专利名称：一种用枯草芽孢杆菌提取的活性成分及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用枯草芽孢杆菌提取的活性成分及其应用，属于微生物农药领 域。
背景技术：
随着越来越多的有毒化学农药逐渐被限制使用，生物农药由于具有生产原料来 源广泛，对非靶标生物安全、毒副作用小、对环境兼容性好等特点，已成为全球农药产业发 展的新趋势。很多真菌的属或菌种被用于来防治病虫害如Trichoderma属，尖孢镰刀菌 (Fusarium oxysporum), Pythium oligandrum, Verticillium chlamydosporium 等。在利 用真菌开发生物农药中，产生厚垣孢子是非常重要的，因为其含有丰富的内源营养，抗逆性 大大高于分生孢子和菌丝体，可以克服分生孢子制剂存活期短，商品货架期短，而且可在土 壤中定殖而不需要添加外源营养，从而提高防效。真菌的不同种，其形成厚垣孢子的环境条件通常是有差异的，很多因素如营养、渗 透压、光、PH值、温度、空气、细菌、药物处理和植物的刺激等都能诱导真菌形成厚垣孢子。 Venkat Ram首先证明了从土壤中分离的细菌能诱导F. solani形成厚垣孢子，并认为是细 菌产生的代谢物诱导的。但到目前为止，只有李蕾等报道枯草芽孢杆菌中的能诱导木霉形 成厚垣孢子的化合物可能与抗真菌环肽物质IturinA很相似，而我们报道的能诱导真菌形 成厚垣孢子的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis C2)的代谢物与IturinA不同，IturinA 是环肽，茚三酮不显色，而此物质则显色，此物质能高效快速地诱导很多种真菌形成大量的 厚垣孢子。参考文献[l]Venkat Ram, C. S. ,1952. Soil bacteria and chlamydospore formation in Fusariumsolani. Nature 22 :4334[2] Li L. , Qu Q. , Tian B. Y. , Zhang K. Q. , 2005. Induction of Chlamydospores in Trichodermaharzianum and Gliocladium roseum by Antifungal Compounds Produced by Bacillus subtilis C2. Journal of Phytopahtology 153 686-69
发明内容
本发明的目的在于提供一种能诱导真菌形成厚垣孢子的用枯草芽孢杆菌代谢物 提取的活性成分，为开发生物农药制剂奠定基础。本发明的枯草芽孢杆菌代谢物中提取的活性成分，经如下步骤得到a.生产菌株为枯草芽孢杆菌(B. subtilis C2)，该菌株已于2010年1月20日保存 于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址中国.北京.中关村；保藏号CGMCC No 3586 ；b.将B. subtilis C2的菌种接种到试管固体培养基斜面上，于28°C下培养4天， 获得试管种，固体培养基的配方蛋白胨5g、牛肉膏3g、NaCl 5g、琼脂15g、蒸馏水1000ml、 pH 7. 2 ；
C.将试管种接种到每瓶装100_300ml液体培养基的三角瓶中，在温度25_40°C、 转速为150-250rpm下摇床培养2-5天；液体培养基配方为马铃薯200g、葡萄糖20g、水 IOOOml ；d.将含有菌体的发酵液在45°C下减压浓缩至原体积的十分之一，用正丁醇萃取3 次，正丁醇萃取部分在45°C下减压浓缩至干，得粗浸膏；e.将粗浸膏在硅胶H柱上，先用体积比为1-4 1的乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂 洗脱，然后用甲醇全部冲下，将甲醇冲下部分在45°C下减压浓缩得A馏分；f.将A馏分用C18填料分离，依次用50-70%和100%的甲醇水洗脱，将100% 洗脱下来的部分合并，在45°C下减压浓缩得B馏分；g.将B馏分用S印hadexLH-20在甲醇下洗脱，每15秒接1滴，每瓶收集液体1ml， 将11-16瓶合并，得到枯草芽孢杆菌的活性成分C。制备哈茨木霉(T. harzianum)，尖孢镰刀菌(F. oxysporum)，少孢节丛孢 (Arthrobotrys oliospora) M^lk^fU (T. harzianum),^klMMJlM (F. oxysporum) _禾中 于PDA(马铃薯200克，蔗糖20克，琼脂18克，自来水1000ml，pH自然)上，将少孢节丛孢 (Arthrobotrys oliospora)接种于CMA培养基(玉米粉20克，琼脂18克，水1000毫升) 上，将这三株菌于28°C下培养10天。用无菌蒸馏水将孢子洗下后，调整孢子浓度为104，冻 于4°C冰箱中备用。将活性成分C用DMSO (二甲基亚砜)配成IOyg/μ 1，在每个9cm平板中放入活 性成分C(4y 1)，以不添加活性成分的作为对照，然后倒入20mlPDA或CMA于平板内，使培 养基中活性成分C的浓度为2 μ g/ml，待培养基凝固后，在以PDA为培养基的表面分别涂上 300 μ 1哈茨木霉(T. harzianum)，尖孢镰刀菌(F. oxysporum)，在含有CMA培养基的表面涂 上300 μ 1少孢节丛孢(Arthrobotrys oliospora)的孢子。培养18个小时后，在含有活性 化合物C的平板内，这三株真菌都形成大量的厚垣孢子，而空白对照则需培养20天以后才 开始产厚垣孢子，且数量没有含有活性化合物的平板内的多。枯草芽孢杆菌(B. subtilis C2)提取的活性成分经试验表明能诱导哈茨木霉 (T. harzianum)、尖孢镰刀菌(F. oxysporum)、少孢节丛孢(Arthrobotrysoliospora)形成 厚垣孢子，能应用于生物农药制备中。本发明的枯草芽孢杆菌(B. subtilis C2)提取的活性成分能诱导真菌形成厚垣孢 子的代谢物，为开发生物农药制剂奠定基础。
具体实施例方式下述实施例所用的固体培养和液体培养基的配方同发明内容部分所述。实施例一将B. subtilis C2的菌种接种到试管固体培养基斜面上，于28°C下培养4天，获得 试管种。将试管种接种到500ml三角瓶中(每瓶装液体培养基100ml)，25°C下摇床培养(转 速为150rpm)5天。将含有菌体的发酵液在45°C下减压浓缩至原体积的十分之一，用正丁醇 萃取3次，正丁醇萃取部分在45°C下减压浓缩至干，得粗浸膏。将粗浸膏在硅胶H柱上，先 用体积比为1 1的乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂洗脱，然后用甲醇全部冲下，将甲醇冲下部 分在45°C下减压浓缩得A馏分。将A馏分用C18填料分离，依次用50%、100%甲醇水洗脱，将100%甲醇洗脱部分合并，在45°C下减压浓缩得B馏分。将B馏分用S印hadexLH-20 在甲醇下洗脱，每15秒接1滴，每瓶收集液体1ml，将11-16瓶合并，即为能诱导厚垣孢子的 活性成分C。将培养基中活性成分C的浓度配成2 μ g/ml，把真菌孢子涂布于培养基表面， 结果表明活性成分C是能诱导哈茨木霉(T. harzianum)、尖孢镰刀菌(F. oxysporum)、少孢 节丛孢(Arthrobotrys oliospora)快速而高效的产生厚垣孢子的代谢物。实施例二 将B. subtilis C2的菌种接种到试管固体培养基斜面上，于28 °C下培养4天，获得 试管种。将试管种接种到500ml三角瓶中(每瓶装液体培养基200ml)，培养基配方为前述 液体培养基配方，32°C下摇床培养(转速为180rpm)4天。将含有菌体的发酵液在45°C下减 压浓缩至原体积的十分之一，用正丁醇萃取3次，正丁醇萃取部分在45°C下减压浓缩至干， 得粗浸膏。将粗浸膏在硅胶H柱上，先用体积比为3 1的乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂洗 脱，然后用甲醇全部冲下，将甲醇冲下部分在45°C下减压浓缩得A馏分。将A馏分用C18填 料分离，依次用70%、100%甲醇水洗脱，将100%甲醇部分在45°C下减压浓缩得B馏分。 将B馏分用S印hadexLH-20在甲醇下洗脱，每15秒接1滴，每瓶收集液体约1ml，将11-16 瓶合并，即为能诱导厚垣孢子的活性成分C。将培养基中活性成分C的浓度配成2 μ g/ml, 把真菌孢子涂布于培养基表面，结果表明活性成分C是能诱导哈茨木霉(T. harzianum)、 尖孢镰刀菌(F. oxysporum)、少孢节丛孢(Arthrobotrys oliospora)快速而高效的产生厚 垣孢子的代谢物。实施例三将B. subtilis C2的菌种接种到试管固体培养基斜面上，28°C下培养4天，获得试 管种。将试管种接种到500ml三角瓶中(每瓶装液体培养300ml)，40°C下摇床培养(转速 为250rpm)2天。将含有菌体的发酵液在45°C下减压浓缩至原体积的十分之一，用正丁醇 萃取3次，正丁醇萃取部分在45 °C下减压浓缩至干，得粗浸膏。将粗浸膏在硅胶H柱上，先 用体积比为4 1的乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂洗脱，然后用甲醇全部冲下，将甲醇冲下部 分在45°C下减压浓缩得A馏分。将A馏分用C18填料分离，依次用60%，100%甲醇水洗 脱，将100%甲醇部分在45°C下减压浓缩得B馏分。将B馏分用S印hadexLH-20在甲醇下 洗脱，每15秒接1滴，每瓶收集液体约1ml，将11-16瓶合并，即为能诱导厚垣孢子的活性成 分C。将培养基中活性成分C的浓度配成2 μ g/ml，把真菌孢子涂布于培养基表面，结果表 明活性成分C是能诱导哈茨木霉(T. harzianum)、尖孢镰刀菌(F. oxysporum)、少孢节丛孢 (Arthrobotrys oliospora)快速而高效的产生厚垣孢子的代谢物。
权利要求
一种用枯草芽孢杆菌发酵液中提取的活性成分，其特征在于活性成分经如下步骤得到a.生产菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis C2，该菌株已于2010年1月20日保存于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，地址中国.北京.中关村；保藏号CGMCC No3586；b.枯草芽孢杆菌的液体培养基配方为蛋白胨5g、牛肉膏3g、NaCl 5g、琼脂15g、蒸馏水1000ml、pH7.2；c.枯草芽孢杆菌的发酵条件为每瓶装100-300ml液体培养基，温度25-40℃、转速为150-250rpm，摇床培养2-5天；d.将含有菌体的发酵液在45℃下减压浓缩至原体积的十分之一，用正丁醇萃取3次，正丁醇萃取部分在45℃下减压浓缩至干，得粗浸膏；e.将粗浸膏在硅胶H柱上，先用体积比为1-4∶1的乙酸乙酯和甲醇的混合溶剂洗脱，然后用甲醇全部冲下，将甲醇冲下部分在45℃下减压浓缩得A馏分；f.将A馏分用C18填料分离，依次用50-70％、100％的甲醇水洗脱，将100％甲醇洗脱部分合并，在45℃下减压浓缩得B馏分；g.将B馏分用SephadexLH-20在甲醇下洗脱，每15秒接1滴，每瓶收集液体1ml，将11-16瓶合并，得到枯草芽孢杆菌的活性成分C。
2.权利要求1所述的用枯草芽孢杆菌提取的活性成分，其特征在于该活性成分能 高效、快速地诱导哈茨木霉(T. harzianum)、尖孢镰刀菌(F. oxysporum)、少孢节丛孢 (Arthrobotrys oliospora)形成厚垣孢子的代谢物，能应用于生物农药制备中。
全文摘要
本发明涉及一种用枯草芽孢杆菌提取的活性成分及其应用，属于微生物农药领域。用枯草芽孢杆菌提取活性成分的工艺为生产菌株为枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis C2，保藏号CGMCC No3586。将菌种用液体发酵，培养基为蛋白胨5g、牛肉膏3g、NaCl 5g、琼脂15g、蒸馏水1000ml、pH 7.2；发酵条件为温度25-40℃、转速为150-250rpm、摇床培养2-5天；所得发酵液减压浓缩得粗浸膏；粗浸膏依次用硅胶H、C18、SephadexLH-20分离得到活性成分C。本发明的活性成分是具有能使在常规培养基下培养的真菌高效、快速形成厚垣孢子的代谢物，且用量少，应用于生物农药制备中。
文档编号A01N63/02GK101803616SQ20101013389
公开日2010年8月18日 申请日期2010年3月29日 优先权日2010年3月29日
发明者张克勤, 李蕾 申请人:云南大学