需求量日 益增大，以至原本就稀少的野生资源面临严重匮乏。目前，人们通过多种途径如引种栽培来 解决其需求问题，但是收效甚微。采用组织培养方法是探索大花红景天快速无性繁殖的主要途径，国外关于大花 红景天组培再生尚无报道，国内已有一些对大花红景天组织培养的研究工作，如尹文兵等 (“大花红景天的组织培养和快速繁殖”，尹文兵等，植物生理学通讯，第41卷第4期，第493 页，2005年)通过诱导叶片产生愈伤组织，产生幼芽，再诱导幼芽生根形成生根苗，但是这 种方法培养的不同阶段必须采用不同的培养基和激素，耗时耗力，愈伤组织产生变异的可 能性也较大。由于生根过程产生褐化，其处理方法是不断转接，这样就无法实现规模化；晏 婴才等(“云南野生红景天的组织培养与快速繁殖”，晏婴才等，植物生理学通讯，第41卷第 3期，第341页，2005年)对大花红景天的再生也做了研究，其继代培养基为6-苄氨基腺嘌 呤(6-BA)+吲哚乙酸(IAA)，但是其继代增殖周期长，增殖系数低，不定芽40天增殖3倍。 由此可见，目前大花红景天的组织培养尚有新芽启动慢，繁殖系数不高的缺点，不能进行规 模种植生产。
发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种繁殖系数高、生根容易、成本低、简便高效的大 花红景天的组培育苗方法。本发明的目的是采用以下技术方案来实现的一种大花红景天的组培育苗方法，其包括以下步骤(1)以大花红景天叶片作为外植体进行出芽培养形成不定芽；(2)将不定芽进行增殖培养形成丛生芽；(3)将丛生芽伸长后得到的单苗(有茎无根的苗)进行生根培养形成生根苗；(4)移栽生根苗；
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其中，出芽培养的培养基为添加了 10-20 u mol/L的6_苄基氨基嘌呤 (benzylaminopurine,以下简称 6-BA)和 1-5 ii mol/L 的赤霉素(gibberellic acid,以下简 称GA3)的MS固体培养基。在上述方法中，出芽培养的培养基还可以包含5. 5-6. 5g/L的琼脂和20_30g/L的 蔗糖，培养基pH为5. 8。增殖培养的培养基优选为添加了 2. 5-15 u mol/L的6-苄基氨基 嘌呤的MS固体培养基，其中还可以包含5. 5-6. 5g/L的琼脂和20-30g/L的蔗糖，培养基pH 为5. 8。生根培养的培养基优选为添加了 2. 5-10 u mol/L的吲哚乙酸(indole-3-acetic acid，以下简称IAA)的MS固体培养基，其中还可以包含0. 5_2g/L的活性炭(activated charcoal,以下简称AC)、7. 5-8. 5g/L的琼脂和20_30g/L的蔗糖，培养基pH为5. 8。在上述方法中，优选地，外植体出芽培养前经过消毒处理，例如用水清洗后，在无 菌条件下用杀菌剂消毒，再用无菌水清洗。优选地，上述出芽培养包括在温度为25士2°C的无菌条件下，黑暗培养0-10天后 光照诱导形成不定芽，光照强度为2500士500勒克斯(Lux)，每日光照时间为14-18小时。优选地，上述增殖培养包括在诱导出芽一个月后，在温度为25 士 2°C的条件下光照 培养不定芽，每日光照时间为14-18小时。优选地，上述生根培养包括在温度为25士2°C的条件下光照培养2-3cm的单苗达 15-45天，每日光照时间为14-18小时。优选地，上述移栽包括将根长l_2cm的生根苗移栽在质量比为蛭石珍珠岩= 1 1的混合基质中培育，培育温度15_25°C。本发明的一个具体技术方案如下(1)选择大花红景天优良单株的叶片作为外植体，在进行外植体的消毒时，先用自 来水清洗30分钟后，在无菌超净台中再用10%的84消毒液消毒25分钟，然后用无菌水清 洗3次；(2)经消毒的外植体，在无菌条件下诱导出芽培养，基本培养基为MS培养基，附加 的植物激素为10-20 u mol/L的6-BA和1-5 u mol/L的GA3，还包含5. 5-6. 5g/L的琼脂和 20-30g/L的蔗糖。(3)外植体在诱导出芽培养基上暗处理0-10天，然后在光强度为2500士500LUX条 件下培养，诱导不定芽培养温度为25士21，培养基？11为5.8，光照时间为16小时；(4)诱导出芽一个月后，进入继代培养进行不定芽增殖，继代培养的培养基为MS 培养基，附加的植物激素为5 u mol/L的6-BA，还包含6g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，培养温 度为25 士 2 °C，培养基pH为5. 8，光照时间为16小时；(5)剪取生长健壮，长2_3cm的单苗进行生根培养，基本培养基为MS培养基，附加 的植物激素为2. 5-10 u mol/L的吲哚乙酸，还包含1. 0g/L活性炭，8. 0g/L琼脂和30g/L的 蔗糖，培养温度为25 士 2 °C，培养基pH为5. 8，光照时间为16小时；(6)大花红景天生根苗在生根培养基中培养10天左右开始生根，到20天左右待 根长至l-2cm时进行生根苗移栽。在生根苗培养阶段，培养温度为25士2°C，培养基pH为 5. 8，光照时间为16小时。(7)在生根培养基上培养好的生根苗移栽到蛭石珍珠岩=1 1混合基质中培 育，培育前用0. 1 %多菌灵浇透基质，移栽培育的温度控制在15-25°C，过高过底不利于生
4根苗的成活，在温度适宜的条件下，20天后，生根苗即开始生长。综上所述，本发明提供的大花红景天的组培育苗方法，通过黑暗预处理外植体，克 服了大花红景天组培过程中产生的褐化问题，提高了出芽率和出芽数；改变出芽阶段和继 代培养的激素种类，提高繁殖系数；在生根过程中添加活性炭，吸附褐化产生的色素，解决 生根困难的不足，并起到壮苗作用。本发明的组培育苗方法具有启动早，出苗快，同步性好， 分化频率高，生长周期较其他培养基短，生长良好，基本上无畸形苗的优点。具体而言，本发 明的有益效果如下首先，在诱导出芽阶段进行暗培养，克服了培养过程中由于褐化造成的细胞死亡， 在诱导阶段一般15天左右就可出现分化，解决了繁殖系数低的难题。其次，出芽诱导阶段应用6-BA和GA3激素组合可以不经过愈伤组织培养阶段，直 接诱导出芽。第三，在继代阶段，只用一种激素6-BA培养12天左右就可出现丛生芽，使丛生芽 20天的增殖系数达到2-3倍，并且节约了成本。第四，在生根阶段添加活性炭，吸附褐化产生的酚类色素并起到壮苗作用，约10 天左右，可见白色短根，在最优条件下，生根率可达到95 %以上，再过20天左右，便可移栽， 移栽成活率最高达到90%以上，可周年繁殖，一次可繁殖上千株，而常规的分檗繁殖方法一 般只能一年繁殖一次。
以下，结合附图来详细说明本发明，其中图1显示使用本发明的组培育苗方法诱导出的大花红景天不定芽。图2显示使用本发明的组培育苗方法增殖的大花红景天丛生芽。图3显示使用本发明的组培育苗方法培育的大花红景天生根苗。图4显示使用本发明的组培育苗方法移栽的大花红景天苗。
具体实施例方式以下结合实施例进一步阐述本发明，但这些实施例仅限于说明本发明，而不能限 制本发明的范围。以下各实施例将详细说明本发明大花红景天的组培育苗方法的具体操作步骤，其 中所使用的MS培养基(Murashige and Skoog培养基)，其配方如下
实施例1本实施例中大花红景天的组培育苗方法的具体步骤如下(1)选择大花红景天优良单株(采自西藏多年生野生植株)的叶片作为外植体，在 进行外植体的消毒时，先用自来水清洗30分钟后，在无菌超净台中再用10 %的84消毒液消 毒25分钟，然后用无菌水清洗3次。(2)经消毒的外植体，在无菌条件下诱导出芽培养，基本培养基为MS培养基，附 加的植物激素为15 u mol/L的6-BA和2. 5 y mol/L的GA3，还包含5. 5g/L的琼脂和26g/ L的蔗糖，培养基pH为5. 8。外植体在诱导出芽培养基上暗处理10天，然后在光强度为 2500 士 500LUX条件下培养，诱导不定芽培养温度为25 士 2°C，光照时间为16小时，12天出现 分化。30天统计出芽率达到88%，每个外植体的平均出芽数为5. 3个芽。(3)诱导出芽一个月后，进入继代培养进行不定芽增殖，继代培养的培养基为MS 培养基，附加的植物激素为5 u mol/L的6-BA，还包含6g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，培养温 度为25士2°C，培养基pH为5. 8，光照时间为16小时，12天出现丛生芽，增殖周期为20天，增殖系数3倍。(4)剪取生长健壮，长2-3cm的单苗进行生根培养，基本培养基为MS培养基，附加 的植物激素为5 u mol/L的IAA，还包含1. Og/L AC, 8. Og/L琼脂和30g/L的蔗糖，培养温度 为25 士 2°C，培养基pH为5.8，光照时间为16小时。大花红景天生根苗在生根培养基中培 养10天左右开始生根，20天后统计，生根率达98. 4%，每个苗的平均生根数为5. 2。(5)到20天左右待根长至l-2cm时，开瓶炼苗2天左右，将在生根培养基上培养好 的生根苗移栽到质量比为蛭石珍珠岩=1 1混合基质中培育，培育前用0.1%多菌灵浇 透基质，移栽培育的温度控制在15-25°C，过高过底不利于生根苗的成活，20天后，生根苗 即开始生长，成活率达到92%。实施例2本实施例中大花红景天的组培育苗方法的具体步骤如下(1)选择大花红景天优良单株的叶片作为外植体，在进行外植体的消毒时，先用自 来水清洗30分钟后，在无菌超净台中再用10%的84消毒液消毒25分钟，然后用无菌水清 洗3次。(2)经消毒的外植体，在无菌条件下诱导出芽培养，基本培养基为MS培养基，附加 的植物激素为15 u mol/L的6-BA和2. 5 y mol/L的GA3，还包含6g/L的琼脂和20g/L的蔗 糖。外植体在诱导出芽培养基上暗处理5天，然后在光强度为2500士500LUX条件下培养， 诱导不定芽培养温度为25士2°C，培养基pH为5. 8，光照时间为16小时，12天出现分化。30 天统计出芽率达98. 8%，每个外植体的平均出芽数为9. 1个芽。(3)诱导出芽一个月后，进入继代培养进行不定芽增殖，继代培养的培养基为MS 培养基，附加的植物激素为5 u mol/L的6-BA，还包含6g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，培养温 度为25士2°C，培养基pH为5. 8，光照时间为16小时，12天出现丛生芽，增殖周期20天，增 殖系数3倍。(4)剪取生长健壮，长2_3cm的单苗进行生根培养，基本培养基为MS培养基，附加 的植物激素为2. 5 u mol/L的IAA，还包含1. 0g/L AC, 8. 0g/L琼脂和30g/L的蔗糖，培养温 度为25士2°C，培养基pH为5. 8，光照时间为16小时。20天后统计生根率为76. 2%，每个 苗的平均生根数为4. 0。大花红景天生根苗在生根培养基中培养10天左右开始生根，在生 根苗培养阶段，培养温度为25士2°C，培养基pH为5. 8，光照时间为16小时。(5)到20天左右待根长至l-2cm时，开瓶炼苗2天左右，将在生根培养基上培养好 的生根苗移栽到质量比为蛭石珍珠岩=1 1混合基质中培育，培育前用0.1%多菌灵浇 透基质，移栽培育的温度控制在15_25°C，过高过底不利于生根苗的成活，在温度适宜的条 件下，20天后，生根苗即开始生长，成活率为92%。实施例3本实施例中大花红景天的组培育苗方法的具体步骤如下(1)选择大花红景天优良单株的叶片作为外植体，在进行外植体的消毒时，先用自 来水清洗30分钟后，在无菌超净台中再用10%的84消毒液消毒25分钟，然后用无菌水清 洗3次。(2)经消毒的外植体，在无菌条件下诱导出芽培养，基本培养基为MS培养基，附加 的植物激素为15 u mol/L的6-BA和2. 5 y mol/L的GA3，还包含6. 5g/L的琼脂和30g/L的蔗糖。外植体在诱导出芽培养基上暗处理0天，然后在光强度为2500 士 500LUX条件下培养， 诱导不定芽培养温度为25士2°C，培养基pH为5. 8，光照时间为16小时，15天出现分化。30 天统计出芽率为67. 5%，每个外植体的平均出芽数为3. 7个芽。(3)诱导出芽一个月后，进入继代培养进行不定芽增殖，继代培养的培养基为MS 培养基，附加的植物激素为5 u mol/L的6-BA，还包含6g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，培养温 度为25士2°C，培养基pH为5. 8，光照时间为16小时，12天出现丛生芽，增殖周期20天，增 殖系数3倍。(4)剪取生长健壮，长2_3cm的单苗进行生根培养，基本培养基为MS培养基，附加 的植物激素为2. 5 u mol/L的IAA，还包含1. Og/L AC, 8. Og/L琼脂和30g/L的蔗糖，培养温 度为25士2°C，培养基pH为5. 8，光照时间为16小时。20天后统计生根率为76. 2%，每个 苗的平均生根数为4. 0。大花红景天生根苗在生根培养基中培养10天左右开始生根，在生 根苗培养阶段，培养温度为25士2°C，培养基pH为5. 8，光照时间为16小时。(5)到20天左右待根长至l-2cm时，开瓶炼苗2天左右，将在生根培养基上培养好 的生根苗移栽到质量比为蛭石珍珠岩=1 1混合基质中培育，培育前用0.1%多菌灵浇 透基质，移栽培育的温度控制在15_25°C，过高过底不利于生根苗的成活，在温度适宜的条 件下，20天后，生根苗即开始生长，成活率为92 %。实施例4本实施例中大花红景天的组培育苗方法的具体步骤如下(1)选择大花红景天优良单株的叶片作为外植体，在进行外植体的消毒时，先用自 来水清洗30分钟后，在无菌超净台中再用10%的84消毒液消毒25分钟，然后用无菌水清 洗3次。(2)经消毒的外植体，在无菌条件下诱导出芽培养，基本培养基为MS培养基，附加 的植物激素为10 u mol/L的6-BA和1 u mol/L的GA3，还包含6. 5g/L的琼脂和25g/L的蔗 糖，外植体在诱导出芽培养基上暗处理10天，然后在光强度为2500士500LUX条件下培养， 诱导不定芽培养温度为25士2°C，培养基pH为5. 8，光照时间为16小时，15天出现分化。30 天统计，出芽率为55. 3%，每个外植体的平均出芽数为3. 7个芽。(3)诱导出芽一个月后，进入继代培养进行不定芽增殖，继代培养的培养基为MS 培养基，附加的植物激素为5 u mol/L的6-BA，还包含6g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，培养温 度为25士2°C，培养基pH为5. 8，光照时间为16小时，12天出现丛生芽。增殖周期20天，增 殖系数3倍。(4)剪取生长健壮，长2_3cm的单苗进行生根培养，基本培养基为MS培养基，附加 的植物激素为2. 5 u mol/L的IAA，还包含1. 0g/L AC, 8. 0g/L琼脂和30g/L的蔗糖，培养温 度为25士2°C，培养基pH为5. 8，光照时间为16小时。20天后统计生根率为76. 2%，每个 苗的平均生根数为4. 0。大花红景天生根苗在生根培养基中培养10天左右开始生根，在生 根苗培养阶段，培养温度为25士2°C，培养基pH为5. 8，光照时间为16小时。(5)到20天左右待根长至l-2cm时，开瓶炼苗2天左右，将在生根培养基上培养好 的生根苗移栽到质量比为蛭石珍珠岩=1 1混合基质中培育，培育前用0.1%多菌灵浇 透基质，移栽培育的温度控制在15_25°C，过高过底不利于生根苗的成活，在温度适宜的条 件下，20天后，生根苗即开始生长，成活率为92 %。
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实施例5本实施例中大花红景天的组培育苗方法的具体步骤如下(1)选择大花红景天优良单株的叶片作为外植体，在进行外植体的消毒时，先用自 来水清洗30分钟后，在无菌超净台中再用10%的84消毒液消毒25分钟，然后用无菌水清 洗3次。(2)经消毒的外植体，在无菌条件下诱导出芽培养，基本培养基为MS培养基，附加 的植物激素为20 u mol/L的6-BA和5 u mol/L的GA3，还包含6g/L的琼脂和20g/L的蔗糖， 外植体在诱导出芽培养基上暗处理10天，然后在光强度为2500 士 500LUX条件下培养，诱导 不定芽培养温度为25士2°C，培养基pH为5. 8，光照时间为16小时，12天出现分化。30天 统计出芽率43. 0 %，每个外植体的平均出芽数为2. 3个芽。(3)诱导出芽一个月后，进入继代培养进行不定芽增殖，继代培养的培养基为MS 培养基，附加的植物激素为5 u mol/L的6-BA，还包含6g/L的琼脂和30g/L的蔗糖，培养温 度为25士2°C，培养基pH为5. 8，光照时间为16小时，12天出现丛生芽。增殖周期20天，增 殖系数3倍。(4)剪取生长健壮，长2-3cm的单苗进行生根培养，基本培养基为MS培养基，附加 的植物激素为10 u mol/L的IAA，还包含1. Og/L AC, 8. 0g/L琼脂和30g/L的蔗糖，培养温度 为25士2°C，培养基pH为5. 8，光照时间为16小时。20天后统计生根率为77. 9%，每个苗 的平均生根数为4. 3。大花红景天生根苗在生根培养基中培养10天左右开始生根，在生根 苗培养阶段，培养温度为25士2°C，培养基pH为5. 8，光照时间为16小时。(5)到20天左右待根长至l-2cm时，开瓶炼苗2天左右，将在生根培养基上培养好 的生根苗移栽到质量比为蛭石珍珠岩=1 1混合基质中培育，培育前用0.1%多菌灵浇 透基质，移栽培育的温度控制在15_25°C，过高过底不利于生根苗的成活，在温度适宜的条 件下，20天后，生根苗即开始生长，成活率为92 %。
权利要求
一种大花红景天的组培育苗方法，其包括以下步骤(1)以大花红景天叶片作为外植体进行出芽培养形成不定芽；(2)将不定芽进行增殖培养形成丛生芽；(3)将丛生芽伸长后得到的单苗进行生根培养形成生根苗；(4)移栽生根苗；其中，出芽培养的培养基为添加了10-20μmol/L的6-苄基氨基嘌呤和1-5μmol/L的赤霉素的MS培养基。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述增殖培养的培养基为添加了 2. 5-15 u mol/L的6-苄基氨基嘌呤的MS培养基。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述出芽培养的培养基和增殖培养的 培养基还包含5. 5-6. 5g/L的琼脂和20-30g/L的蔗糖。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其特征在于，所述生根培养的培养基为添 加了 2. 5-10 u mol/L的吲哚乙酸的MS培养基。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述生根培养的培养基还包 含0. 5-2g/L活性炭、7. 5-8. 5g/L的琼脂和20_30g/L的蔗糖。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述外植体出芽培养前经过 消毒处理，例如用水清洗后，在无菌条件下用杀菌剂消毒，再用无菌水清洗。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述出芽培养包括在温度为 25士2°C的无菌条件下，黑暗培养0-10天后，光照诱导形成不定芽，光照强度为2500士500 勒克斯，每日光照时间为14-18小时。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述增殖培养包括在诱导出 芽一个月后，在温度为25士2°C的条件下光照培养不定芽，每日光照时间为14-18小时。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其特征在于，所述生根培养包括在温度为 25士2°C的条件下光照培养2-3cm的单苗达15-45天，每日光照时间为14-18小时。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法，其特征在于，所述移栽包括将根长 l-2cm的生根苗移栽在质量比为蛭石珍珠岩=1 1的混合基质中培育，培育温度 15-25°C。
全文摘要
本发明提供一种大花红景天的组培育苗方法，其包括以下步骤(1)以大花红景天叶片作为外植体进行出芽培养形成不定芽；(2)将不定芽进行增殖培养形成单苗；(3)将丛生芽伸长后得到的单苗进行生根培养形成生根苗；(4)移栽生根苗；其中，出芽培养的培养基为添加了10-20μmol/L的6-苄基氨基嘌呤和1-5μmol/L的赤霉素的MS培养基。本发明通过初代培养黑暗处理及生根过程添加活性炭的组合处理强化了大花红景天高效育苗方法，解决了大花红景天生根苗繁殖系数低的问题，丛生芽20天的增殖系数为2-3倍，生根率达到95％以上，移栽成活率最高达到90％以上。本发明提供的方法分化频率高，生长周期短，易于大花红景天的规模化生产。
文档编号A01G31/00GK101836585SQ200910080130
公开日2010年9月22日 申请日期2009年3月19日 优先权日2009年3月19日
发明者刘春朝, 赵燕 申请人:中国科学院过程工程研究所