专利名称：纤细炭角菌的人工培养方法
技术领域：
本发明涉及菌的人工培养方法，尤其涉及炭角菌的人工培养方法。
背景技术：
炭角菌科(Xylariaceae)是真菌门、子囊菌亚门、核菌纲、球壳目的一 科，炭角菌作为珍稀物种在我国分布岁广但产量积少，天然的子实体贵如黄金， 如现在市场上已经有的人工培养的黑柄炭角菌，均采用天然黑柄炭角菌分离得 到的菌种，目前已有的炭角菌科有丛枝炭角菌、总状炭角菌，叉状炭角菌、长 柄炭角菌、鹿角炭角菌等，但目前炭角菌种类依然不足，有待进一步研发、探 究，而纤细炭角菌(Xylariagracillima)，于2006年被保藏在中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC No. 1625，是黑 翅土白蚊蚊巢中的共生菌和寄生菌，自然条件下纤细炭角菌不能独立生长，而 是和众多杂菌共生在黑翅土白蚊蚊巢中，并很难分离提取，大批量生产更难， 现在对纤细炭角菌菌种如何扩大培养及提高培养出的菌种的稳定性，同时培养 成为生产用的菌种一直是个难题。如在现有专利文献中，申请号 为200410012945. 1 、申请日2004. 03. 302004年3月30日、公告号 为CN1563350、公告日为2005年1月12日、专利权人为中国科学院水生生物 研究所的一种裂殖酵母菌及其制备方法和应用，本发明公开了一种裂殖酵母菌 及其制备方法和应用。首先是分离菌种；其次是裂殖酵母菌的培养；第三是确 定最适培养基；第四是扩大培养；第五是喷洒细菌；第六是检测净水效果。本 发明方法设备简单，无污染，安全性高，适合广泛推广和应用，此发明的制备 方法是制备裂殖酵母菌，而如何制备纤细炭角菌，针对纤细炭角菌菌种如何大培养及提高培养出的菌种的稳定性，同时培养成为生产用的菌种，现在还一
直是个难题。
发明内容
本发明针对纤细炭角菌培养成为生产用菌种难和提高培养出的纤细炭角菌的稳定性不足的问题，提供了纤细炭角菌的人工培养方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决首先从自然界地下的土层下取出成巢三年以上的黑翅土活白蚊主巢，用无菌器械把黑翅土活白蚊主巢从地下取出，直接装入无菌容器中，立即全封闭，放入5。C的环境下，使黑翅土活白蚊主巢中的黑翅土活白蚊自然死亡，待黑翅
土活白蚊死亡后，将容器中的二氧化碳气体的体积比由0.03%提高到1%-2%，将容器再次全封闭，将容器存放在2(TC黑暗环境中，经过5-10天，当纤细炭角菌菌种中逐步出现纤细炭角菌优势菌时，让优势菌在全封闭的容器中保存30-50天后，优势菌上逐步形成银白色菌丝体，复盖整个黑翅土活白蚊主巢并产生菌丝的代谢产物；
其次银白色菌丝体再经过15-20天后逐步形成菌索，5-8天后，打开容器，让自然空气流入容器中，降低容器中的二氧化碳含量，采用开放式培养方法，菌索逐步生成成熟子实体，将成熟子实体，用无菌水冲洗2-5次，再用70%浓度的酒精在成熟子实体表面进行灭菌后，用刀片将其切成3ram长的块状斜面体，接种在改良培养基上面，所述的改良培养基配方为马铃薯200克/升、葡萄糖20克/升、蚕蛹粉5-10克/升、磷酸二氢钾1-2克/升、磷酸氢二钾0. 5-1克/升、琼脂20克/升；
再次将上步的块状成熟子实体，放在20。C-25。C下培养8天，当接种处周围长出薄薄的一层灰白色的菌丝后，再培养l-2天，当 丝布满整个改良培养基表面时，即可得纤细炭角菌菌丝体，纤细炭角菌菌丝体再慢慢生长发育形成纤细炭角菌菌索，最终成纤细炭角菌。
该纤细炭角菌的形态特征为纤细炭角菌生长在黑翅土白蚊主巢上，子
实体细长呈线形、直或弯曲，长5-15.6cm，粗0.2-0.3cm，下部粗达0. 5 cm，有分枝，幼枝灰白或灰黑色或带灰兰色，上部色浅，靠顶端灰白至污白色具细绒毛，内部充实暗色，自然状态下可以产生近球形的子囊壳，突出于子座表面，可知该菌种与目前已知的其他炭角菌不同，属于一新的炭角菌种。
上述方法分离和培养出的纤细炭角菌(Xylariagracillima)，于2006年被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCCNo. 1625，地址为北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。
用上述方法取得的纤细炭角菌的人工培养方法，包括下列步骤
第一步将培养用瓶在12(TC高温中灭菌10小时，让培养用瓶自然降温;
第二步装入占培养用瓶容积l/3的混合培养基，然后再一起放在12(TC高温中灭菌10小时，再让培养用瓶自然降温；
所述的混合培养基的配方为玉米粉100克/升、黄豆粉100克/升、鱼骨
粉20克/升、葡萄糖20克/升、蚕蛹粉5-10克/升、磷酸二氢钾1-2克/升、磷酸氢二钾0. 5-1克/升、碳酸钙粉10-20克/升；
第三步在无菌环境中接入纤细炭角菌菌种，接种后封闭培养用瓶，将容
器中的二氧化碳气体的体积比由0. 03%提高到1%-2%;
第四步将封闭培养用瓶放在2(TC的的培养环境下，让纤细炭角菌菌种发
菌30-40天，当封闭培养用瓶中已形成的纤细炭角菌菌丝体开始产生代谢产物时，移到常温通气的培养房中，采用开封自然培养的方法，让已形成的纤细炭角菌的子实体得到生长，经过40—50天的自然生长后，采集生长成熟的纤细炭角菌子实体，成熟子实体通过干燥处理后保存；
第五步成熟子实体用无菌水冲洗2-5次，再用70%浓度的酒精在成熟子实体表面进行灭菌后，用刀片将其切成3mm长的块状斜面体，接种在改良培养基上；所述改良培养基配方为马铃薯200克/升、葡萄糖20克/升、蚕蛹粉5-10克/升、磷酸二氢钾1-2克/升、磷酸氢二钾0. 5-1克/升、琼脂20克/升;
第六步将上步的块状成熟子实体在20-25i:下培养8天，当接种处周围长出薄薄的一层灰白色的菌丝后，再培养1-2天，当菌丝布满整个改良培养基表面时，可得纤细炭角菌菌丝体，纤细炭角菌菌丝体再慢慢生长发育形成纤细炭角菌菌索，最终成纤细炭角菌。作为优选，所述的培养用瓶为500-700毫升。作为优选，第三步骤的接入纤细炭角菌菌种可用人工或自动接种机接种。作为优选，所述第四步骤中培养房温度大于等于1(TC，小于等于3(TC。作为优选，所述第四步骤中可通过喷水增加培养房湿度。按照本发明的技术方案，解决了纤细炭角菌菌种扩大培养成为生产用菌种的难题，提高了培养出的纤细炭角菌菌种的稳定性，同时增加了炭角菌的种类，该技术具有工艺简便、生长量大、效率高、成本低廉，且具有很好的社会效益和应用前景。保藏信息
生物材料分类命名纤细炭角菌(Xylaria gracillima);保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏编号CGMCC No. 1625;保藏日期2006年02月24日；
保藏地址北京市海淀区中关村北一条13号，中国科学院微生物研究所。
具体实施例方式
下面通过具体实施方式
对本发明作进一步详细描述实施例l，纤细炭角菌的人工培养方法，包括下列步骤
第一步将500毫升培养用瓶在12(TC高温中灭菌10小时，让培养用瓶自然降温；
第二步装入占培养用瓶容积l/3的混合培养基，然后再一起放在12CTC
高温中灭菌10小时，再让培养用瓶自然降温；
所述的混合培养基的配方为玉米粉100克/升、黄豆粉100克/升、鱼骨
粉20克/升、葡萄糖20克/升、蚕蛹粉5克/升、磷酸二氢钾l克/升、磷酸氢
二钾0. 5克/升、碳酸钙粉10克/升；
第三步在无菌环境中接入纤细炭角菌菌种，接种后封闭培养用瓶，将容器中的二氧化碳气体的体积比由0. 03%提高到1%;
第四步将封闭培养用瓶放在2(TC的的培养环境下，让纤细炭角菌菌种发菌30天，当封闭培养用瓶中已形成的纤细炭角菌菌丝体开始产生代谢产物时，移到常温通气的培养房中，培养房温度大于等于1(TC、小于等于3(TC，可通过喷水增加培养房湿度，采用开封自然培养的方法，让已形成的纤细炭角菌的子实体得到生长，经过40天的自然生长后，采集生长成熟的纤细炭角菌子实体，成熟子实体通过干燥处理后保存；
第五步成熟子实体用无菌水冲洗2次，再用70%浓度的酒精在成熟子实体表面进行灭菌后，用刀片将其切成3mm长的块状斜面体，接种在改良培养基上面，所述的改良培养基配方为马铃薯200克/升、葡萄糖20克/升、蚕蛹粉5克/升、磷酸二氢钾l克/升、磷酸氢二钾0.5克/升、琼脂20克/升；
第六步将上步的块状成熟子实体在2(TC下培养8天，当接种处周围长出薄薄的一层灰白色的菌丝后，再培养1天，当菌丝布满整个改良培养基表面时，即可得纤细炭角菌菌丝体，纤细炭角菌菌丝体再慢慢生长发育形成纤细炭角菌菌索，最终成纤细炭角菌。
实施例2，纤细炭角菌的人工培养方法，包括下列步骤
第一步将700毫升培养用瓶在120。C高温中灭菌10小时，让培养用瓶自然降温；
第二步装入占培养用瓶容积l/3的混合培养基，然后再一起放在12(TC
高温中灭菌10小时，再让培养用瓶自然降温；
所述的混合培养基的配方为玉米粉100克/升、黄豆粉100克/升、鱼骨
粉20克/升、葡萄糖20克/升、蚕蛹粉10克/升、磷酸二氢钾2克/升、磷酸氢二钾l克/升、碳酸钙粉20克/升；
第三步在无菌环境中接入纤细炭角菌菌种，接种后封闭培养用瓶，将容器中的二氧化碳气体的体积比由0. 03%提高到2%;
第四步将封闭培养用瓶放在2(TC的的培养环境下，让纤细炭角菌菌种发菌40天，当封闭培养用瓶中已形成的纤细炭角菌菌丝体开始产生代谢产物时，移到常温通气的培养房中，培养房温度大于等于1(TC、小于等于3(TC，可通过喷水增加培养房湿度，采用开封自然培养的方法，让己形成的纤细炭角菌的子实体得到生长，经过50天的自然生长后，采集生长成熟的纤细炭角菌子实体，成熟子实体通过干燥处理后保存；
第五步成熟子实体用无菌水冲洗5次，再用70%浓度的酒精在成熟子实体表面进行灭菌后，用刀片将其切成3mm长的块状斜面体，接种在改良培养基上面；所述的改良培养基配方为马铃薯200克/升、葡萄糖20克/升、蚕蛹粉10克/升、磷酸二氢钾2克/升、磷酸氢二钾l克/升、琼脂20克/升；第六步将上步的切成块状斜面体的成熟子实体在25。C下培养8天，当接 种处周围长出薄薄的一层灰白色的菌丝后，再培养2天，当菌丝布满整个改良
培养基表面时，即可得纤细炭角菌菌丝体，纤细炭角菌菌丝体再慢慢生长发育 形成纤细炭角菌菌索，最终成纤细炭角菌。
实施例3，纤细炭角菌的人工培养方法，包括下列步骤
第一步将600毫升培养用瓶在12(TC高温中灭菌10小时，让培养用瓶自 然降温；
第二步装入占培养用瓶容积l/3的混合培养基，然后再一起放在12(TC 高温中灭菌10小时，再让培养用瓶自然降温；
所述的混合培养基的配方为玉米粉100克/升、黄豆粉100克/升、鱼骨 粉20克/升、葡萄糖20克/升、蚕蛹粉8克/升、磷酸二氢钾1.5/升、磷酸氢 二钾0.8克/升、碳酸钙粉15克/升；
第三步在无菌环境中接入纤细炭角菌菌种，接种后封闭培养用瓶，将容 器中的二氧化碳气体的体积比由0. 03%提高到1. 5%;
第四步将封闭培养用瓶放在2(TC的的培养环境下，让纤细炭角菌菌种发 菌35天，当封闭培养用瓶中己形成的纤细炭角菌菌丝体开始产生代谢产物时， 移到常温通气的培养房中，培养房温度大于等于1(TC、小于等于3(TC，可通过 喷水增加培养房湿度，采用开封自然培养的方法，让已形成的纤细炭角菌的子 实体得到生长，经过45天的自然生长后，采集生长成熟的纤细炭角菌子实体，
成熟子实体通过干燥处理后保存；
第五步成熟子实体用无菌水冲洗3次，再用70%浓度的 精在成熟子实 体表面进行灭菌后，用刀片将其切成3mm长的块状斜面体，接种在改良培养基 上面；所述的改良培养基配方为马铃薯200克/升、葡萄糖20克/升、蚕蛹粉7克/升、磷酸二氢钾1.5克/升、磷酸氢二钾0.7克/升、琼脂20克/升；
第六步将上步的块状斜面体的成熟子实体在23'C下培养8天，当接种处 周围长出薄薄的一层灰白色的菌丝后，再培养1.5天，当菌丝布满整个改良培
养基表面时，即可得纤细炭角菌菌丝体，纤细炭角菌菌丝体再慢慢生长发育形 成纤细炭角菌菌索，最终成纤细炭角菌。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作 的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。
权利要求
1.纤细炭角菌的人工培养方法，其特征在于所述纤细炭角菌(Xylariagracillima)，CGMCC No.1625，其人工培养方法包括下列步骤第一步将培养用瓶在120℃高温中灭菌10小时，再让培养用瓶自然降温；第二步装入占培养用瓶容积1/3的混合培养基，然后再一起放在120℃高温中灭菌10小时，再让培养用瓶自然降温；所述的混合培养基的配方为玉米粉100克/升、黄豆粉100克/升、鱼骨粉20克/升、葡萄糖20克/升、蚕蛹粉5-10克/升、磷酸二氢钾1-2克/升、磷酸氢二钾0.5-1克/升、碳酸钙粉10-20克/升；第三步在无菌环境中接入纤细炭角菌菌种，接种后封闭培养用瓶，将容器中的二氧化碳气体的体积比由0.03％提高到1％-2％；第四步将封闭培养用瓶放在20℃的培养环境下，让纤细炭角菌菌种发菌30-40天，当封闭培养用瓶中已形成的纤细炭角菌菌丝体开始产生代谢产物时，移到常温通气的培养房中，采用开封自然培养的方法，让已形成的纤细炭角菌的子实体得到生长，经过40--50天的自然生长后，采集生长成熟的纤细炭角菌子实体，成熟子实体通过干燥处理后保存；第五步成熟子实体用无菌水冲洗2-5次，再用70％浓度的酒精在成熟子实体表面进行灭菌后，用刀片将其切成3mm长的块状斜面体，接种在改良培养基上面；所述的改良培养基配方为马铃薯200克/升、葡萄糖20克/升、蚕蛹粉5-10克/升、磷酸二氢钾1-2克/升、磷酸氢二钾0.5-1克/升、琼脂20克/升；第六步将上步的成熟子实体在20-25℃下培养8天，当接种处周围长出薄薄的一层灰白色的菌丝后，再培养1-2天，当菌丝布满整个改良培养基表面时，即可得纤细炭角菌菌丝体，纤细炭角菌菌丝体再慢慢生长发育形成纤细炭角菌菌索，最终成纤细炭角菌。
2. 根据权利要求1所述的纤细炭角菌的人工培养方法，其特征在于所述的培养用瓶为500-700ml。
3. 根据权利要求1所述的纤细炭角菌的人工培养方法，其特征在于所述第三步中接入纤细炭角菌菌种可用人手或自动接种机接种。
4. 根据权利要求1或2或3所述的纤细炭角菌的人工培养方法，其特征在于所述第四步中培养房温度大于等于1(TC，小于等于3(TC。
5. 根据权利要求1或2或3所述的纤细炭角菌的人工培养方法，其特征在于所述第四步中可通过喷水增加培养房湿度。
6. 根据权利要求4所述的纤细炭角菌的人工培养方法，其特征在于所述第四步骤中可通过喷水增加培养房湿度。
全文摘要
本发明涉及菌的人工培养方法，公开了纤细炭角菌(Xylaria gracillima)的人工培养方法，将培养用瓶在120℃中灭菌后自然降温，装入混合培养基，120℃中再灭菌、自然降温，接入纤细炭角菌菌种后封闭培养用瓶，20℃下发菌后用开封自然培养法获得纤细炭角菌成熟子实体，将其用无菌水冲洗、70％浓度酒精灭菌后切成3mm长的块状斜面体，接种在改良培养基上，当接种处长出灰白色菌丝后再培养1-2天，即得纤细炭角菌菌丝体，再慢慢生长发育形成菌索，最终成纤细炭角菌。该技术解决了纤细炭角菌菌种培养成生产用菌种的难题，工艺简便、生长量大、效率高、成本低廉，有很好的社会效益和应用前景。
文档编号A01G1/04GK101653081SQ20091009995
公开日2010年2月24日 申请日期2009年6月25日 优先权日2009年6月25日
发明者朱志熊 申请人:浙江三禾生物工程有限公司;朱志熊