专利名称：水产养殖用的壳聚糖硫酸酯免疫增强剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种水产养殖用的免疫增强剂。
背景技术：
水产养殖业迅速崛起，现已成为我国农业发展的重要组成部分。但随着养殖面积的扩增，养殖密度的升高，以及养殖技术水平的相对滞后，导致目前养殖生态遭到了严重的破坏，水产病害频频发生，给我国水产养殖业造成了巨大的经济损失。细菌性败血病是我国淡水养殖区域普遍流行的传染性疾病，该病的感染谱广，死亡率高，几乎可以感染所有的养殖鱼类，其中主要对鲫、鳊、鲢、鳙、鲤、草鱼、鲮和鳜等2龄鱼危害较大。细菌性败血病适宜发病的水温为20 37°C，以25 30°C发病率最高，因此它流行季节较长，从4至11月均有发生，6 9月为发病高峰期。患此病的鱼从发现到死亡仅3 5d，死亡率一般在50%以上， 严重时可达到100%。根据现有的文献，该病是由嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、 温和气单胞菌(A. sobria)和鲁克氏耶尔森明菌(Yersinia ruckeri)等细菌感染引起的多种淡水养殖鱼类败血病，其中以嗜水气单胞菌最为常见。嗜水气单胞菌对水产动物、畜禽和人类均有致病性，是一种典型人一兽一鱼共患病病原，可引起多种水产动物的败血症和人类腹泻，为此已引起国内外水产界、兽医学界和医学界学者的高度重视。目前用于水产养殖业防治细菌性败血病的有抗生素、灭活疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗和微生态制剂等。但是由于化学药物的应用不当产生的细菌耐药性、药物残留以及对水环境的污染问题日益显著，口服灭活疫苗的防治效果欠佳，基因工程疫苗的制备工艺复杂、成本高等，故寻找安全、有效、环保的新型药物成为防治细菌性败血病亟待解决的问题。壳聚糖(chitosan，CS)是甲壳素脱酰基的产物，是天然多糖中唯一大量存在的碱性氨基多糖，广泛存在于虾、蟹和藻类、真菌的细胞壁中。它具有提高水产动物生长性能，增强水产动物免疫力和净化水质等诸多优点，但它不能溶于水，且易受潮、遇水易分解的性质在一定程度上限制了它在水产养殖领域的推广。不过壳聚糖还可以通过硫酸酯化、酰化、接枝交联、羟乙基化和氰乙基化等功能，赋予其不同的特殊性质，从而扩大了它的应用领域。多糖硫酸酯是多糖上羟基被硫酸基团取代的衍生物，由于所带硫酸基团的空间位阻和静电排斥效应改变了多糖原来的空间结构，增加了糖链的屈伸度，提高了水溶性，从而引起多糖生物活性的改变。多糖硫酸酯药物作为一种新型药物具有很多优势，如具有良好的抗病毒、抗肿瘤、抗凝血和增强免疫等生物学活性。如香菇多糖、地衣多糖、木聚糖、牛膝多糖等原来不具有抗病毒活性的多糖，经硫酸酯化修饰后都显示出抗病毒活性。金顶侧耳多糖、箬叶多糖等本身具有抗病毒活性的多糖，经硫酸酯化修饰后，其抗病毒活性显著提高。所以现阶段为了提高多糖的生物活性，常通过硫酸化修饰等方法对其进行结构改造，以获取更多的多糖硫酸酯。
发明内容
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本发明的目的在于提供一种水产养殖用的免疫增强剂。本发明采用分子量为10000 30000壳聚糖硫酸酯，其特征是将该壳聚糖硫酸酯粉末溶于无菌生理盐水中，配制成浓度为2. 5 20mg/mL的壳聚糖硫酸酯水溶液，或将该壳聚糖硫酸酯添加到水产养殖用的饲料中；该水产养殖用的饲料含量中含有壳聚糖硫酸酯 0. 1 0.4%，鱼粉40%、豆粉23%、麦麸7. 1 7.4%、鱼油、水产品复合维生素3%、 矿物质1%、卵磷脂和胆固醇0. 5% ；饲料投喂时壳聚糖硫酸酯的剂量为20 40mg/kg 鱼体重。本发明壳聚糖硫酸酯免疫增强剂的优点在于简单易行、成本低且易获得，克服了现有原料和方法的不足，在水产养殖中使用可净化水质，尤其是该免疫增强剂安全、环保， 不会弓I发药物残留或对养殖水环境造成污染，效果显著。
具体实施例方式实施例1 将壳聚糖硫酸酯粉末溶于无菌生理盐水中，配制成浓度为2. 5、5、10和20mg/mL的壳聚糖硫酸酯水溶液。本实施例通过下述试验证明壳聚糖硫酸酯水剂可增强水产动物的抗病能力，提高存活率。(1)试验菌株嗜水气单胞菌，是从发病异育银鲫腹水中分离、纯化后，经细菌生理生化指标和 16s rDNA检测、鉴定而得到的，其LC5tl为8. 55X 104cfu/g。对该菌株复壮培养Mh的细菌悬液计数，并稀释其浓度至1 X IO9CfuAiL备用于攻毒实验。(2)试验动物异育银鲫(Carassius auratus)，体表无损伤、健康，体重50g左右。(3)试验设计①将壳聚糖硫酸酯粉末溶于无菌生理盐水中，分别配制成浓度为2. 5、5、10和 20mg/mL的壳聚糖硫酸酯水溶液，待用。②根据上述浓度梯度分别对各组试验鱼腹腔注射壳聚糖硫酸酯水溶液0. 2mL (壳聚糖硫酸酯剂量分别为10、20、40和80mg/kg鱼体重)，空白组注射0. 2mL生理盐水。上述各组每组设2个平行，每个平行10尾鱼。③注射壳聚糖硫酸酯24h后，从各组银鲫的胸鳍基部注射细菌悬液0. ImL,分别于 24,48,72,96h统计异育银鲫的死亡率。(4)试验结果注射壳聚糖硫酸酯水剂后，用嗜水气单胞菌对异育银鲫攻毒的成活率情况见表1。 攻毒24h后试空白组和验组均出现死亡现象，其中空白组7 死亡率即达到85%，至全部死亡；试验组的死亡率则显著低于空白组，且在攻毒4 后死亡速度减缓。随着壳聚糖硫酸酯含量的增加，异育银鲫的存活率呈现出先增加再减少的趋势，并以注射剂量为20 40mg/kg(鱼体重)的效果较好。由此可见壳聚糖硫酸酯水剂可提高异育银鲫对嗜水气单胞菌的抗感染能力，从而提高异育银鲫的存活率。表1注射壳聚糖硫酸酯溶液防治异育银鲫细菌性败血病的效果
权利要求
1.水产养殖用的壳聚糖硫酸酯免疫增强剂，采用分子量为10000 30000壳聚糖硫酸酯，其特征是将该壳聚糖硫酸酯粉末溶于无菌生理盐水中，配制成浓度为2. 5 20mg/mL的壳聚糖硫酸酯水溶液，或将该壳聚糖硫酸酯添加到水产养殖用的饲料中。
2.根据权利要求1所述的水产养殖用的壳聚糖硫酸酯免疫增强剂，其特征在于该水产养殖用的饲料中含有壳聚糖硫酸酯0. 1 0.4%，鱼粉40%、豆粉23%、麦麸7. 1 7.4%、 鱼油M%、水产品复合维生素3%、矿物质1%、卵磷脂和胆固醇0. 5%。
3.根据权利要求1所述的水产养殖用的壳聚糖硫酸酯免疫增强剂，其特征在于饲料投喂时壳聚糖硫酸酯的剂量为20 40mg/kg鱼体重。
全文摘要
水产养殖用的壳聚糖硫酸酯免疫增强剂，本发明提供一种水产养殖用免疫增强剂。本发明采用分子量为10000～30000壳聚糖硫酸酯，其特征是将该壳聚糖硫酸酯粉末溶于无菌生理盐水中，配制成浓度为2.5～20mg/mL的壳聚糖硫酸酯水溶液，或将该壳聚糖硫酸酯添加到水产养殖用的饲料中。
文档编号A23K1/18GK102204925SQ20101013476
公开日2011年10月5日 申请日期2010年3月29日 优先权日2010年3月29日
发明者周帅, 周常, 房文红, 胡琳琳 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所