专利名称：：一种融合基因片段rolB-FGFs及应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物领域，确切地说一种融合基因片段rolB-FGFs及应用。
背景技术：
：FGFs(fibroblastgrowthfactors)，在细胞的增值、变异和正常的生长上都是有效的调节剂，它参与病理中肿瘤的处理和转移(Gaizie，etal，Biochem，CellBiol，1997，75:669)。FGFs具有广泛的生物学活性，它来源于神经组织、垂体、肾上腺皮质、视网膜、黄体和胎盘等，能剌激所有源自中胚层的细胞以及许多源自神经外胚层和内胚层细胞的增生。在体内，FGFs对内皮细胞有趋化和促有丝分裂作用，促进血管形成；参与细胞过度增生和血管过度形成所引起的多种病理损害。FGFs被认为是剌激血管细胞增殖、迁移和分化的第一分子，是典型的血管生长因子。FGFs具有广泛的生物学效应。研究发现，FGFs对体外培养的成纤维细胞有促有丝分裂作用。FGFs参与创伤修复，可能是诱发毛细血管内皮细胞增殖，剌激内皮细胞迁移，诱发新毛细血管生长，增加毛细血管网络.使损伤组织血管化。FGFs还可促进成纤维细胞生长、增殖，促进皮肤再生。迄今为止，至少已经知道23个FGF家族的成员，其中aFGF和bFGF是FGF家族的典型成员，研究的比较成熟，但目前FGF家族的成员大多是通过原核系统或部分真核系统表达出来的，几乎很少通过植物系统表达，尤其是植物发状根系统。近几年来，利用植物生物反应器表达生产具有临床应用价值的药用蛋白(包括疫苗、抗体)已成为生物制药产业的热点领域，具有极大的市场前景和商业价值，日益引起人们的关注.但植物生物反应器在研究的过程中，逐步发现许多问题，如蛋白产量低、下游加工(目的蛋白的提取纯化)困难以及由此而引起的高成本等.因此，结合植物自身结构特点，发展植物发状根表达系统，不但可以提高植物本身的次生代谢产物含量，同时可以省略下游加工过程，利于产业化开发，因此本发明采用植物发状根系统生产FGFs蛋白，这将结合医药与食品领域，开发出功能性食品与药品的一条重要途径。利用分泌途径可以有效地提高外源蛋白的表达量。一般真核生物分泌蛋白N端都有信号肽序列，引导蛋白定位于内质网膜，经高尔基体加工后，运送到细胞的各个部位。在利用生物反应器表达外源蛋白的时候，外源蛋白可以在信号肽的引导下到达细胞的特定部位，或分泌到细胞外，这样可以避免宿主细胞把外源蛋白视为异己蛋白而降解，从而提高了外源蛋白的表达量。应用信号肽引导外源蛋白分泌表达也是近年来的研究热点。转基因植物中标记基因的安全性从一开始就受到了广泛争论。人们担心在转基因作物的商品化种植过程中，除草剂基因可能经自然杂交，抗生素基因可能通过转染肠道细菌，从而造成自然界的非转基因作物对除草剂、人类对抗生素产生抗性。近年来，人们开始采用一种新型的正筛选方法——甘露糖筛选体系。该体系以大肠杆菌磷酸甘露糖异构酶(PMI)基因为标记基因，甘露糖为筛选剂进行筛选。目前，PMI/甘露糖筛选体系已成功用于甜菜、拟南芥、玉米、小麦、水稻、木薯等植物。实验证明，发状根具有细胞培养和一般器官培养所不能兼备的特点，几乎所有双子叶植物中由根部合成的次生代谢物质都可以通过发状根来生产，这一生物技术为植物有用成分的大量生产提供了新的途径，日益引起人们的关注。发状根培养是20世纪80年代发展起来的基因工程和细胞工程相结合的一项技术，它将发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)Ri质粒中的T-DNA整合到植物细胞的DNA上，诱导植物细胞产生发状根。发状根培养是获得有用次生代谢产物的重要途径。对于任何一种类型的发根农杆菌而言，其菌体内部存在着大小各异的3种质体，例如在A4菌株的菌体内，存在着pRiA4a、pRiA4b和pRiA4c3中质粒，其中pRiA4b质粒与发状根的诱发有关，它的物理结构见图1。从图l可以看出，农杆碱型Ri质粒有两个T-DNA区，即TfDNA和TfDNA，这两段T-DNA之间隔着一段15kb的非转移DNA。TfDNA大小为1920kb，包括4个与发状根形态发生有关的位点rolA、B、C、D，rolA基因在营养阶段和生殖阶段表达强烈，而在种子中不表达。rolB基因是形成毛状根的关键基因，其表达引起植株产生大量的毛状根。rolB基因主要限于在分生组织的原始细胞和韧皮部的薄壁组织细胞表达。rolC基因在烟草中表达导致植株变矮、顶端优势减弱、叶片色素含量下降、雄性不育。自1973年Ackema皿首次报道了发根农杆菌转化高等植物以来，迄今为止已经有160多种植物成功地利用Ri质粒进行了转化。90年代以来，培养珍贵药用植物发状根以获取次生代谢产物成为研究热点。由于发状根能够合成其他培养细胞或组织难于合成的植物次生代谢物，人们已将发状根培养系统用于药用植物次生代谢产物生产的研究。周立刚对露水草诱导发状根并获得发状根培养物，这是发状根诱导在单子叶植物中的一个成功先例(植物研究，1996，18(3):336)。据报道，目前利用发状根农杆菌浸染获得转化植株或发状根的植物，主要集中在双子叶植物30余科40个属中(植物生理学通讯，2004(6):29)。迄今为止，利用发状根农杆菌的遗传转化已在多种植物中取得成功。如康乃馨(DianthuscaryophyllusL.)、长春(CatharanthusroseusU、矮牵牛(Petunia)、金鱼草(Antirrhi皿mmajusL)、亚美尼亚壶花(Muscariarmeniac咖)等的遗传转化系统已经建立并(或)获得了其转化再生植株(BioTechnology,1986，4:5330536)。目前，除利用发状根来生产药用植物的次生代谢物外，更多的研究集中在进行次生代谢物的生物转化和生产有价值的物质等。这一技术必将成为次生代谢产物生产的可靠有效途径，是大规模生产有用蛋白的重要途径之一(农业与技术，2007，27(3):31)。尽管用培养发状根生产药物还有许多困难，但可以预见，随着发状根基础研究工作的深入和代谢工程的应用及培养技术的不断发展和完善，用发状根生产药物的时代即将来临，并最终可能导致传统的植物药生产方式发生重大的变革，为人类的医药保健事业提供取之不尽、用之不竭的资源。
发明内容本发明的第一个目的是提供一种融合基因片段rolB-FGFs，它是由rolB基因和根据植物密码子的偏好性设计的FGFs基因组成；其碱基序列如SEQIDNO.8(rolB-FGFl)或SEQIDNO:9(rolB-FGF2)或SEQIDN0.10(rolB-FGF7)所示。本发明第二个目的是提供无抗生素标记的植物分泌型双元表达载体，包含无抗生素标记的P頂基因、分泌型表达的信号肽基因SEAP和上述融合基因片段rolB-FGFs的4pCAMBIA1390，表达载体名称pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs。本发明第三个目的是提供一种发根农杆菌，它转化了无抗生素标记的植物分泌型双元表达载体pCAMBIA1390-PM-SEAP-rolB-FGFs。本发明第四个目的是提供含有FGFs植物发状根，它是下述方法生产的1)人工设计合成下述引物Rl:GAATTCTTGAAGGAAAACTCTCCACCR2:TTCTTGTAGTTAGCCATTTGTAGTCGFpl:CTTGTAGTTAGCCATGTAGTCGCAFp2:GGAAGATCTTTAATCAGAAGAAACTGGCAATGG2)以发根农杆菌A4中的Ri质粒为模板，用引物Rl、R2进行PCR扩增，获得rolB基因；以质粒PUC-FGFs为模板，用引物Fpl、Fp2，经PCR扩增，获得FGFs基因；3)以获得的rolB基因和FGFs基因为模板，利用引物Rl和Fp2，通过PCR搭桥法，将rolB基因与FGFs基因进行融合，获得融合基因rolB-FGFs;4)SEAP信号肽分泌表达载体的构建，人工合成SEAP信号肽基因，两端引入kpnI、NcoI和BstB1、EcoRI酶切位点，与经kpnI和EcoRI双酶切的pCAMBIA1390-PIM载体进行连接；5)将融合基因rolB-FGFs和经EcoRI和BglII双酶切，rolB-FGFs融合基因片段与pCAMBIA1390-PIM-SEAP经EcoRI和BglII双酶切后的载体大片段进行连接，构建重组的无选择标记的植物双元表达载体pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs;6)无抗生素标记的植物分泌型双元表达载体pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs转化发根农杆菌A4中，活化含有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs质粒发根农杆菌A4;7)含有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs质粒发根农杆菌感染植物，培养发状根；所述的植物为双子叶；8)获得的含有FGFs的发状根进行大规模培养。所述的植物优选人参、西洋参或丹参。用步骤8)植物发状根及其培养液，分离纯化，生产FGFs。所述的FGFs为FGF1，其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示或FGF2，其氨基酸序列如SEQIDNO.5所示或FGF7，其氨基酸序列如SEQIDNO.7所示；所述的rolB基因，其碱基序列如SEQIDNO.1所示；所述的植物密码子的偏好性设计的FGFs基因为FGFl，其碱基序列如SEQIDNO.2所示，或FGF2，其碱基序列如SEQIDNO.4所示，或FGF7，其碱基序列如SEQIDNO.6所示；本发明一种融合基因片段rolB-FGFs，它是由rolB基因和根据植物密码子的偏好性设计的FGFs基因组成；引入无抗生素标记的PM基因、人分泌型碱性磷酸酶信号肽(SEAP)基因，构建了无抗生素标记的植物分泌型双元表达载体，转化至发根农杆菌中，以植物作为宿主，采用发状根系统来表达FGFs，从发状根和培养液中分别纯化出具有活注的FGFs，可产业化生产FGFs，提高了发状根诱导率、蛋白表达量、产率和稳定性，无抗生素标记，保护了环境；采用人参作为宿主生产的含FGFs人参发状根，具有人参和FGFs双重的药理作用，是一种较佳保健品及药品，用于功能性食品和药品的开发与应用具有广阔的前景。图1是农杆碱型发根农杆菌的Ri质粒物理结构图图2是含有FGFs的发状根培养图图3是含有FGFs的发状根鉴定图图4是FGFs家族部分基因的western检测图具体实施例方式实施例1:无抗生素标记的植物分泌型表达载体pCAMBIA1390-PMI-SEAP的构建(1)SEAP信号肽寡核苷酸链的退火对人工合成的SEAP信号肽基因序列(北京三博远志生物有限公司合成)进行了必要的修饰，即在SEAP信号肽基因编码序列正链和负链的5'和3'端分别加入了有利于后继序列连接的kpnI、NcoI和BstB1、EcoRI酶切位点。正链ATCACTGTCAGACTAGTT-3'负链GCATGCATGGTCCCAA-3'分别将合成的两条寡核苷酸链溶解于TE，使其终浓度为25ymol/L。退火反应体系正链2.0ill负链2.0illNaCl(0.5mol/L)6.0ii1灭菌超纯水加至终体积30ii185。C水浴3min，自然冷却至室温。(2)SEAP信号肽基因片段与载体的连接退火后的SEAP信号肽基因片段5'和3'端，分别有能与kpnI和EcoRI酶切位点，用kpnI和EcoRI双酶切载体pCAMBIA1390-PIM，酶切后的载体大片段用琼脂糖凝胶DNA纯化回收试剂盒回收，并用碱性磷酸酶去磷酸化，琼脂糖凝胶电泳定量后，16t:连接过夜。连接反应体系如下退火后的SEAP信号肽DNAO.10.3pmol去磷酸化的载体pCAMBIA1390-PM0.03pmol10X连接缓冲液lylT4DNA连接酶1ii1灭菌超纯水加至终体积10ill(3)重组载体转化①取一份冻存的感受态细胞冰上融化，加入上述步骤的连接产物，轻轻混匀。②冰浴30min。③将反应管放入预热至42t:的循环水浴中，放置90s，不要摇动。④快速取出反应管并移置冰上12min。6⑤加入8001YEB培养基，用水浴将培养基加温至37°C，然后将管转移到37。C摇床中，振荡培养(220rpm)lh。取200ii1已转化的感受态细胞涂布于含Kan(100yg/ml)的YEB琼脂平板上，37t:培养箱倒置培养1216h。实施例2:无抗生素标记的植物分泌型双元表达载体pCAMBIA1390-PM-SEAP-rolB-FGFs的构建在Genebank中查到rolB基因cDNA序列，利用在线软件Primer5.0和DNAStar设计引物，在上游引物R1中引入了EcoRI酶切位点，下游引物R2含有FGFs基因5'端的部分碱基；人工合成引物(由北京远志生物公司合成)Rl:GAATTCTTGAAGGAAAACTCTCCACCR2:TTCTTGTAGTTAGCCATTTGTAGTCG以发根农杆菌A4中的Ri质粒(由中国科学院长春左家特产研究所提供)为模板，经过PCR反应扩增出rolB基因的全长序列，PCR反应条件和体系如下(表1、表2):表1表2<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>以FGFs的cDNA序列设计引物，上游引物Fpl含有rolB基因3'端的部分碱基，下游引物Fp2含有BglII酶切位点，人工合成引物(由北京远志生物公司合成)Fpl:CTTGTAGTTAGCCATGTAGTCGCAFp2:GGAAGATCTTTAATCAGAAGAAACTGGCAATGG以质粒PUC-FGFs(本实验室构建保存，PUC空载体购自宝泰克公司)为模板，建立PCR反应体系(表3、表4)，经PCR扩增获得FGFs基因；表3PCR反应体系50ul为Fpl弓l物~~0.5ulFp2引物0.5"1PUC19-FGFslulPrimestarDNA聚合酶0.5y1dNTP4y12Xbuffer25ulddH2018.5表4PCR反应条件:预变性94°C4min变性94。C30sec退火55°C30sec延伸72°C42sec后延伸72°C5min循环数28cycle以rolB基因和FGFs基因为模板，利用Rl和Fp2引物，通过PCR搭桥法，将rolB基因与FGFs基因进行融合，获得rolB-FGFs的融合基因，PCR反应条件如表5、表6，将rolB-FGFs融合基因和pCAMBIA1390-PM-SEAP载体(本实验室保存，由东北师范大学王兴智老师赠予)经kpnI和BglII双酶切，将酶切后得到的rolB-FGFs融合基因片段与pCAMBIA1390-PIM-SEAP载体大片段进行连接，构建重组的无选择标记的植物双元表达载体pCAMBIA1390-PM-SEAP-rolB-FGFs，见附图2。_^__PCR反应体系50Ul为ri引物~~nnFp2引物lylrolB0.5P1FGFs0.5u1PrimestarDNA聚合酶0.5y1dNTP4u12Xbuffer25u1ddH2017.5ulPCR反应条件预变性94°C4min变性94°C30sec退火58°C30sec延伸72°Clmin30sec后延伸72°C5min循环数28cycle实施例3:发根农杆菌A4介导人参遗传转化无抗性标记的pCAMBIA1390-PM-SEAP-rolB-FGFs质粒DNA转入发根农杆菌A4:取1iilpCAMBIA1390-PM-SEAP-rolB-FGFs质粒DNA加入到100ii1发根农杆菌A4感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴放置5min;置于液氮中冷冻5min;迅速转至37。C水浴锅中温育5min;加入lmlYEB培养基中，在28。C摇床上180rpm振荡培养4h;取适量菌液涂于含有链霉素50mg/L和卡那霉素50mg/L的YEB固体培养基中，置于28。C培养24_48h，经抗性筛选、PCR检测和酶切检测获得带有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs质粒DNA的发根农杆菌A4单菌落；含pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs质粒发根农杆菌A4的活化从平板上挑取含pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs质粒的发根农杆菌A4单菌落，接种到5mlYEB液体培养基中(含卡那霉素50100mg/L，链霉素50100mg/L)，振荡培养过夜，取100ii1菌液接种到50mlYEB液体培养基中(含卡那霉素50100mg/L，链霉素50-100mg/L)，28°C，180rpm振荡培养至0D6。。=1，1200018000rpm离心10min，菌8体用YEB液体培养基重悬，使0D=0.10.6;人参的遗传转化将取生长健壮的2年生的人参(PanaxginsengC.A.Mey.)根用肥皂水洗净，70%酒精及0.1%氯化汞消毒，无菌水冲洗3次，将参根切成23mm的薄片，置于无激素的MS固体培养基上预培养12d。然后使用滴加法进行侵染，将菌液活化至0D600=0.20.6，再将其稀释100倍后，用注射器滴加在外植体上58滴，或使用划刀法，待菌液活化至0D600=0.20.6，再将其稀释5倍左右，用刀片在人参根片上轻微划几刀；置于无激素的MS固体培养基上共培养25d，25t:下暗培养诱导发根。然后转到含有20g/L浓度的PIM和抑菌抗生素的培养基上进行抑菌和筛选培养，待4060d后，长出发状根，将小发根切下，转入新的液体培养基中继续培养，含有FGFs的发根见附图2。以人参无菌苗的茎叶为外植体，先将其用0.1%的氯化汞进行表面消毒，无菌水冲洗3次，每次2min，将叶片上下两端边缘切掉，茎段切成1cm左右，置于无激素的MS固体培养基上预培养12d。使其在活化好的菌液中浸泡215min，或者将菌液稀释5倍后，用刀在茎段或叶片上轻微划几刀，但不要划破，置于无激素的MS固体培养基上共培养25d，25t:下暗培养诱导发根。西洋参的遗传转化取两年生新鲜西洋参根，用肥皂水反复冲洗多次，放入O.1%氯化汞溶液中浸泡510min，无菌水冲洗35次。在超净工作台上，用接种刀将其切成23mm厚的薄片，用镊子平放入装有培养基的三角瓶中，每个三角瓶放置23个根外植体，放入恒温恒湿培养箱中，25t:预培养23天。与人参一样采用滴加法或划刀法进行侵染转化。具体方法同上。丹参的遗传转化将丹参种子流水冲洗24h后，用0.1%的氯化荥表面消毒5min，经灭菌后的蒸馏水漂洗3次，播撒到灭菌后的湿滤纸上发芽。发芽后的种子移到无激素的MS固体培养基中，待长出无菌苗后，用离体叶柄或幼茎都可以直接按上述方法诱导出发状根。实施例4:含FGFs植物发根的鉴定转基因FGFs发状根的PCR鉴定提取转基因的发状根基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别以FGFs、rolB的上下游引物对基因组DNA进行扩增，扩增的PCR反应条件和体系(表7、表8)，分别扩增出单独的目的基因及融合后的目的基因。<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>转基因药用植物发状根的Southern-blot鉴定用CTAB法提取PCR检测呈阳性的发状根基因组DNA，选用BglII酶切过夜。将酶切好的基因组样品用0.8%琼脂糖凝胶电泳使各片段按照分子大小依次分开，用碱变性方法处理凝胶，利用毛细转移法将酶切片段由凝胶转移到固相硝酸纤维素膜上。探针标记，杂交等按照地高辛标记试剂盒操作方法操作。FGFlSouthern-blot结果见附图3。实施例5:转基因发根中FGFs蛋白的检测取lg转基因人参发状根，在液氮中研磨；加入蛋白提取缓冲液(PBS)0.5ml，4°C12000rpm离心5min;取上清液备用，上清液为发状根中的可溶性总蛋白。将发状根中的可溶性总蛋白，经肝素亲和层析、离子交换，分离纯化得到FGFs纯品蛋白，CM柱层析将CM、S印harose2F凝胶装柱(5.OcmX50cm)，用23倍体积的缓冲液A平衡，将人参发状根可溶性总蛋白缓慢上柱，流速40ml/min，继续用缓冲液A平衡至A280接近0，用缓冲液B进行洗脱，收集蛋白峰。将H印arinS印haroseCL-6B凝胶装柱(5.0cmX50cm)，用23倍体积的缓冲液B平衡，将经CM柱层析收取蛋白峰上样。流速40ml/min，分别用含0.6、1.2、2.Omol/LNaCl的20mmol/LPBpH7.0进行分段洗脱，收集aFGF蛋白峰，经SDS-PAGE电泳后，转膜用抗兔的多克隆抗体进行Western-blot杂交，表达产物与预期结果相符。FGF1结果见附图4。实施例6:转基因发根中的FGFs蛋白的活性测定用MTT法测定纯化后的FGFs蛋白和野生型FGFs对Balb/c3T3细胞的促分裂活性。结果表明，纯品蛋白的ED50值与野生型蛋白的ED50值相当。实施例7:转基因人参发根的开发应用将含有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs质粒的人参发状根，冻干成粉，保存，用于功能性食品和药品的开发与应用。10权利要求一种融合基因片段rolB-FGFs，它是由rolB基因和根据植物密码子的偏好性设计的FGFs基因组成。2.根据权利要求1所述的一种融合基因片段rolB-FGFs，其特征在于其碱基序列如SEQIDNO.8或9或10所示。3.无抗生素标记的植物分泌型双元表达载体，包含无抗生素标记的PIM基因、分泌型表达的信号肽基因SEAP和权利要求l或2所述的一种融合基因片段rolB-FGFs的pCAMBIA1390，即pCAMBIA1390-PM-SEAP-rolB-FGFs。4.一种发根农杆菌，它转化了权利要求3所述的无抗生素标记的植物分泌型双元表达载体pCAMBIA1390-PM-SEAP-rolB-FGFs。5.含有FGFs植物发状根，它是下述方法生产的1)人工设计合成下述引物Rl:GAATTCTTGAAGGAAAACTCTCCACCR2:TTCTTGTAGTTAGCCATTTGTAGTCGFpl:CTTGTAGTTAGCCATGTAGTCGCAFp2:GGAAGATCTTTAATCAGAAGAAACTGGCAATGG2)以发根农杆菌A4中的Ri质粒为模板，用引物Rl、R2进行PCR扩增，获得rolB基因；以质粒PUC-FGFs为模板，用引物Fpl、Fp2，经PCR扩增，获得FGFs基因；3)以获得的rolB基因和FGFs基因为模板，利用引物Rl和Fp2，通过PCR搭桥法，将rolB基因与FGFs基因进行融合，获得融合基因rolB-FGFs;4)SEAP信号肽分泌表达载体的构建，人工合成SEAP信号肽基因，两端引入kpnI、NcoI和BstB1、EcoRI酶切位点，与经kpnI和EcoRI双酶切的pCAMBIA1390-PIM载体进行连接；5)将融合基因rolB-FGFs和经EcoRI和BglII双酶切，rolB-FGFs融合基因片段与pCAMBIA1390-PIM-SEAP经EcoRI和BglII双酶切后的载体大片段进行连接，构建重组的无抗生素标记的植物双元表达载体pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs;6)无抗生素标记的植物双元表达载体pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs转化发根农杆菌A4中，活化含有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs质粒发根农杆菌A4;7)含有pCAMBIA1390-PIM-SEAP-rolB-FGFs质粒发根农杆菌感染植物，培养发状根；8)获得的含有FGFs的发状根进行大规模培养。6.根据权利要求5所述的含有FGFs植物发状根，其特征在于所述的植物为人参、西洋参或丹参，融合基因rolB-FGFs其碱基序列如SEQIDNO.8或9或10所示。7.根据权利要求6所述的含有FGFs植物发状根，其特征在于所述的FGFs为FGF1。8.根据权利要求5、6或7所述的含有FGFs植物发状根及其培养液，经分离纯化，生产FGFs的应用。9.根据权利要求6或7所述的含有FGFs植物发状根，用于制备保健品的应用。全文摘要本发明公开了一种融合基因片段rolB-FGFs，它是由rolB基因和根据植物密码子的偏好性设计的FGFs基因组成；引入无抗生素标记的PIM基因、人分泌型碱性磷酸酶信号肽(SEAP)基因，构建了无抗生素标记的植物分泌型双元表达载体，转化至发根农杆菌中，以植物作为宿主，采用发状根系统来表达FGFs，从发状根和培养液中分别纯化出具有活泩的FGFs，可产业化生产FGFs，提高了发状根诱导率、蛋白表达量、产率和稳定性，无抗生素标记，保护了环境；采用人参作为宿主生产的含FGFs人参发状根，具有人参和FGFs双重的药理作用，是一种较佳保健品及药品，用于功能性食品和药品的开发与应用具有广阔的前景。文档编号A01H5/06GK101768597SQ20101010609公开日2010年7月7日申请日期2010年2月5日优先权日2010年2月5日发明者刘秀明,李天航,李校堃,李海燕,杨晶,熊丽东,王艳芳申请人:吉林农业大学