专利名称：一种十字花科黑腐病菌致病相关的基因的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因在植物病害防治上的应用，尤其涉及一种十字花科黑腐病菌致病相关的基因在植物病害防治中的应用。
背景技术：
植物病害一直是困扰农业生产的主要问题之一。植物病害主要由病毒、细菌、真菌和线虫引起。病原物对寄主作物的侵害使得农作物减产甚至绝收，造成严重的经济损失。据资料统计，全球每年因病害导致的作物减产高达20%。因此，研究开发对环境友善的植物病害防治方法是人们所关心的问题。对植物病原物致病分子机理的深入研究，可为设计和发展植物病害防治新方法提供工作基础。
十字花科黑腐病菌，也称野油菜黄单胞菌野油菜致病变种 (Xanthomonascampestris pv. campestris)，会在世界范围内尤其是热带和亚热带地区引起十字花科作物(如大白菜、甘蓝、花椰菜、萝卜以及油菜)等发生黑腐病，造成严重的经济损失。该病菌属革兰氏阴性细菌，能通过水孔、气孔或伤口侵入植物体内，引起病害。十字花科黑腐病菌一直是研究植物病原菌致病性分子机理的模式菌。因此，鉴定与十字花科黑腐病菌致病相关的新的基因，对防治植物病害具有重要的意义。
近二十年来，分子植物病理学的研究确定了许多病原细菌的致病生化因子，如多糖、毒素、生化激素、胞外酶以及依赖III型分泌系统的效应蛋白分子等。III型分泌系统是近十多年来证实在动植物病原菌中保守存在并对病原菌的致病性起重要作用的分泌系统。病原菌通过该分泌系统将效应分子(毒性因子)运送至寄主细胞中，刺激或干扰寄主的正常的细胞程序，使寄主表现感病或产生抗病反应。在植物病原菌中，该分泌系统由hrp 基因(hypersensitiveresponse and pathogenicity，过敏反应禾口至文病个生)所编石马。hrp基因是一类具有在非寄主植物引起过敏反应而在寄主植物引起病害的双重功能的基因，在染色体中通常是多个基因串联在一起形成大小约为15 401Λ的hrp基因簇，不同致病变种 (pathovar)、生理小种(physiologic race)甚至种(species)的病原菌hrp基因结构和功能具有高度的相似性(或保守性)。已知病原菌生长在基本培养基或寄主内时hrp基因的表达受到诱导，而生长在营养丰富培养基则受到抑制。
有关hrp基因表达调控的分子机理一直受到人们的关注。在十字花科黑腐病菌中，hrp基因簇由约包含有20个基因的6个操纵子所构成(hrpA hrpF)，已知这些基因的表达受两个位于hrp基因簇外的基因hrpG和hrpX的编码产物所调控。hrpG编码一个OmpR 家族的双组分调控系统(two-component regulatorysystem)的响应调控蛋白 (response regulator)，但与其相应的感受蛋白(sensor)却一直没有克隆到。HrpG蛋白激发hrpX基因的表达，hrpX所编码的AraC型转录激活因子接着激活另外6个hrp操纵子的表达。但是，有关HrpG的表达受哪些蛋白质因子或环境信号的调控，目前知之甚少。
双组分调控系统是革兰氏阴性菌的一类调控系统，不同的细菌拥有数量不同的双组分调控系统。该系统调控菌体几乎所有的生理途径，如细胞间的信号传导、趋化性、芽孢形成以及致病性等等。一个典型的双组分调控系统是由一个感受蛋白和一个响应调控蛋白组成，感受蛋白位于细胞膜，能够感知周围环境的信号，而响应调控蛋白则能与相应基因的启动子区域结合，激活或阻遏相应基因的转录。感受蛋白通常是一个组氨酸激酶，当接受到外界相应信息时，发生自身磷酸化作用，然后将磷酸基团传递到响应调控蛋白的氨基末端区域，改变调控蛋白与DNA特异序列的结合能力，使得调控蛋白结合到启动子区域或从启动子区域解离下来。响应调控蛋白也可能与核糖核酸(RNAjibonucleicAcid)聚合酶互相作用，增强相应基因的转录或阻遏相应基因的转录。另外，感受蛋白也可将磷酸基团在多个调控蛋白间逐级传递。
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发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种十字花科黑腐病菌致病相关的基因及其应用，该基因编码双组分调控系统感受蛋白组氨酸激酶，并影响hrp基因的表达，作为抗病育种靶标或药物靶标应用于防治植物病害。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种十字花科黑腐病菌致病相关的基因 (XC_3670)在防治植物病害上的应用。
优选地，该基因编码双组分调控系统感受蛋白组氨酸激酶，并影响hrp基因的表达，作为抗病育种靶标或药物靶标，用于十字花科黑腐病病害的防治。
优选地，该基因是下列核苷酸序列之一 (1)序列表中序列1的DNA序列； (2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。
优选地， 自5'端的第253 1491位核苷酸为该基因的开放阅读框(ORF)，自5'端的第 253 255位核苷酸为该基因的起始密码子(ATG)，自5'端的第1492 1494位核苷酸为该基因的终止密码子(TAG)。
优选地， 序列表中序列2的蛋白质序列是该基因编码的组氨酸激酶演绎的氨基酸序列，由 413个氨基酸组成；该蛋白质序列预测分子量为47084. 01道尔顿，等电点为7. 90。
优选地，该基因的缺失突变体(3670DM)以及携带所述基因的质粒。
优选地，该质粒为pL3670。
本发明在十字花科黑腐病菌中鉴定到一个与致病性相关的编码双组分调控系统感受蛋白组氨酸激酶(HK，HiStidine Kinase)的基因，该基因调控hrpGhrpX和其它hrp基因的表达。该基因突变后，会使得病原菌对寄主植物的致病性基本丧失，诱导非寄主植物产生过敏反应的能力明显降低，hrp基因的表达水平明显降低。由于该基因编码产物组氨酸激酶是一个跨膜蛋白，能感受并传递细胞外的环境信号，因此是开发防治植物病害新方法的一个潜在的抗病育种靶标或药物靶标。
图1为本发明鉴定的基因(XC_3670)在十字花科黑腐病菌8004菌株基因组中的遗传图谱； 图2为XC_3670基因的克隆酶切电泳图谱； 图3为XC_3670基因突变体3670DM及其互补菌株C3670的菌落形态； 图4为XC_3670基因的缺失突变体3670DM及其互补菌株C3670DM在寄主萝卜叶片形成的病斑； 图5为XC_3670基因突变体3670DM及其互补菌株C3670DM在辣椒叶片引起的过敏反应； 图6为XC_3670基因对hrp基因报告质粒表达的影响。
具体实施例方式下面结合附图和优选实施例详细描述本发明的技术方案。以下例举的实施例仅用于说明和解释本发明，而不用于限制本发明的技术方案。本发明的请求保护的范围由权利要求具体限定。
本发明鉴定的十字花科黑腐病菌致病相关的基因，编码双组分调控系统感受蛋白组氨酸激酶，能够作为抗病育种靶标或药物靶标应用于防治植物病害。
本发明提供的编码双组分调控系统感受蛋白组氨酸激酶的基因(XC_3670基因)， 是下列核苷酸序列之一 1)序列表中序列1的DNA序列； 2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。
序列表中序列1的DNA序列是十字花科黑腐病菌野生型菌株8004的基因组中的一段DNA序列，由1511个核苷酸组成。该DNA序列含完整的编码组氨酸激酶的基因 XC_3670,自5'端的第253 1491位核苷酸为该基因的开放阅读框(ORF，Open Reading Frame)，自5'端的第253 255位核苷酸为该基因的起始密码子ATG，自5'端的第1492 1494位核苷酸为终止密码子TAG。
序列表中序列2的蛋白质序列是XC_3670基因编码的组氨酸激酶演绎的氨基酸序列，由413个氨基酸组成。该蛋白质序列预测分子量为47084. 01道尔顿，等电点为7. 90。
上述DNA序列已在美国国立生物技术信息中心(NCBI)公布，基因组序列号为 NC_007086，该基因编码蛋白序列号为YP_244731。该基因的缺失突变体3670DM及携带该基因的质粒PL3670已在广西大学生命科学与技术学院保存。
本发明还涉及含有上述基因(XC_3670)的表达载体，该表达载体优选为pL3670。
含有上述基因(XC_3670)的开放阅读框及其部分序列的表达载体均属于本发明的保扩范围。
将本发明提供的十字花科黑腐病菌致病相关的基因作为抗病育种靶标或药物靶标应用于防治植物病害。
在本发明的一个实施例中，所述植物病害是由十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris)所导致的十字花科作物黑腐病。
在以下实施例中所用到的材料包括 十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris)野生型菌株 8004，购于英国植物病原细菌国家保藏中心(NCPPB，The National Collection ofPlant Pathogenic Bacteria)，保藏号为 NCPPB No. 1145 ； 大肠杆菌(Escherichiacoli)株系 JM 109、载体 pGEM_3Zf (+)购自 Promega 公司； pLAFR3 (Staskawicz et al.，1987)和不带启动子的pLAFR6 (Huynh et al.，1989) 为广西大学本研究室保存的柯斯质粒；
6 限制性内切酶、连接酶和其它修饰酶等试剂购自！Iomega、QIAGEN公司等。
PCR反应所用引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
实施例1 十字花科黑腐病菌XC_3670基因突变体的构建 采用基因置换的策略，以一段927bp包含卡那霉素抗性基因(Kan)替换1239bp的 XC_3760(见图1)，构建XC_3760的缺失突变体，具体方法参照陆光涛等所描述(生物工程学报 2003，19(6) :661-667)。
根据XC_3760基因上下游的DNA序列(基因组序列号NC_007086，Qian etal. ,2005),设计弓丨物 UF/R(UF :ACAGTT GAATTCGGGCAACGTGCGCGAGTT :UR :ACAGTT GGTACCAGCAGCACCACCACGGCC)禾口 DF/R(DF :ACAGTTTCTAGACAACGGCATGAACGAGGC :DR ACAGTTCTGCAGCTCATACCGATCACTGCC)，以十字花科黑腐病菌8004菌株总DNA为模板，采用 PCR 法(95°C预变性 ^iin ；95°C变性 lmin，55°C复性 30s，74°C延伸 lmin，30 个循环；74°C延伸5min)分别扩增XC_3670基因上游412bp和下游47^p的DNA同源片段。
为方便克隆，引物的5'端分别加上相应的酶切位点序列(即上述DNA序列中的下划线部分)。另外，Kan基因DNA片段是以转座子pLAFRl::Tn5guSA5为模板，通过PCR 扩增得到的，详细可参考陆光涛等所描述(生物工程学报2003，19 (6) :661-667)。将所获得的三段片段依次克隆在载体pGEM-3Zf (+)上，得到的重组质粒再克隆到载体PLAFR3 的EcoRI位点，获得重组质粒pLA3670。通过三亲本接合，将pLA3670导入十字花科黑腐病菌8004菌株，然后通过二亲本接合，将一个与PLAFR3及其衍生质粒不相容的质粒 pPHlJI (Hirsch&Beringer. 1984.)导入，筛选XC_3760的缺失突变体。三亲本接合和二亲本接合具体方法可参考Turner等所述(198 。XC_3760的缺失突变体3670DM的菌落形态见图3。
实施例2 XC_3670基因的克隆、序列测定及XC_3670基因突变体的功能互补 根据XC_3670 基因的 DNA 序列(NC_007086，Qian et al. ,2005), 设计引物 3670F/R(3670F ACAGTTGGATCC TGCGTAATGTGCTGCAAC ；3670R ACAGTTAAGCTTGACTCCAAACTGAGGCGC)，以十字花科黑腐病菌8004菌株总DNA为模板， PCR(95°C预变性 ^iin ；95°C变性 lmin，55°C复性 30s，74°C延伸 2min，30 个循环；74°C延伸 5min)扩增该基因全长序列。为方便克隆，引物的5'端分别加上BamHI和HindIII的酶切位点序列(即上述DNA序列的下划线部分)。将所获得的DNA片段克隆至载体pGEM3Zf(+) 中，用Sanger末端中止法在ABI 377 DNA自动测序仪上测定DNA核苷酸序列(见序列1)。 将测序验证正确的XC_3670基因DNA片段克隆至穿梭载体pLAFR6的BamH/Hindlll位点上， 获得了含该基因的重组质粒PL3670。该质粒用BamH、HindIII酶切，除了一条约221Λ的载体DNA片段外，还有一条约1. 5kb的外源片段，请参见图2 1 IOObp 标准 DNA ； 2 :XC_3670 基因片段； 3 重组质粒pL3670的酶切图； 4 λ /Hindi 11 标准 DNA XC_3670基因突变体的功能互补的实施，是采用Turner等所述的三亲本接合法将重组质粒PL3670导入XC_3670基因突变体3670DM，获得携带重组质粒pL3670的菌株 C3670DM，请参见图3。
将十字花科黑腐病菌接种到IOmL的NYGB培养基中，摇床培养过夜，对培养物浓度进行调节，使OD6tltl ^ 0. 6，用移液器精确取1 μ L的培养物，分别接种于含2%葡萄糖的 NYGA培养基平板(Daniels et al.，1984)，培养箱中培养3天，再将平板放置于培养箱外，见光培养2天，拍照观察。
实施例3 十字花科黑腐病菌XC_3670基因突变体的致病性试验及诱导过敏反应能力的检测 实验所用寄主植物为萝卜苗(种名为Raphanus sativus L. var. radiculusPers.)，所用的接种方法为剪叶法(Dow et al.，2003)。十字花科黑腐病菌菌株在 NYG(每升溶液含 5g of peptone, 3g of yeast extract 禾口 20g of glycerol,根据三组分缩写为NYG，pH 7. 0 ;Daniels et al.，1984)液体培养基在中培养15-18个小时后， 稀释到0D600 0. 01，用灭过菌的剪刀在菌液浸泡5秒钟后，在健康叶片距叶尖l-2cm垂直叶脉的方向剪到中轴处，停留5秒钟，被接种的植物在25-30°C培养10天后观察结果，正对照选用十字花科黑腐病菌野生型菌株8004，负对照用清水。致病试验表明，XC_3670基因突变体3670DM在萝卜叶片上形成的病斑长度与野生型菌株8004相比显著降低，而互补菌株 C3670DM形成的病斑长度则与野生型基本相当，请参见图4，表明了 XC_3670基因与致病性有关。
过敏反应(hypersensitive reaction, HR)试验是在十字花科黑腐病菌的非寄主植物辣椒 ECW-10R (Capsicum annuum cv. ECW-10R)品种上进行(Newmanet al. ,2001) 将培养好的菌液用IOmM磷酸缓冲液(5. 8mM Na2HPO4,4. 2mMNaH2P04, pH 7. 0)稀释至 0D600 0. 01(约lX107CFU/ml)后，用不带针头的注射器将5 μ L的细菌悬浮液压渗到叶片的叶肉组织中。被接种的植物在中培养16或M小时，观察拍照，请参见图5。
实施例4 十字花科黑腐病菌XC_3670基因对hrp基因表达的影响 为了解XC_3670基因是否影响hrp基因的表达，将hrpG、hrpX和6个hrp操纵子(hrpB-F)的报告质粒 ρ⑶ShrpG、ρ⑶ShrpX、ρ⑶ShrpB、ρ⑶ShrpC、ρ⑶ShrpD、ρ⑶ShrpE、 ρ⑶SirpF分别导入野生型菌株8004及XC_3670基因缺失突变体3670DM，获得的报告菌株在 XVM2 培养基(20mM NaCl，IOmM(NH4)2S04，5mM MgSO4, ImM CaCl2,0. 16mM KH2PO4,0. 32mM K2HPO4,0. OlmM FeSO4, IOmM果糖，IOmM蔗糖，0. 03%酸水解酪素。文献见^fengelnik etal.， 1996b)培养24h后，测定葡萄糖苷酸酶(GUS)活性。结果参见图6，报告质粒在突变体背景的表达水平要比在野生型背景显著降低，表明突变体的hrpG、hrpX和其它hrp基因的表达水平降低。hrp报告质粒由本实验室构建并保存，hrp报告质粒的构建是通过将hrp 基因的启动子DNA片段与编码β-葡萄糖苷酸酶的gusA基因的编码区融合后，克隆到载体 PLAFR6而成，详细构建方法参考Huang等Q009)。⑶S活性的测定方法参考Henderson等 (1985)。
在图6中，将十字花科黑腐病菌菌株的过夜培养物的浓度调至0D_约为0. 5后，取 1. OmL 接种至Ij 200mL 的 NYGB 培养基(Daniels et al.，1984)中摇瓶培养 36h,吸取 1. OmL培养液，按Henderson等(198 所描述的方法，以硝基苯酚葡糖苷酸(P-nitrophenyl β -D-Glucuronide)为反应底物，测定GUS活性。用IOltl活菌数(cfu)所显示的酶活性来比较菌株间的⑶S活性的差异。
从本实施例可以看出，本发明要求保护的基因的失活直接导致十字花科黑腐病菌致病力的下降。因此，本发明要求保护的基因可以用于植物病害防治，特别是由十字花科黑腐病菌(Xanthomonas campestris pv. campestris)所导致的十字花科黑腐病。另外,本发明要求保护的基因可以作为开发用于植物病害防治的抗病育种靶标或药物靶标。本领域技术人员可以根据本说明书的教导和启示，开发用于防治植物病害、特别是十字花科黑腐病的药物。
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0093]XC_3670基因序列表0094]序列1 :DNA序列0095]TGCGTAATGTGCTGCAACGCGCGACGTTGCTGGCGCAGGGCGTGCGCATCGAGGCCACCG600096]ATCTCAACCTGCCGCGCAGTGCCACTGCACGTCCAGCCCCGCTGCCCGGCGGCGAGCCGG1200097]ATCGCGCACGCATCGAACAGGCCTTGGCGCGCGCGCAAGGGGTGATCGCACAGGCTGCGG1800098]CCGATCTGGGCCTAAGCCGGCAGGCGCTGTACCGGCGCATGGACCGTTACGGCATCAGCC2400099]AGGACTAGGCCGATGCTGTCGCGCTCCTTCACCTTCTCGCTGTTTCTGCGCCTGCTCCCG3000100]GTGCTGGTACTGGCTGCCGCCTTGCCGTGGGCCATTGCCTACTGGCTGGACCGTGGCTGG3600101]CAAGTGGCCGCCGTGTCGGCCGTGGTGGTGCTGCTGACGATGTGGTGGAGCCTGCAGCGC4200102]GCCACCGCGCCGATGCGCTCGCTGTTCCGCGCCCTGGCCGGCACCACCAGCAGCTACCGC4800103]GATGGCGAATACAACTTCGGTGTGTACTGGCGCGGCAACGACGAGCTGGCGCAGTTGGTA5400104]CAGGCGCATGCCGAACTGGGCGAGGTCCTGCGTGCACAGCGGCGCGATCTGGTGCAGCGC6000105]GAACTGATGCTGGACACCATGTTGCAGAACACGCCGGTGGCCATGTTGCTGGTGGTGCCC6600106]GGCGGCGATGGCCTGCGCCGCATCGGGTTTTCCAACAACGCGGCGCGCAAGCTGCTGCAT7200107]GGCGGCCGCAAGCTCGAGGGGCAGCATCTGGACGACGTGCTGGAACGCATGCCCAACGAA7800108]CTGCGCGACGCGCTGGCACGTGGTGGCGACTGTCTGTTCGCCGTGCGCGAAGACGGCGAC8400109]GATGAAGAAGACGAGCAGATCTATCACCTGTCGCGCCGCGCCTTCCATTTGAACGGCCGC9000110]GGCCACGAACTGCTGCTGATCCGCACCCTCACCACCGAACTGCGGCGCCAGGAAGTGCAG9600111]ACCTGGAAGAAAGTGATCCGGGTGATCAGCCACGAATTGAACAACTCGCTCGCGCCGATC10200112]GCCTCGCTGGCGCACTCCGGCGCCGAGCTGCTGCGCCGTGAGCGCACCGATCGGCTGGGC10800113]ACGGTGTTCGAGACCATCGAAGAACGCGCGCGCCACCTGGAGGGCTTCATTCGCGGCTAT11400114]GCGCGCTTTGCCAAACTGCCGCAGCCACAGTTGCAGACCATCGAATGGGCGCCATTTCTG12000115]GAGCGCCTGCGGCAGCAGATTCCGTTCCAGCTGGAGGGCACGCCTGTCGATGTCTCCAGC12600116]CGCATCGATGCCGCACAGATCGAACAGGCGCTGCTCAACCTGCTGAAGAACGCACACGAG13200117]GCCTGCAGTGAGGCGCAGCCGCCCAACAGCGAGGTGGCGGTGCGCGTCACCCGCTTGCCG13800118]CAGTGGCTGCGCATCGAAGTGCTGGACCGCGGCAACGGCATGAACGAGGCCGTATTGCAC14400119]AACGCACTGATGCCGTTCTATTCGACCAAGCGACGTCCCCCCAATTTTGAGTAGCGCCTC15000120]AGTTTGGAGTC 1511
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权利要求
1.一种十字花科黑腐病菌致病相关的基因(XC_3670)在防治植物病害上的应用。
2.按照权利要求1所述的应用，其特征在于，所述基因编码双组分调控系统感受蛋白组氨酸激酶，并影响hrp基因的表达，作为抗病育种靶标或药物靶标，用于十字花科黑腐病病害的防治。
3.按照权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述基因是下列核苷酸序列之一(1)序列表中序列1的DNA序列；(2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。
4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，自5'端的第253 1491位核苷酸为所述基因的开放阅读框(ORF)，自5 ‘端的第 253 255位核苷酸为所述基因的起始密码子(ATG)，自5'端的第1492 1494位核苷酸为所述基因的终止密码子(TAG)。
5.按照权利要求3所述的应用，其特征在于，序列表中序列2的蛋白质序列是所述基因编码的组氨酸激酶演绎的氨基酸序列，由 413个氨基酸组成；所述蛋白质序列预测分子量为47084. 01道尔顿，等电点为7. 90。
6.按照权利要求3至5任一项所述的应用，其特征在于，所述基因的缺失突变体 (3670DM)以及携带所述基因的质粒。
7.按照权利要求6所述的应用，其特征在于，所述质粒为PL3670。
全文摘要
本发明提供一种十字花科黑腐病菌致病相关的基因(XC_3670)在防治植物病害上的应用，该基因编码双组分调控系统感受蛋白组氨酸激酶，并影响hrp基因的表达，作为抗病育种靶标或药物靶标，可用于十字花科黑腐病病害的防治。
文档编号A01N57/16GK102187874SQ201010125229
公开日2011年9月21日 申请日期2010年3月16日 优先权日2010年3月16日
发明者唐纪良, 陆光涛, 李瑞芳, 唐永勤, 何勇强 申请人:广西大学