专利名称：利用发酵法生产l-色氨酸饲料添加剂的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物生态制剂领域，涉及L-色氨酸的产生菌及其高效发酵生产工 艺技术和在饲料添加剂中的应用。
背景技术：
色氨酸的生产方法主要有早期的化学合成法和蛋白质水解法，以及后来发展起来 的微生物法。其中微生物法随着研究的不断深入，已经走向实用并且处于主导地位。微生 物法大致可分为直接发酵法、微生物转化法和酶法。由于重组DNA技术在微生物育种中的 应用，为优良的色氨酸生产菌株的筛选和产酸水平的提高提供了可靠的技术保障，使微生 物直接发酵法生产色氨酸成为一种廉价的工业工业化生产方法。运用于色氨酸生产的菌种 有谷氨酸棒状杆菌、黄色短杆菌、北京棒杆菌等。近年来，随着蛋氨酸、赖氨酸的大量饲料化应用，色氨酸在饲料添加剂上的应用日 益广泛。在我国对直接发酵法生产色氨酸虽作了一些研究工作，但发酵产酸水平较低。浙 江大学与1997年曾将色氨酸产率提升至5. 5g/L;2002年，王健等报道了菌株TQ2223的产 酸量为7. 28g/L ；2005年，陈宁等报道了一株通过诱变的谷氨酸棒杆菌产酸为10. 01g/L。总 的来说国内尚无产业化生产应用的稳定的高产菌株。而国外一些厂家已在应用发酵法生产 L-色氨酸，如日本味之素公司等，但其年产量很低，仅为100吨左右，产量远不能满足饲料 生产的需求。国外用前体转换发酵生产色氨酸的方法已获得成功已公布的产酸量最高可达 70g/L，但成本却比较高，难以规模化生产应用。氨基酸类饲料添加剂因作用重大，价格较高，目前大多数为进口产品。猪的第一、 第二限制性氨基酸为赖氨酸和蛋氨酸；鸡的第一、第二限制性氨基酸则刚好与之相反。而色 氨酸是继赖氨酸、蛋氨酸之后的主要限制性氨基酸，其在自然界含量甚少，具有多种重要的 生理功能。由于目前我国配合饲料中大量添加赖氨酸和蛋氨酸，使色氨酸处于相对缺乏的 状态，需求量呈上升趋势；同时由于色氨酸的发酵产酸率很低，难以工业化大量生产，导致 其价格高昂，目前需要大量进口。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术中存在的问题，以LZS-I和LZS-2为出发菌株，根据 色氨酸代谢路径，设计营养缺陷型、代谢类似物抗性等诱变谱，通过不同诱变剂诱变筛选， 得到L-色氨酸高产稳定的菌株，在此基础上建立发酵液中色氨酸含量的检测方法，进行培 养基和发酵工艺条件优化，以期达到降低生产成本，提高效率的目的，并将L-色氨酸发酵 液应用于饲料添加剂。由于采用液态添加克服了菌株产酸率低，成本高的技术难题，液态生 产的L-色氨酸饲料添加剂具有成本低廉、质量安全、动物吸收利用率高，可改善畜禽动物 饲料中氨基酸平衡，提高饲料利用率与蛋白质合成。
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例1、L-色氨酸的高产菌的选育与生物学特性对出发菌谷氨酸棒杆菌LZS-I和LZS-2进行紫外、亚硝酸钠、硫酸二乙酯以及亚硝 基胍诱变以及一系列初筛和复筛，得到一株产酸L-色氨酸量为38. 27g/L的菌株。该菌为 酪氨酸营养缺陷型，对6-氟色氨酸、5-甲基色氨酸、5-氟色氨酸、4-氟苯丙氨酸、磺胺胍和 肉桂酸表现出不同程度的抗性。(1)、紫外诱变在固定紫外灯40瓦，距离20cm的条件下，经过30s、60s和90s的紫外照射诱变下， 菌株的致死率分别达到54%、79. 5%和99%。显然60s的为较理想的诱变时间，能够获得 约80%的致死率。进行菌株摇瓶产酸测定。观察数据结果诱变后菌株产酸均有不同程度提高，对其 中产酸提高较明显的两株进行保存，并命名为JMU-U13和JMU-U32，其产酸分别为5. 4g/L 和 4. 4g/L。(2)、亚硝酸钠诱变固定NaNO2诱变浓度为0. 03mol/L,经过120s、240s和360s的诱变后，致死率分别为 0%、57%和80. 5%,以达到80%致死率为选择条件，则应选取360s作为亚硝酸钠的诱变时间。对经过紫外诱变的两株菌JMU-U13和JMU-U32进行诱变，并对诱变结果进行摇瓶 培养和产酸分析。结果对两株菌的诱变只有为数不多的几个产酸提高的正诱变，其中对 JMU-U13的诱变获得一株产酸达到5. 6g/L的突变株，对其进行保存，并命名为JMU-N5。(3)、硫酸二乙酯(DES)诱变以25%妝28203水溶液为诱变剂，经过15min、30min和60min不同时间诱变后，菌 株致死率分别达到19%、79. 5%和99%。以80%致死率为较理想的诱变筛选条件，则诱变 处理时间为30min。对经过亚硝酸钠诱变筛选得到的JMU-N5进行DES诱变和筛选，对诱变结果进行摇 瓶培养和产酸测定。得到3株产酸较出发菌提高的突变菌，其中一株产酸率较三者高，达到 6. 2g/L，对该菌进行保存并命名为JMU-Dl。(4)、亚硝基胍(NTG)诱变固定诱变条件NTG的浓度为100 μ g/mL，室温下，在一小时时间内，每隔IOmin测定 菌株致死率，结果诱变20min，致死率为72. 8%，为较理想的诱变时间。以经过DES诱变的JMU-Dl菌株为出发菌进行诱变筛选，诱变条件如上，同时加上 抗性药物6-氟色氨酸的浓度为1. 5mg/mL，2mg/mL。结果从2mg/mL 6-氟色氨酸平板上挑出 42株，1. 5mg/mL 6-氟色氨酸平板上挑出102株，经过初筛和复筛得到一株产酸7. 3g/L的 菌株并将该菌株重新命名为5FT-1-30，经营养缺陷型验证为酪氨酸缺陷型。对5FT-1-30进行诱变，诱变条件同上，6_氟色氨酸浓度为3mg/mL，4mg/mL。结果 在3mg/mL平板上菌落生长很多，而在4mg/mL平板上生长的菌落数量较为合适。从4mg/mL 平板上挑出115株经过初筛和复筛得到4株产酸较高的菌株。其中一株产酸10. 12g/L，对 其进行保存并重新命名为JMU-N2-43。对JMU-N2-43进行诱变，诱变条件同上，6_氟色氨酸浓度为5mg/mL，6mg/mL。结果
4从6mg/mL 6-氟色氨酸平板上挑出80株，5mg/mL 6-氟色氨酸平板上挑出82株。经过初 筛得到6株产酸较高的菌株。其中产酸最高达到17. 99g/L，对其进行保存并重新命名为 JMU-N3-29。对JMU-N3-29进行诱变，诱变条件同上，6_氟色氨酸浓度为6mg/mL，8mg/mL。结果 从6mg/mL 6-氟色氨酸平板上挑出120株，8mg/mL 6-氟色氨酸平板上挑出168株。经过筛 选得到5株产酸较高的菌株，其中102号菌产酸最高，达到38. 27g/L，将其保存并重新命名 为 JMU-N4-102。(5)、诱变菌JMU-N4-102抗性表型分析对经过上述一系列诱变筛选，最终得到的高产突变菌JMU-N4-102进行抗性表型 实验分析，经过在添加不同浓度、不同药物平板上，该菌对所实验的药物6-氟色氨酸、5-甲 基色氨酸、4-氟苯丙氨酸、磺胺胍和肉桂酸均表现出不同程度的抗性。实施例2、L-色氨酸的摇瓶培养条件优化在诱变实验过程中，对JMU-N2-43菌进行摇瓶发酵培养基进行优化研究，结果如 表1所示。表1补糖实验因子分析 实施例3、L-色氨酸的规模化生产种子培养基组成(％)为葡萄糖5，硫酸铵0.4，玉米浆4，酵母膏1，硫酸镁0.03， 磷酸二氢钾0. 2，磷酸氢二钾0. 1，pH7. 2。发酵培养基(％ )蔗糖6，磷酸二氢钾0. 2，磷酸氢二钾0. 12，硫酸镁0. 08，硫酸铵1. 2，玉米浆4，硫酸亚铁0. 0013，硫酸猛0. 0013，硫酸铜0. 0006，L-酪氨酸0. 031，盐酸硫胺 0. 000045，ρΗ7· 0。发酵工艺为将二级种子以10%的接种量接入发酵培养基，控制温度32°C，流加氨 水自动调节PH7. 0，流加消泡剂，通气量200L/h，转速与溶氧联动，控制溶氧30%，分批高浓 度补糖，补糖浓度为300g/L，补糖时间为24、36、48、60hr。实施例4、L-色氨酸的饲料添加剂应用实验在肉鸡饲料中加入5% L-色氨酸发酵液，肉仔鸡饲料配方如下(以各成分所占百 分比)玉米58. 8、豆粕30. 8、大豆油2. 5、磷酸氢钙1. 4、食盐0. 3、石粉1. 2、L_色氨酸发酵 液5。将此配料按比例搅拌均勻，饲养1周龄肉仔鸡，饲喂4周后，肉鸡稳定生长，与饲喂未 添加L-色氨酸饲料的对照组相比，实验组肉鸡的采食量增加，肉鸡攻击性降低，啄羽、啄肛 现象减少，抗病率增强，仔鸡增重率比对照组提高10. 2%。申请日前与本发明有关的参考资料[1]宋文霞，王瑞明.L-色氨酸的研究[J].农产品加工学刊，2005 (6) =18-03.[2]李剑欣等.色氨酸的生理生化作用及其应用[J].氨基酸和生物资源2005， 27(3) 58-62[3] Masato Ikeda. Towards bacterial strains overproducing L-tryptophan and other aromatics by metabolic engineering[J]. Appl Microbiol Biotechnol(2006)69 615-626[4]周小苹，杨海军.L-色氨酸5L罐发酵条件的研究[J].农产品加工学刊， 2005. 09 51-53.[5]吴妙宗，蔡辉益.色氨酸营养代谢研究进展[J].畜禽业，2001，139(11) 47-49.[6]崔芹，崔山·色氨酸营养研究进展[J]·中国饲料，2003，15 =20-23.[7]王大慧，韦萍，欧阳平凯.D-色氨酸研究进展[J].化工进展，2002，21⑵ 103-106.[8]杨海军，周小苹.L-色氨酸发酵种子培养条件的优化[J].信阳农业高等专科 学校学报 2006，(1) 109-111[9]王健，陈宁，徐咏全，杨海军，张克旭.发酵液中色氨酸含量的快速测定.食品 与发酵工业，2004，30 (2).[10]武彩莲，郭长江，杨继军，韦京豫，徐琪寿.发酵液中L-色氨酸分离纯化工艺 研究[J]·氨基酸和生物资源2007，29 (3) 42-4权利要求
一株利用生物技术手段得到L-色氨酸高产菌株，产L-色氨酸量为38.27g/L，可工业化大量生产L-色氨酸，用于饲料添加剂。
2.如权利要求1所述的L-色氨酸饲料添加剂的生产方法，其特征在于包括以下步骤A.L-色氨酸高产菌株以谷氨酸棒杆菌LZS-I和LZS-2为出发菌株，通过对其进行紫外、亚硝酸钠、硫酸二 乙酯以及亚硝基胍诱变以及一系列初筛和复筛得到一株产酸为38. 27g/L的高产稳定的菌 株。B.利用优化的培养基在设定的发酵培养工艺条件下进行大规模发酵培养，获得L-色 氨酸发酵培养液；C.利用获得的发酵培养液生产饲料添加剂。
3.如权利要求2所述的L-色氨酸饲料添加剂的制备方法，其特征在于该高产菌为酪氨 酸营养缺陷型，对6-氟色氨酸、5-甲基色氨酸、5-氟色氨酸、4-氟苯丙氨酸、磺胺胍和肉桂 酸表现出不同程度的抗性。
4.如权利要求1所述的L-色氨酸饲料添加剂的制备方法，其特征在于种子培养基和发酵培养基。种子培养基组成(0A)为葡萄糖5，硫酸铵0.4，玉米浆4，酵母膏1，硫酸镁0. 03，磷酸 二氢钾0. 2，磷酸氢二钾0. 1，ρΗ7· 2。发酵培养基(％ )蔗糖6，磷酸二氢钾0. 2，磷酸氢二钾0. 12，硫酸镁0. 08,硫酸铵 1. 2，玉米浆4，硫酸亚铁0. 0013，硫酸锰0. 0013，硫酸铜0. 0006，L-酪氨酸0. 031，盐酸硫胺 0. 000045，ρΗ7· 0。
5.如权利要求1所述的L-色氨酸饲料添加剂的制备方法，其特征在于发酵工艺，将二 级种子以10%的接种量接入发酵培养基，控制温度32°C，流加氨水自动调节PH7. 0，流加消 泡剂，通气量200L/h，转速与溶氧联动，控制溶氧30 %，分批高浓度补糖。
6.如权利要求2所述的L-色氨酸饲料添加剂的制备方法，其特征在于分批高浓度补 糖，补糖浓度为300g/L，补糖时间为24、36、48、60hr。
7.如权利要求1所述的L-色氨酸发酵液在饲料添加剂中的应用。
全文摘要
利用发酵法生产L-色氨酸饲料添加剂，涉及L-色氨酸产生菌的选育、发酵和应用。本发明利用生物技术手段得到色氨酸高产菌株，通过发酵代谢调节及生产工艺条件优化生产L-色氨酸，分析L-色氨酸发酵液的营养组成，研究发酵液作为畜禽饲料添加剂的科学配伍，开发出畜禽用的发酵L-色氨酸饲料添加剂。本发明由于克服了菌株产酸率低的缺陷，有利于提高L-色氨酸的发酵生产水平，利用该法直接发酵生产L-色氨酸制成饲料添加剂，具有成本低、多效价的特点，可平衡饲料中的氨基酸水平，提高动物的生产性能，满足我国畜禽饲料对L-色氨酸的需求，产品具有良好市场开发应用前景。
文档编号A23K1/16GK101878856SQ20091014080
公开日2010年11月10日 申请日期2009年5月8日 优先权日2009年5月8日
发明者周常义, 苏国成, 苏文金 申请人:集美大学;苏文金;苏国成;周常义