专利名称：：北五味子组织培养育苗生根方法
技术领域：
：本发明涉及一种植物繁殖技术，即北五味子组织培养育苗生根方法。
背景技术：
：在已有技术中，北五味子(Schisandrachinensis(Turcz)Baill)别名五味子，山花椒，是木兰科五味子属的多年生落叶木质藤本，果实及种子为著名中药，入药可以用来治疗神经衰弱、乏力、盗汗等；茎皮可做调料，香料，果汁可制作饮料、果酒等。北五味子长可达10m以上，茎皮灰褐色，皮明显，小枝褐色，稍有棱，单叶互生，质薄，稍带膜质，柄细长，叶片卵圆形，长5-llcm，宽3-5cm，先端急尖或渐尖，基部楔形，边缘疏生小尖齿，上面深绿色，有光泽，无毛，下面脉上嫩时有短柔毛，全株芳香，花单性。分布于我国东北，华北等地；朝鲜，苏联远东地区亦有。五味子作为果、药兼用资源，开发前景十分广阔。在《国家重点保护野生药材物种名录》中，五味子被列为三级保护物种。北五味子是地道的北药，但在生产中主要存在种源性状繁多，产量及有效成分含量不稳定，质量难以控制等问题，产品只能定为野生统货、栽培统货。播种繁殖变异率很高，难以得到性状一致的种苗，因而不能用于规范化生产；而分株繁殖则存在繁殖慢，易退化和传播病害，也不适于现代的大规模生产。北五味子繁育方式包括种子育苗、扦插繁殖和组织培养，采用组织培养的方法来生产五味子种苗是实现工厂化生产的基础，但至今在生产中没有得到实现。吴秀菊等于1999年报道了药用植物北五味子的组织培养，以带腋芽的嫩茎作外植体，以MS培养基为基础培养基，在附加6-BA2.o+ZTo.lrag/L，诱导芽效果佳；在附加6-BA2.0+NAA0.2+ZT0.lrag/L，芽的增殖率最好；力0.2mg/LNAA时生根效果最佳，但参照相关资料提供数据进行实验没有重现结果。
发明内容本发明的技术解决方案是北五味子组织培养育苗生根方法是利用组织培养技术获得丛生苗，并截取其茎段在生根培养基中进行预处理，之后在基质中生根。所述的生根培养基为l/8MS+IAA0.8mg/L+KT0.50mg/L，预处理培养条件温度20—24。C，暗处理48h。所述的基质为泥炭土、细河砂、腐殖质、珍珠岩或蛭石中的任一种或组合。优选为泥炭土和细河砂(泥炭土细河砂=4:1)。基质选择不限于此，还可以是植物繁殖用的常规基质。本发明的优点是1、本发明的组织培养的方法来繁殖五味子，繁殖快，繁殖系数大，管理方便，生产成本低。2、能够得到性状稳定、整齐、一致、无病虫害的五味子种苗，具有遗传稳定性较好，速度快，成苗率高，经济实用，可操作性强，简捷易掌握等特点。3、培养周期短，可周年生产，有利于实现工厂化生产和自动化控制。下面将结合实施例对本发明的实施方式作进一步详细描述。具体实施例方式北五味子组织培养育苗生根方法一、利用常规组织培养技术(如腋芽丛生分化或愈伤组织分化)获得五味子丛生苗，截取其茎段。二、丛生苗预处理和生根培养1/8MS培养基中不同浓度植物生长调节物质的交叉配比对北五味子预处理后茎段生根的影响1材料与方法1.1芽苗生根预处理培养基的筛选以1/8MS为培养基，附加不同浓度的IAA、IBA和KT。蔗糖IOg/L，琼脂8.0g/L，pH6.5，筛选最合适的生根预处理培养基。培养条件温度(22士2)。C，暗处理48h。1.2砂培生根将经过48h暗处理的嫩茎段从培养瓶中取出，在含有l.OOmg/L杀毒矾溶液中洗去茎段基部残留的琼脂，然后植入经15倍杀毒矾溶液消毒过的细河砂中，用透光好的塑料薄膜覆盖以保湿保温，湿度保持在80%，温度控制在(18士2)°C，每天中午通风换气IOmin，10d后揭去薄膜，每天早晚喷洒清水各l次，30d(天)后统计生根率。1.3方法采用1/8MS为基本培养基，附加不同浓度的植物生长调节物质IAA、IBA和KT，生长素IAA、IBA浓度均控制在O.IO—I.OOmg/L之间，KT浓度控制在O.IO—O.50mg/L之间。由预试验可知，生长素浓度超过l.OOmg/L幼苗基部膨胀并产生愈伤瘤，继续培养根从愈伤瘤上发出，这样的苗在移栽时，根随愈伤瘤从苗基部脱落，移栽成活率几乎为零，可能是根与苗茎的纤维疏导组织连接不完整所致，在培养基中附加适量的KT较未附加的生根快而多，可能是适当浓度的KT有利于根原基迅速形成和形成的数量较多。为了提高北五味子的生根速度和生4根率的试验效率，采用均匀设计法，每个处理接种苗数为30，选用1]1()(108)均匀表(见表1)。表lUK)(10,因素及水平设计水平因素Factors/mg/LLevelsXiX2x310.100.100.1020.200.200.2030.300.300.3040.400.400.4050.500.500.5060.600.600.1070.700.700.2080.800.800.3090.900.900.40101.001.000.502数据分析数据分析与处理采用均匀设计(UniformDesign)软件。考察IAA、IBA和KT浓度交叉配比对生根率的影响(在表和方程中，Xi为IAA浓度，X2为IBA浓度，X3为KT浓度，Y为预处理48h后砂培30d的生根率，结果见表2)。表2111()(103)均匀设计实验安排及结果处理号因素Factors/mg/LY+TreatmentcodeXix2x3/%10.100.500.2044.020.201.000.3051.530.300.400.5061.540.400.900.1055.050.500.300.2062.060.600.800.4072.070.700.200.5079.580.800.700.1073.0590.900.100.3083.0101.000.600.4090.5数据经均匀设计软件处理，得回归方程丫=33.5+46.6X^0.635X2+24.7X3，样本容量N二10，显著性水平a二0.01，复相关系数R二O.9989，检验值Ft二876.3，临界值F(o.(u，3，6)=9.780，Ft〉F(o.(u，3，6)，回归方程显著。对各方程项进行显著性检验可知检验值F(2)二0.3447，临界值F(o.(nj，6)二13.75，F(2)《F(o.01，1;6)，此方程项不显著，需要剔除，剔除不显著方程项后进行实验，将实验所得数据经均匀设计软件处理得回归方程Y=34.1+46.4X!+24.3X3，复相关系数R二O.9988，检验值Ft二1450，临界值F(o.01，2，7)=9.547，Ft〉F(o.(u，2，7)，回归方程显著。同理，对各方程项进行显著性检验可知各方程项均显著。根据回归方程求出Y的最优组合为Xfl.OO，X3=0.50，在此组合基础上求得最优解y=92.7，按公式Y二y士Ua.S计算出优化值区间估计为Y二92.7(±2.93)，g卩89.77-95.63%。以最优组合再次做验证试验，将嫩芽基部直接再生的芽苗切割成一叶一段接种到附加1.00mg/LIAA和O.50mg/LKT的l/8MS培养基上进行预处理48h后从培养瓶中取出，按l.2方法进行砂培生根，30d(天)后将茎段苗从砂中轻轻挖出，统计生根率，由生根结果表明，93%以上的茎段产生了根，有的产生了侧根且根发育均正常。通过观察发现，根发生的部位有三种情况第一种情况是60%的茎段的根直接从茎段切面发出，根数达45条以上，根长在0.502.50cm之间不等；第二种情况是30%的茎段根从苗干近基部处发出，根数大多为2条，根长为l.OOcm左右，但根粗壮且侧根较多；第三种情况是5%的苗根从茎段基部产生的愈伤瘤中发出，根数大多为45条，根长为2.00cm左右。第三种情况发生的根在移栽时，根随愈伤瘤从苗基部脱落，移栽成活率几乎为零，不宜选用于移栽，这可能是生长素浓度过高产生的。因此，将实验得到的优化值进行改良，即以浓度O.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90、1.00mg/L的IAA，附加O.50mg/LKT进行10个组合再次实验，实验结果证明，组合IAAO.80mg/L+KT0.50mg/L预处理的苗根均从茎段切面或苗干近基部处发出，是生长素浓度过高所致，生根率达95%以上。在估计区间范围内，且比所有实验Y值都大。可见，北五味子最适宜的生根预处理培养基为1/8MS+IAAO.8mg/L+KT0.50mg/L。3.结论实验结果表明，培养基ER+反式ZT2.20mg/L对北五味子嫩芽基部直接再生芽苗的诱导效果较好，反式ZT在1.502.20mg/L浓度范围内，芽苗诱导率随着反式ZT浓度的增加而升高。北五味子植株再生采取嫩芽基部直接再生芽苗的茎段在1/8MS+IAA0.8mg/L+KT0.50mg/L的6培养基中进行48h的预处理后进行常规方法进行生根，具有遗传稳定性较好，速度快，成苗率高，经济实用，可操作性强，简捷易掌握等优点，达到了高效快繁的预期目标。同时，本实验应用均匀设计处理、分析数据和再试验大大縮短了培养基的摸索周期，研究结果可为北五味子优质品种的工厂化育苗提供依据。三、五味子试管苗形成成品苗的管理技术及成品苗生长的生物学特性研究由于试管苗长期生长在培养容器中，与外界环境隔离，形成了一个独特的生态系统，这个生态系统与外界环境条件相比具有高温、高湿、弱光、无菌四大差异。只要有效的使试管苗适应这种差异，才能使之移栽成活。为提高试管苗的适应性，促其健壮，最终达到提高试管苗移栽成活率。我们从温、光、湿度及有无杂菌等环境因素考虑进行炼苗。驯化开始数天内，与培养环境条件相似；后期与预计栽培条件相似，逐步适应。1.材料与方法1.l实验材料经上法进行预处理48h进行砂培生根的株苗为观察材料。1.2方法从试管取出预处理的小芽苗，用自来水洗掉根部粘着的培养基，要全部除去，以防残留培养基滋生杂菌。栽入盛有基质(选用砂子和具一定的肥力的草炭土或腐殖土，事先浇透水)的育苗盘中，栽植时用一个筷子粗的木棍在基质中插一小孔，然后将小苗插入，注意幼苗较嫩，防止弄伤，栽后把苗周围基质压实，栽后轻浇薄水，扣塑料拱棚保证空气湿度达90%以上。在育苗盘中培养30d后，将茎段苗从砂中轻轻挖出，结合向营养钵中定植，统计生根率。将凡在芽苗基部和芽苗茎部直接生根的植株定植于20X15cm的营养钵中，钵中基质为经400倍50%多菌灵可湿粉剂消毒过的泥炭土和细河砂(4:1)，用遮光度为50%的黑色遮阳网遮光，定期浇灌。待苗趋于明显生长时揭去遮阳网，随机标记5株，每1015d进行一次测量，包括株高、茎基直径、标记叶片长和宽等，取平均值。移栽场所日光温室、塑料大棚、培养室。2、结果见表3表3每百株芽苗生根情况调査表培养切口膨大切口直接茎基部成苗率条件生根数(个)生根数(个)生根数(个)(%)日光温室5801297塑料大棚3524190培养室74838937将嫩芽基部直接再生的芽苗切割成一叶一段，接种到附加l.OOmg/LIAA和O.50mg/LKT的1/8MS培养基上，培养48h后再进行砂培，成苗率高达90%以上。由于供试材料数量较少，易于管理，三个声所没有显著差异。以日光温室为最佳。表4成苗生长情况调査表<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>植株在营养钵中生长一个生长季节可达商品苗标准，根系完全发达，株高15-25cm，茎基直径0.2-0.3cm，可用于五味子建园。但7月上旬生根培养后繁育的半成品苗，由于环境温度的下降，则出现根系虽能继续生长，但不成熟，以水根为主，难以越冬，另一方面，腋芽萌发后生长速度慢，新梢短縮，枝条幼嫩。权利要求权利要求1北五味子组织培养育苗生根方法，其特征在于利用组织培养技术获得丛生苗，并截取其茎段在生根培养基中进行预处理，之后在基质中生根。2.按照权利要求l所述的北五味子组织培养育苗生根方法，其特征在于所述的生根培养基为1/8MS+IAA0.8mg/L+KT0.50mg/L。3.按照权利要求1或2所述的北五味子组织培养育苗生根方法，其特征在于所述的预处理培养条件温度20—24。C，暗处理48h。4.按照权利要求1或2所述的北五味子组织培养育苗生根方法，其特征在于所述的基质为泥炭土、细河砂、腐殖质、珍珠岩或蛭石中的任一种或组合。5.按照权利要求4所述的北五味子组织培养育苗生根方法，其特征在于所述的基质为泥炭土和细河砂。6.按照权利要求5所述的北五味子组织培养育苗生根方法，其特征在于所述的基质为泥炭土细河砂=4:1。全文摘要本发明涉及一种植物繁殖技术，即北五味子组织培养育苗生根方法。它是利用组织培养技术获得丛生苗，并截取其茎段在生根培养基中进行预处理，之后在基质中生根。具有繁殖快，繁殖系数大，管理方便，生产成本低，成苗率高，培养周期短，可周年生产和有利于实现工厂化生产的特点。文档编号A01H4/00GK101485293SQ200910300749公开日2009年7月22日申请日期2009年3月8日优先权日2009年3月8日发明者夏广清,朱俊义,秦佳梅,顾地周申请人:朱俊义