专利名称：一种刺参用复合免疫增强剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可用于剌参饲料的添加剂，特别涉及一种剌参用的复合免疫增强剂。
背景技术：
剌参(A卯stichopus j即onicus)具有很高的食用价值和药用价值，是中国传统的 名贵海产品，自古以来就被誉为"海产八珍"之一。近年来，中国北方大力发展剌参养殖业， 剌参已成为海水养殖业中产值较大的养殖品种之一。然而，规模集约化养殖和不规范的操 作所造成的剌参病害问题日趋突出，出现了多种明显病症和大规模死亡现象，严重影响了 该行业的可持续发展。 免疫增强剂是指具有促进或诱发宿主防御反应，增强生物机体抗病能力的一类物 质，主要作用于水生无脊椎动物的非特异性免疫机制，激活机体自身的免疫机能从而达到 防御效果，增强其抗病力。免疫增强剂与抗生素和疫苗相比，具有安全、无残留、作用范围 广和使用方便等优点，其在水产养殖中的应用发展迅速，种类逐渐增多，在水产养殖中研究 和使用的免疫增强剂达数十种。目前所使用的免疫增强剂一般都是单一成分，事实已经证 明单一免疫剌激成分无法维持长期高效的免疫增强效果，且易引起养殖动物的免疫疲劳现 象，因此需要进行复合免疫增强剂的配伍和优化，开发出高效的免疫增强剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种剌参用复合免疫增强剂，它能弥补现有单一成分免疫增 强剂的上述不足。 —种剌参用复合免疫增强剂，其特征是由13 -葡聚糖和甘露寡糖所组成，|3 _葡聚 糖的质量百分数范围为55-65。 本发明作为免疫增强剂在剌参饲料中使用，添加量仅为0. 2-0. 3% (质量百分浓 度，下同)就明显促进剌参的生长，显著提高剌参的免疫力和抗病力。
具体实施例方式
—.实验饲料的制作 首先分别称取|3 _葡聚糖600g，甘露寡糖400g，将这两种成分混合均匀(要求变
异系数《5% )，即为本发明的一种剌参用复合免疫增强剂。然后以鼠尾藻粉、鱼粉、面粉、
豆粕、鱼油、卵磷脂、复合维生素、复合矿物盐和磷酸二氢钙为原料，配制2种剌参人工配合
饲料(详见表l) :1#饲料为不添加免疫增强剂的对照组；2#饲料为添加了剌参用复合免疫
增强剂的处理组。 表1 :试验饲料配方原料名称饲料1# (%)饲料2# (%)
鼠尾藻粉50. 0050. 00
鱼粉8. 008.00
豆粕13.0013.00
鱼油1.001.00
卵磷脂1. 001. 00
复合维生素0. 500. 50
复合矿物盐1.001.00
磷酸二氢钙1.001.00
面粉24. 5024. 25
本发明刺参用复合免疫增强剂00. 25 二.剌参的饲养与管理 选用当年人工孵化的同一批剌参，体重约4g，作为试验用剌参。经2周的驯养后， 挑选出体格健壮、规格一致的剌参进行分组试验。共分为2组，每组设3个平行，每个平行为 1个150L的玻璃钢桶，放养30头试验用剌参，2个组分别投喂1#和2#试验饲料。每天换水 一次，换水量为总体积的3/4，充气。在为期4周的养殖试验中，海水的溶解氧在7. 8-8. 2mg/ L， pH 7. 5-8.0，盐度30-32，温度13-15°C。每天在晚18:00投喂一次，饱食投喂，每日清除 残饵及排泄物。 三.剌参样品的采集、分析与计算
1.生长指标的测定 试验开始和结束时，对每个平行的剌参进行计数、称重，计算剌参的特定生长率和
成活率。计算方法如下 存活率=Nt/N。X100 特定生长率=(LnWt_LnW。) X100/t 其中，N。和Nt分别为每个平行剌参初始头数和终末头数，W。和Wt分别为每个平行 剌参初始体重和终末体重，t为实验天数。
2.免疫指标的测定 试验结束后，首先解剖获取剌参体腔液，将剌参体腔液与剌参抗凝剂(0. 02M
EGTA，O. 48MNaC1，0. 019M KC1，0. 068M Tris-HCl，pH 7.6)按照体积比1 : 1混匀。然后取
一部分抗凝体腔液直接用于体腔细胞计数、吞噬率以及超氧阴离子含量的测定；另一部分
抗凝体腔液经离心，弃去上清液后，加入冰冷的PBS缓冲液重悬细胞，体腔细胞悬液经超声
波破碎后，再离心，所得上清液即为细胞破碎上清液，该上清液用于超氧化物歧化酶和一氧
化氮合酶的测定。 (l)体腔细胞计数 取100 i！ L抗凝体腔液，以血球计数板在光学显微镜下进行计数，计算出体腔细胞 密度。
(2)吞噬率的测定 将1000 ii 1抗凝体腔液加入到48孔板中，加入50 y 1异硫氢酸荧光素(FITC)标 记的金黄色葡萄球菌(菌液密度为109)，混匀后，181:下避光反应1小时，加入500111冰冷 的L-15细胞培养液，终止反应，并加入80iU的台盼蓝(0.4%溶于磷酸缓冲液)猝灭未吞噬的金黄色葡萄球菌，用流式细胞仪进行检测。吞噬率的计算公式为细胞吞噬率(％ )=发生吞噬的细胞数/细胞总数X 100。
(3)超氧阴离子含量的测定 在96孔板中先加入50ii L抗凝体腔液，离心，去除上清液，然后每个孔加入200ii1的O. 2%的四唑氮蓝(NBT)溶液，18t:下反应30min。离心去掉上清液，向每个孔加入200ii1100% (体积百分浓度)甲醇，固定10min，再以70% (体积百分浓度)的甲醇水溶液洗2次，将96孔板自然风干。风干后，每孔加入120 ill 2mo1/1的KOH水溶液和140 yl的二甲基亚砜(DMSO)，沉淀溶解后，于室温下用酶标仪在630nm波长下读取吸光值。
(4)超氧化物歧化酶(SOD)活力和一氧化氮合酶(NOS)活力的测定
超氧化物歧化酶(SOD)活力和一氧化氮合酶(NOS)活力的测定均采用试剂盒(购买自南京建成生物工程研究所)进行测定。
3.抗病力的测定 检测剌参抗病力所用的菌株为剌参"腐皮综合征"致病菌-灿烂弧菌，细菌用胰蛋白胨大豆肉汤培养基(TSB)在2『C下培养24h，然后用无菌生理盐水冲洗菌落，并调整浓度至1 X 109CFU/ml。每头剌参经体腔注射100 ii L菌液。观察2周后，计算剌参的累计发病率(累计发病率=发病的剌参数/剌参总数X 100)。 最后采用SPSS 13.0 for Windows对上述指标测定数据进行单因素方差分析。实
验结果用平均值±标准误(mean士S. E.)表示。具体实验结果见表2。 试验结果表明在剌参饲料中添加本发明的剌参用复合免疫增强剂，能够显著提
高剌参的特定生长率、体腔细胞数、吞噬率、超氧阴离子含量、超氧化物歧化酶活力和一氧
化氮合酶活力，并显著降低剌参的累积发病率。由此可见，极少量的剌参用复合免疫增强剂
就能够显著提高剌参的生长、免疫力和抗病力，作为剌参长期高效的免疫增强剂是完全可行的。 表2 :投喂剌参用复合免疫增强剂对剌参存活、生长、免疫力和抗病力的影响
对照组处理组
存活率(％)100100
特定生长率(％/天)2. 00 ±0.014. 20 ±0. 03
体腔细胞数(106)13. 80±0. 3818. 17±0. 52
吞噬率(％)12. 67±0. 2619. 20±0. 26
超氧阴离子(O.D. 630nm)0. 36±0. 010. 53±0. 01
超氧化物歧化酶(U/ml)54. 34±1. 1276. ll土l.OO
一氧化氮合酶(U/ml)1. 17±0. 031.92±0. 04
累积发病率(％)55. 0±2. 918.3±1. 权利要求
一种刺参用复合免疫增强剂，其特征是由β-葡聚糖和甘露寡糖所组成，β-葡聚糖的质量百分数范围为55-65。
全文摘要
一种刺参用复合免疫增强剂，其特征是由β-葡聚糖和甘露寡糖所组成，β-葡聚糖的重量百分数范围分别为55-65。本发明作为免疫增强剂在刺参饲料中使用，添加量仅为0.2-0.3％(质量百分浓度)就能明显促进刺参的生长，显著提高刺参的免疫力和抗病力。
文档编号A23K1/18GK101720868SQ20091023157
公开日2010年6月9日 申请日期2009年12月3日 优先权日2009年12月3日
发明者张文兵, 徐玮, 王小洁, 艾庆辉, 谷珉, 马洪明, 麦康森 申请人:中国海洋大学