专利名称：人工种子的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有活体细胞或组织的胶囊及其应用。具体来说，本发明涉及以所含 微生物、植物或动物的活体细胞或组织为填充物、且该细胞或组织可繁殖的胶囊，含有该胶 囊的食品，以及保存稳定性好，播进土壤后可迅速发芽再分化的植物组织细胞组织的制成 胶囊的人工种子。
背景技术：
自古以来，人们就食用将微生物作用于食品后得到的发酵食品。有代表性的发酵 食品为酸乳。酸乳是将乳酸菌、双歧杆菌等(以下称乳酸菌等)作用于牛奶而得到的，制成 酸乳食用后，乳酸菌等进入肠内，在肠内活动活跃，积极地发挥调整胃肠功能的作用。然而， 到达机体的仍有活性的乳酸菌只是很少一部分，大部分都被胃里的强酸杀死了。为解决这个问题，人们正在研究将乳酸菌等放入肠溶性胶囊，送至肠内的课题 (如特开平8-242763号公报)。但使用该技术的乳酸菌等是冷冻干燥制品，冷冻干燥乳酸 菌等到吸收水分到再度表现出活性需要很长时间。因此，如果能将活体细胞送到肠内，可马上并充分发挥作用，故人们期盼使活体细 胞到达肠内的技术。另一方面，生物工程日新月异的进步，影响到医药品的开发及植物改良等各个领 域。在植物领域中，人们正在试图将可再分化的植物细胞组织(以下简称为“细胞组织”) 制成人工种子。一般来讲，人工种子是通过将细胞组织分散到多糖类、可聚低分子或交联高 分子溶液中，制成悬浊液，然后形成凝胶，由此将细胞组织包在凝胶内，形成珠状、平板状、 棒状或纤维状制品。但是，如上所述，问题在于，将细胞组织包在凝胶内的人工种子，在室温下的抗干 燥性差，制成后4天之内必须播种。因此，为防止干燥，需冷藏保存或保存在液体中，否则存 活期到不了一个月，在农家的储物室或仓库等没有特殊冷藏设备的干燥场所很难保管。为解决这类干燥问题，人们正在尝试用石蜡或蜡等覆盖凝胶表面。根据这种尝试， 尽管的确改善了保存的稳定性，但问题在于，石蜡或蜡稳定以致不易分解，因此播种在土内 时不发芽，播种时必须一粒粒开口，很是不便，无法成为实用性强的人工种子。为此，人们需要不仅可作为食品使用，并且能在医药、农业等各个领域广泛使用 的、将活体细胞封存、且可使其繁殖的技术。特别是在人工种子领域，特别要求可在没有冷 藏设备、干燥的地方至少可保存3个月的、且播种到土壤里数日后即可发芽的人工种子。如 果能得到这样的人工种子，就能广泛实用于植物，随着植物细胞组织培养技术、克隆技术以 及病毒活性技术的发展，还可广泛用于农业、林业、园艺业、花卉业等。
发明内容
为解决上述问题，本发明人等经过深入研究，结果发现可以制造内含活体细胞或 组织的悬浊液的胶囊，该胶囊可应用于食品和农业领域。本发明提供一种包含活体细胞或组织的悬浊液的胶囊，在该液体内细胞或组织可
以繁殖。本发明的更优选实施方式为，上述胶囊为无缝软胶囊。在优选实施方式中，上述细胞或组织为用于食品的细胞或植物组织。在优选实施方式中，上述细胞或组织为选自乳酸菌(包括双歧杆菌)、纳豆菌、面 包酵母、酿造用酵母、酿造用丝状菌、单细胞藻类、多细胞藻类、食用植物以及食用植物组织 中的1或2个以上的细胞。本发明还涉及含有上述胶囊的食品，含有上述胶囊的食品优选为果汁、蔬菜汁、健 康饮料、加工乳、豆乳、果冻、酸乳、乳酸菌饮料、发酵乳、碳酸饮料、纯净水、以及布丁。而且，本发明还涉及包含可再分化的植物细胞组织悬浊液的人工种子，且该细胞 或组织保存在该液体内。本发明还提供由具有最内层、覆盖该最内层的内皮层、以及覆盖该内皮层的外层 的三层或三层以上结构的无缝软胶囊构成的人工种子。该最内层中含有可再分化的植物细 胞组织(细胞组织)，该内皮层由以固化油为主要成分的内皮膜构成，且该外层膜为具有生 物降解性的外皮膜。在优选实施方式中，上述外皮膜经过干燥处理。在优选实施方式中，上述可再分化的植物细胞组织选自不定胚、不定芽、多芽体、 茎顶、生长点、原始球茎样组织、不定根、以及毛状根。而且，在优选实施方式中，上述内皮膜为常温下为固体的具有微生物降解性的固 化油。另外，在优选实施方式中，上述外皮膜为选自蛋白质、多糖类、以及生物降解性塑 料的微生物降解性外皮膜。
图1为本发明人工种子的剖面示意图
具体实施例方式以前，由水系物质很难制成胶囊，所以只有干燥细胞才能制成胶囊，因此人们曾认 为封闭在胶囊内的细胞或组织是不可能繁殖的，也完全没有尝试过。但本发明人等却首次 成功地将水系物质胶囊化，细胞或组织尽管被封闭在胶囊内，却能存活，而且还可以繁殖， 这样，就完成了本发明。根据本发明，例如以往只能输送经冷冻、干燥的乳酸菌、双歧杆菌等，仅能有缓慢 的调整胃肠功能的作用。而通过使用活的乳酸菌、双歧杆菌等，将获得立竿见影、且强有力 的促进胃肠功能的效果。而且由于细胞或组织在胶囊内可以繁殖，可获得具有更高菌体密 度(如约101(1个 1011个/g)的胶囊，故除上述食品领域外，还可广泛用于生物反应器、医 药、医疗、人工种子等多个领域。
在优选的实施方式中，胶囊内所含的液体(内容液)比例约为30%左右，所以，当 菌体密度高时，内容液的菌体密度将达到3. 3X IO11个/ml。没有制成胶囊的活菌培养时很 难到这样高的密度。而若在菌体培养后，再经浓缩达到这样高的密度，其悬浊液的粘度将非 常高，因此，根据现有技术，很难制成胶囊。为此，本发明的实用性是明显的。本发明中的所谓“胶囊”是指具有外皮膜构造、且能够将含有细胞或组织的悬浊液 或培养液密封于其中的结构的物质，该胶囊大部为球状，但也可是球状以外的其它形状。作为胶囊的外皮膜，可选用任何已用于胶囊的物质，例如，可使用天然高分子制皮 膜或合成高分子制皮膜。用于食品时，优选使用天然高分子制皮膜。胶囊的形状可是2层结构，也可是3层或3层以上的结构，优选为3层结构。 当采用3层结构时，具有活体细胞或组织的液体为最内层，覆盖该液体的中间层 为亲油性膜，最外层优选为根据用途选用具有可食性、易崩解性(生物降解性)、肠溶性、不 溶水性、活体适应性等其中的一或两种以上性质的外皮膜。最内层(内容物)是含有生理盐水、缓冲液、培养液、或维持细胞生命所必需的成 分和细胞的液态物质。以下，首先就用于食品的胶囊进行说明，然后就人工种子进行说明。当用于食品时，作为中间层的亲油性膜，可使用可供食用的各种油脂类、脂肪酸 类、糖的脂肪酸酯类等，优选使用动物性油脂、植物性油脂、上述油脂经生物学或化学处理 过的油脂等。具体可以举出各种煎炸用油、色拉油、熔点35°C以下的固化油、维生素E^J、 麦胚芽油、香油、可可脂、黄油、人造奶油、起酥油、蔗糖脂肪酸酯等。但并不限于此。当使用 这些亲油性材料时，可获得包含水系物质的胶囊。将本发明的胶囊用于食品时，作为可食性外膜优选为天然高分子皮膜，如明胶、琼 月旨、果胶、藻酸、卡拉胶、凝胶多糖、淀粉、西兰树胶、葡萄糖甘露聚酯或其混合物，或根据需 要再在上述物质中添加蛋白质、糖蛋白、粘多糖、糖、糖醇、多元糖醇等物质而得到的高分子 皮膜。添加的天然高分子具体例有阿拉伯树胶、普鲁蓝、右旋糖酐、黄原胶、槐豆胶、骨胶、 干酪素等。而且，可根据需要选用口溶性外皮膜、胃溶性外皮膜、小肠溶性外皮膜、大肠溶性 外皮膜、以及不溶解排出性外皮膜等。作为肠溶性外皮膜可用明胶或琼脂、果胶组合制成。 在外皮膜中，考虑到成型性，优选添加甘油等。优选组合为当选择三层结构时，中间层(内皮膜)_外皮膜可为维生素E油-琼 月旨、小麦胚芽油-藻脘酸钠、蔗糖脂肪酸酯-明胶、甘油中链脂肪酸酯、卡拉胶等。其中，从 所得到的胶囊物性方面考虑，优选为维生素E油-2 4%琼脂、小麦胚芽油-2 4%藻脘 酸钠。而且，内容物、内皮膜和外皮膜的构成比例根据胶囊粒径而有所不同，但体积比优 选为10 70 10 50 5 50 5 50，而更优选为30 50 25 40 25 40。本发明的胶囊优选为无缝软胶囊。根据无缝软胶囊，多重结构可分别将亲油性膜 和外皮膜作得很薄。这样，细胞或组织繁殖所必需的物质在胶囊内部和外部之间更容易移 动，胶囊内的细胞或组织可以繁殖。这样，繁殖的细胞不会漏出到外部。并且，根据需要，可采用孔径大、对物质移动阻力小、通透性好的胶囊外皮膜，或反 之，采用孔径小、对物质移动阻力大、阻碍性强的胶囊皮膜，根据不同用途做成外皮膜。由于外皮膜上带有电荷，可选择性通过带电物质，做成具有更多功能的胶囊。对胶囊内封装的细胞或组织没有特别限制，可举出细菌、酵母、霉菌、藻类、植物细 胞、植物或动物组织，可分别根据用途选用。用于食品的细胞或植物组织，乳酸菌(包括双歧杆菌)、纳豆菌、面包酵母、酿造用 酵母(葡萄酒酵母、清酒酵母、大酱酵母、酱油酵母等)、酿造用丝状菌(麦菌等)、单细胞藻 类(如绿藻、螺旋藻属等)、多细胞藻类(海白菜、海带等)、食用植物和食用植物组织(如 高丽参等)。具有这些细胞或组织的胶囊是由本领域从业人员用常用方法制得的。当具有三层 结构时，最优选为无缝软胶囊。无缝软胶囊的制造方法，揭示于例如特开平5-31352号公 报，食品加工技术第15卷p28-33、1995，或生物科学和产业，Vol. 58,No. 7、p31 34 (2000)。 特别是优选为用三层管嘴滴入法，使油状物质位于中间层(固化油)。封入胶囊内的细胞或组织的量，可由能生存或繁殖的最小量至可将经过滤或离心 分离后收集的细胞或组织高密度填充而成的量。而本发明的特点在于，由于细胞或组织在 胶囊内进行培养，可高密度繁殖，故封存入胶囊内的细胞或组织通常在接代培养时细胞或 组织浓度充足。所得的无缝软胶囊平均粒径为0. 1mm 10mm，根据用途而有所不同。更优选为 0. 2 8mm。用于食用时，平均粒径优选为4mm以下，更优选为0. 1 2mm。这种无缝软胶囊 用于食品时，吞咽感觉好，可直接使用，优选为在胶囊表面涂上淀粉、淀粉分解物、果胶等糊 剂或增粘剂。制得的含有活体细胞或组织的无缝软胶囊，悬浊于适当的培养基内进行培养，由 此可以繁殖。特别是象藻脘酸凝胶类这样凝胶形成时需要多价金属离子的皮膜材料，为维 持凝胶体强度，优选为在培养基内加入必要浓度的多价金属离子。所以，当选用藻脘酸时， 可在培养基内加入0. 01 5重量％的氯化钙、氯化锶、氯化钡及氯化铝等，优选为0. 5 3
重量％。而当胶囊内封入双歧杆菌进行胶囊培养时，因可在胶囊内培养、繁殖双歧杆菌，胶 囊内的活体双歧杆菌数可多达数百亿个/g胶囊以上，而且是在胶囊内培养活体细胞，因此 类似洗净菌体中丢掉的代谢产物(大肠杆菌素及多糖等)也蓄积在胶囊内。为此，在胶囊 内繁殖的双歧杆菌在每个胶囊内摄取，故与冷冻、干燥菌体相比，显示出调整胃肠功能作用 见效快、作用强，并对滋润皮肤、关节亦可奏效的效果。而且，封存有活体乳酸菌的胶囊，可使乳酸菌在胶囊内培养繁殖，因此，通过用于 乳酸发酵生物反应器，可高效地生成乳酸，得到不会混入菌体的培养液，还易于乳酸的回 收。根据本发明，可在所需的培养基中，使封入胶囊内的细胞或组织繁殖。而且，含有 繁殖细胞或组织的胶囊可用于食品等用途。如封存至胶囊内的乳酸菌(双歧杆菌)、高丽参 组织等在繁殖后加入果汁、蔬菜汁、健康饮料、豆乳、果冻、乳制品、酸乳、乳酸饮料、发酵乳、 碳酸饮料、纯净水、布丁等，将制成本发明的内含胶囊的食品。本发明还包括用于果冻的凝 胶类食品。而且，添加有胶囊的食品，不仅限于此。食品中所添加的胶囊量没有特别限制，100g食品添加0. 1 10g，而0. 5 3g更好。
以下，就本发明的人工种子进行说明。本发明的人工种子，是由具有最内层、覆盖 该最内层的内皮层、以及覆盖该内皮层的外层构成的三层或三层以上结构的无缝软胶囊组 成的人工种子。本发明的人工种子剖面图如图1所示。图1为三层结构图。最内层含有细 胞组织的不定胚。该最内层中，充满维持不定胚生命所必须的培养基成分和生长调节剂的 液体成分或凝胶体。内皮层由以固化油为主要成分的内皮膜(图中表示内皮膜，即固化油 皮膜)构成。而且，该固化油皮膜可防止水分蒸发、并抑制氧气透过。外层在图1中表示为 外皮膜(即明胶皮膜)，它具有物理性度，可抑制氧气透过。而且，在各种学术文献、专利文献的记述中，有将藻脘酸钙凝胶体的单一球珠称为 胶囊的情况。但这种胶囊，如后述制法所揭示的那样，与本发明的无缝软胶囊完全不同。而 且，本发明的人工种子优选为表面经过干燥处理的，也不同于湿润的藻脘酸凝胶体。本发明所用的含于最内层的细胞组织，优选为使用不定胚、不定芽、多芽体、茎顶、 生长点、原始球茎样组织、不定根、毛状根等，也可使用病毒活体组织。
为了维持细胞组织的生命，优选为将细胞组织加入例如水、生理盐水、缓冲液、培 养液或含有维持细胞组织再分化(发芽)活性所必需的成分的液体物质或凝胶状物质(以 下，总称为培养基)中，形成悬浊液。作为培养基，是指适合所需植物的、本领域从业人员常 用的培养基，具有代表性的可以举出如Murashige&Skoog基础培养基(1962年以下称“MS 培养基”)或其变体培养基。但并不限于此。而且，同时还可添加培养中常用的植物激素、 椰汁、酪蛋白水解物和酵母提取物等。而且，从播种后到内皮膜崩解、发芽需要时间，在因此 受到微生物侵害的情况下，还可添加抑制微生物繁殖的抗菌物质。作为内皮膜，优选使用以固化油为主要成分的油脂。所谓“以固化油为主要成分” 意味着在仅含有固化油的情况下，或是固化油与其它油脂混合的情况下，调整为所需性质 的物质。优选的内皮膜常温下为固体、有微生物降解性的固化油。所谓“常温下为固体的固 化油”指熔点约20°C以上的固化油。熔点30°C也可，40°C以上以至50°C以上均可。优选使 用熔点为20 50°C的固化油。选择什么样的固化油，可视保存温度、播种时期而定。作为固化油，可以举出中链脂肪酸的三甘油酯、二甘油酯等，如黄油、人造奶油、起 酥油及可可脂等，但不限于此。这种具有耐水性的内皮膜，不仅为形成水系物质胶囊所必需，而且对防止包含细 胞组织的最内层水分的挥发也很重要。所谓生物降解性或微生物降解性的意思是播种到土壤里，被微生物或其他生物分 解，或者滋生生物或微生物。由于固化油被分解或滋养生物或微生物，因此，可排除内皮膜 崩解，内容物出现在胶囊外的障碍，同时形成透氧性增加、细胞组织可由休眠状态醒来、并 分化、繁殖的环境。外皮膜因水会膨润，具有生物降解性或微生物降解性，使细胞组织分化、繁殖，排 除到胶囊外发芽时的障碍，由此为优选。作为生物降解性或微生物降解性外皮膜，可以是蛋 白质、多糖类、生物降解性塑料等。它们可单独使用，也可2种以上组合使用。作为蛋白质类，可以是明胶、骨胶等，但不限于此。它们可单独使用，也可2种以上 组合使用。作为多糖类，优选使用形成凝胶体的多糖。这类多糖，可以是琼脂、卡拉胶、阿拉伯 树胶、西兰树胶、黄原胶、果胶、藻脘酸等，但并不限于此。它们可单独使用，也可2种以上组合使用。作为生物降解性塑料，可以是聚乳酸、多羟基丁酸、及其混合物，但不限于此。它们 可单独使用，也可2种以上组合使用。而且，根据需要，可通过在上述生物降解性物质中添加糖、糖醇、多元醇、普鲁蓝、 壳聚糖等，改变皮膜的性质。作为特别优选的皮膜，可以举出干燥后、阻氧性高的明胶。本发明的制成胶囊的人工种子，可根据需要做成四层以上的结构，可根据所选材 料，使皮膜具有各种性质。还可在胶囊表面涂抹药剂等。无缝软胶囊用于食品的常用制造方法如上所述。具体可以举出例如由液体培养 基或固体培养基培养出的细胞组织(如不定胚)取适当大小的不定胚，悬浊于培养基，作为 胶囊的内容物(最内层)，而内皮膜则使用常温下为固体的固化油，而外皮膜为适当浓度的 上述生物降解性物质溶液(22%明胶溶液)，再用三重管嘴无缝软胶囊制作机，用液内滴入 法造粒。此时，控制调节泵，一个一个地滴入内容液的不定胚。胶囊滴形成和固化在凝固油 中进行，形成三层结构的胶囊。由制得的胶囊脱去凝固油后，进行圆筒烘干，由此可获得干 燥胶囊状不定胚人工种子。干燥在低温状态下进行，以免细胞组织死亡。制得的人工种子的胶囊粒径，视组织细胞的大小而不同，为Imm 12mm。优选为 3mm 10mm。封入胶囊内的细胞数目根据组织大小而定，可以从1个到多个，也可在考虑再 分化率(发芽率)的基础上，封入可给予适用于人工种子的性质的数目。根据植物的不同， 优选为1 4个。这样制成的本发明的人工种子，在干燥的储藏室内常温保存，可保持3个月以上 的发芽能力，不需在特殊的冰箱、低温水中保存。若在10°c以下的冷藏保管库内保存，保质 期可达6个月以上。本发明的人工种子胶囊，可由固化油制成内含可以再分化的植物细胞组织(细胞 组织)的中空无缝软胶囊的内皮膜，外膜由生物降解性凝胶体(蛋白质、多糖类)、生物降解 性塑料等构成，再经表面干燥而制成。采用这种结构，胶囊内的氧气供应受到限制，胶囊内 细胞组织可在一种休眠状态下生存，而且，水分蒸发也受到限制，因此常温下可保存2个月 以上。可以想象将胶囊播进土壤后，依靠水和土壤中的微生物的作用，外皮膜还有内皮膜 的固化油分解，透氧性增加，从而使这种种子由休眠状态醒来，转入发芽状态。
实施例以下，用实施例进一步具体说明本发明，但这些实施例并不构成对本发明范围的 限定。实施例1 含活体双歧杆菌胶囊的果汁饮料
取长双歧杆菌JCM70502菌落2钼圈，植入含脱脂牛奶15%、酵母提取物0. 4%、葡 萄糖3%、pH6. 5的液体脱脂牛奶培养基IOOmL中，放置在37°C的用厌氧盒(三菱瓦斯化学 株式会社)置成缺氧状态的容器内15小时，以60rpm缓慢振荡培养。其间，因pH值下降， 使用PH自动调节机，用5M-Na0H水溶液保持pH值为5. 5。培养15小时后的菌数在BL琼 脂培养基(日水制药(株)制)中进行24小时缺氧培养，对菌落计数，求得值为2 X IO9个 /ml。该菌液除用0.01%的胰酶F (天野制药(株)制)，在45°C、15小时条件下对15%脱脂牛奶水溶液处理后使用之外，用上述同样成分的脱脂牛奶培养基(以下称“胰酶处理脱 脂牛奶培养基”)稀释100倍，作为胶囊内容液。表1 1交囊整体的构成比 接着，按表1所示配方，用三重管嘴无缝软胶囊制作机，采用液内滴入法，制成含 有该内容液的三层构造胶囊(平均粒径1.8mm)。外皮膜为琼脂，胶囊滴的形成和固化在固 化液中进行。将该胶囊IOOg放入胰酶处理脱脂牛奶培养基IL中，以每分钟IOOml/分的流量， 灌注氮85%、氢10%、二氧化碳5%的混合气体(住友精化(株)制造)，用搅拌翼以50rpm 的转速缓慢搅拌，PH值调整到5. 5，在37°C下培养30小时。培养后的胶囊内的活体菌数为 3X1010个/g胶囊(湿重)。将该胶囊表面用无菌蒸馏水洗净后，添加2g至IOOml透明的麝香白葡萄酒饮料 中，调制成每IOOml麝香白葡萄酒饮料中含有内含活体双歧杆菌数多达600亿个的胶囊的 麝香果汁饮料。由于这种内含活体双歧杆菌胶囊的麝香果汁饮料没有双歧杆菌特有的怪 味，故风味不减，并保持透明，饮来可口。含有胶囊的果汁饮料的活体双歧杆菌数量很多，可 望有良好的调整胃肠功能的作用。实施例2 含活体乳酸菌胶囊的蔬菜汁取由CMG琼脂培养基(酵母提取物0. 5 %、聚蛋白胨0. 5 %、NaClO. 5 %、葡萄糖 1%、琼脂2% )培养的乳酸乳球菌JCM7638菌落1钼圈，植入脱脂牛奶12%、酵母提取物 0. 4%、葡萄糖3%、pH6. 5的液体脱脂牛奶培养基20ml，在37°C的温度下，进行15小时静置 培养。培养15小时后的菌数为2X109个/ml。用同样的脱脂牛奶培养基将该菌液稀释500 倍，作为胶囊内容液。接着，与实施例1同样，调制内含该内容液的三层结构胶囊(平均粒径1.8mm)。将制得的胶囊100g、12 %的脱脂牛奶水溶液，用0. 01 %的蛋白酶P (天野制药 (株)制造)在40°C下处理15小时后，放入与上述同样成分的脱脂牛奶培养基(以下称 “蛋白酶P处理乳酸菌用脱脂牛奶培养基”)500ml，用5M-Na0H水溶液将pH值调至5. 2，在 37°C下，以50rpm的转速振荡培养2天。培养后胶囊内的活体细菌数为6X IOki个/g胶囊 (湿重量)，胶囊内乳酸菌明显增殖。将如此培养而获得的胶囊用无菌蒸馏水洗净后，以lg/100ml的比例加至蔬菜汁。 该蔬菜汁尽管含有大量的活体乳酸菌，却没有菌的怪味，胶囊的吞咽感好，饮起来可口。因 此，通过饮用以前从未想到过的蔬菜汁，可摄取很多乳酸菌。
实施例3 含高丽参培养细胞胶囊的健康饮料将在含蔗糖3 %和吲哚-3-醋酸(IAA) lmg/1的Murashige-Skoog液体培养基 (pH5. 6)中接代培养的高丽参(Panax ginseng C. A. Meyer)细胞5g (湿重量)，放入500ml 三角烧杯中，同样添加培养基IOOml，在25°C、120rpm的条件下振荡培养2周，得到游离细胞 群。然后用80 μ m网眼的尼龙网过滤该游离细胞群，将穿滤的细小细胞群用20 μ m网眼的 尼龙网再次过滤，收集残留在网上的细胞群。将该细胞块5g(湿重量)置于与上述成分相 同的Murashige-Skoog液体培养基IOOml中，形成悬浊液，作为胶囊内容液。制作无缝软胶囊时，除将作为内容液的细胞悬浊液用振荡器进行振荡以外，其它 与实施例1同样地进行。取所得的内含高丽参细胞的胶囊10g，放入500ml三角烧杯，添加 同样成分的Murashige-Skoog液体培养基100ml，在25°C、50rpm条件下培养3周。高丽参 细胞会在胶囊内繁殖，充满胶囊。将该培养得的胶囊2g用无菌蒸馏水洗净后，添加至含有 0.05g果胶的健康饮料(与森下仁丹(株)制造的商品名“7 — 〃一力源”成分相同，未添 加高丽参提取物)50ml中，使胶囊浮游，调制成含有活体高丽参细胞的健康饮料。该健康饮 料尽管含有活体高丽参细胞，但没有苦味和怪味，吞咽感觉好，饮起来可口。实施例4 含纳豆菌胶囊的豆乳饮料 在粉碎的大豆粉IOOg中，加入蔗糖5g、NaCl Ig和水500ml，在121 °C的温度下进 行30分钟的高压杀菌，离心分离得到上清液(以下称大豆粉提取培养基)。将该大豆粉提取 培养基IOml置入50ml三角烧杯，接种纳豆菌(枯草杆菌IF013169)菌落1钼圈，在30°C、 120rpm的条件下进行15小时的振荡培养。将该培养液全部加至大豆粉提取培养基90ml 中，均勻悬浊后，作为胶囊内容液。与实施例1同样制成胶囊，将制得的胶囊IOOg加至大豆粉提取培养基400ml中， 在30°C、IOOrpm的条件下培养24小时。培养后的胶囊内纳豆菌会进行繁殖，形成粘性物质。 形成细菌数为3 X IO9个/g胶囊(湿重量)。将该胶囊3g用蒸馏水洗净后加至豆乳100ml 中。这就是纳豆菌臭味小、饮来可口、能够与豆乳一起摄取纳豆菌和粘性物质的美味饮料。实施例5 胶囊化双歧杆菌的培养方法将与实施例1同样地调制成的长双歧杆菌JCM7050的胶囊填充到带保温层的 IOOrnl圆筒形柱中。在外部培养槽中加入IL的胰酶处理脱脂牛奶培养基，使培养基从胶囊 填充柱的下方以IOml/分的速度向上方流动，回流至培养基槽，形成循环。用pH自动调节 机，利用10M的氨水，保持培养基槽的pH值在5. 5。为保持缺氧状态，灌注氮85%、氢10%、 二氧化碳5%的混合气体(住友精化(株)制造)。混合气体的灌注速度最初的12小时为 IOOrnl/分，从第12小时到第30小时为20ml/分。在37°C下培养30小时后，柱内胶囊的活 菌数量达到5 X 1010个/g胶囊的极大量。用柱进行培养的方法，不会给胶囊带来物理性损伤，从而可在胶囊内以高密度培 养双歧杆菌，还可减少杂质菌污染的机会。而且，收集胶囊时，胶囊不会受损，柱体可一个个 地运送到食品配料地点。所以，培养时以及培养后的处理变得非常容易，使胶囊内双歧杆菌 的培养适用于工业生产。实施例6 冷冻干燥菌体的胶囊制作和培养与实施例1同样，取长双歧杆菌JCM7050，用脱脂牛奶培养基在缺氧下培养，将得 到的菌体在4°C、8000rpm的条件下进行20分钟离心分离，然后收集，加入10倍菌体量的蒸馏水，搅拌使其分散，再冷冻干燥。将该冷冻干燥菌体放入厌氧盒，在缺氧状态的密闭容器 中冷藏保存，这种保存极为稳定。取该冷冻干燥菌体lg加至脱脂牛奶培养基1L内，形成悬 浊液，作为胶囊内容液。该悬浊液的活体菌数为5X107个/ml。然后，按下表2所示配方，用空中滴入法调制成内含该溶液的无缝软胶囊(平均粒 径 3. 5mm)。表2 1交囊整体的构成比将得到的胶囊100g置于胰酶处理脱脂牛奶培养基1L中，使用厌氧盒而置于缺氧 状态的容器中，用5M的NaOH水溶液将pH值调整到5. 5，同时在37°C条件下振荡培养2天， 培养后的胶囊内活体菌数为2X101(I个/g胶囊(湿重量)。可确认胶囊内有菌体繁殖。实施例7 含活体双歧杆菌的乳酸菌饮料将乳酸乳球菌JCM7638用CMG琼脂培养基(酵母提取物0. 5%、多种蛋白胨0. 5%, NaCl 0. 5%、葡萄糖1%、琼脂2% )培养，获得菌落。从该菌落取1钼圈植入脱脂奶12%、 酵母提取物0. 4%、乳糖3%，将pH值调整到6. 5的液体脱脂奶培养基20ml中，在37°C下， 静置培养15小时，细菌数达6 X 109个/ml。将该培养液全部在4°C、8000Xg条件下离心分离20分钟，舍去上清液，在菌体中 加入生理盐水40ml，用涡流搅拌，再次以8000 X g离心分离20分钟，收集菌体。再重复进行 同样的操作，获得洗净菌体。将透明苹果汁40ml加入该洗净菌体，用涡轮均勻分散。将悬 浊有得到的菌体的苹果汁0. 5ml加至透明苹果汁100ml。该乳酸菌悬浊苹果汁中的活菌数 为IX 107个/ml，几乎呈透明。另一方面，与实施例1同样地制成胶囊，调制装有经培养的双歧杆菌的胶囊2g，将 其添加至由上述方法得到的乳酸菌悬浊苹果汁100ml。装有该活体双歧杆菌的胶囊内活菌 数为300亿个/g胶囊。含有内含该活体双歧杆菌的胶囊的活体乳酸菌苹果汁，为符合“乳制 品等的部标”规格标准的乳酸饮料，与以往的乳酸菌饮料全然不同，几乎呈透明，而每100ml 可摄取活体双歧杆菌600亿个，口感颇好。实施例8 胡萝卜不定胚制成胶囊的人工种子胡萝卜的培养细胞和不定胚的制作，是用胡萝卜根按照〈植物细胞培养>(1979 年，原田，驹岭编，理工学社)P91 104所记载的方法进行。将由液体培养基制成的不定胚， 分别用网眼500 ii m和850 ii m的尼龙网筛选，获得500 y m 850 u m大小的不定胚，不定胚呈心形至鱼雷形的各种形状。将这些不定胚悬浊在不含激素、壳聚糖含量0. 2%的MS培养 基中，作为胶囊内容物。制胶囊时，以熔点32°C的甘油酸酯固化油(药用B-115，日本油脂(株)制)为内 皮膜，22%明胶溶液为外皮膜，用三重管嘴无缝软胶囊制作机，以液内滴入法制作。调节灌 注泵，使内容液不定胚一个个地进入。胶囊滴的形成和固化在凝固油中进行，形成三层结 构。从所得的活体胶囊脱去凝固油后，用圆筒烘干法干燥，得到干燥的不定胚人工种子胶 囊。干燥后的粒径为7mm。 另一方面，作为比较例，制成藻脘酸凝胶颗粒包埋胡萝卜不定胚(比较例1)。即 将按照实施例8制作并筛选的不定胚悬浊于含有3% (w/v)藻脘酸钠的MS培养基中，滴入 50mM氯化钙溶液中，调制成包埋有不定胚的藻脘酸钙凝胶颗粒(粒径约5mm)。这与以往所 报道的人工种子一样。保存及发芽试验将由上述不定胚制成胶囊的人工种子(实施例8)和由藻酸钙凝胶颗粒包埋的不 定胚明胶颗粒(比较例1)置于20°C、湿度65%的恒温器中保存3个月。保存的第3天，藻 脘酸钙凝胶颗粒已相当干燥，颗粒变小，一周过后，不定胚已经变干，呈干枯状态。而制成胶 囊的人工种子的外观一周过后也没有什么变化。在人工种子调制后的1个月、2个月、以及3个月，分别将其播种到花盆中，盆内土 为未经土壤杀菌处理的苗圃土，播种深度为离土表面2cm，数量为各100粒，播后浇水。播 种后，放进25°C的孵化器，在3000LUX下进行每日16小时的照明，2日浇一次水，使其发育。 分别于3周后计算发芽数，结果如表3所示。表3胡萝卜人工种子的发芽实验结果 数字分别表示为播种100粒后的发芽数。如表3所示，由刚制成的发芽率看，实施例8与比较例1几乎相同。但是，保存1 个月以上后，传统类型的人工种子比较例1完全没有发芽。反之，本发明的制成胶囊的人工 种子，保存3个月后仍可确认有高达68%的发芽率。结果表明，本发明的制成胶囊的不定胚人工种子的保存稳定性远远优于以往的藻 脘酸凝胶颗粒包埋不定胚型的人工种子。实施例9 草莓叶芽制成胶囊的人工种子将由栽培的草莓摘下的茎顶组织植入含有蔗糖10g/l和凝胶化剂西兰树胶2g/l 的MS培养基中，在暗处，以25°C培养14天后，移入含有苄基腺嘌呤0. 2mg/l和蔗糖10g/l 的MS培养基中，在25°C下，每天用2000LUX照射16小时，同时以150rpm进行旋转振荡培 养。将培养30天后得到的叶芽，用网眼为Imm和1. 7mm的尼龙网筛选，得到1 1.7mm大 小的叶芽。将得到的叶芽悬浊于不含激素的MS液体培养基，作为胶囊的内容物。
除调节叶芽悬浊液输送泵的流量之外，其它与实施例8同样地制成胶囊。将所得 胶囊干燥处理，获得草莓叶芽人工种子胶囊。干燥后的粒径为8mm。另外，作为比较，制作藻脘酸凝胶颗粒包埋草莓叶芽(比较例2)。使用由实施例 9制作、筛选的草莓叶芽，采用同于比较例1的方法调制成包埋草莓叶芽的藻脘酸钙凝胶颗 粒(粒径约5mm)。这与以往所报道的人工种子一样。所得的草莓叶芽人工种子(实施例9)和藻脘酸凝胶颗粒包埋草莓叶芽(比较例 2)的保存和发芽试验用同于实施例8的方法进行。结果如表4所示。表 4草莓人工种子的发芽实验结果 数字分别表示为播种100粒后的发芽数。如表4所示，由刚制成的发芽率看，实施例9与比较例2几乎相同。但保存1个月 以后，可以确认，传统类型的人工种子比较例2完全没有发芽，反之，本发明的制成胶囊的 人工种子发芽率很高，即使3个月后仍保持有60%的发芽率。结果表明，本发明的制成胶囊的人工种子的保存稳定性远远优于以往的藻脘酸凝 胶颗粒包埋型人工种子。实施例10 蝴蝶兰原始球茎样组织制成胶囊的人工种子由白花黄唇(lips)蝴蝶兰的花茎叶芽形成的原始球茎样组织用网眼为1. 5mm和 3mm的尼龙网筛选，得到1. 5 3mm大小的原始球茎样组织。将得到的原始球茎样组织悬浊 于含有肥料花宝(hyponex) (N/P/K = 6. 5 6 19) 6g/l、蔗糖 15g/l、壳聚糖 0. 2% 的 pH 为5.6的培养基，作为三重胶囊的内容物。调节原始球茎样组织悬浊液输送泵，使一个原始球茎被包入一个胶囊中，除此之 外与实施例8 —样地封入胶囊。将制得胶囊干燥，得到干燥的蝴蝶兰原始球茎样组织人工 种子胶囊。干燥后的粒径为9mm。将该人工种子置于15°C的暗处保存2个月，然后将100粒种入盆内，盆内土为未 经土壤杀菌处理过的苗圃土，深度为离土表2cm，播后浇水。播种后放入25°C孵化器，用 3000Lux每天照明16小时，同时2天浇水1次，使其发育。2个月后计算发芽数，100粒中有 63粒发芽。实施例11 16制作表5所示植物不定胚、顶芽、或不定根，与实施例8同样制成胶囊，干燥后，在 20°C、湿度65%的恒温器内保存3个月，然后与实施例8同样，将100粒种入盆内，在1 3 个月间，与实施例8同样使其发育，观察发芽情况。结果如表5所示。各种植物的人工种子发芽实验结果 发芽数分别为播种100粒后的数字。表5的结果也表明，本发明的人工种子胶囊有良好的保存稳定性。产业上应用的可能性本发明的胶囊不溶于胃酸，活体细胞或组织可在胶囊内部繁殖，特别是使用乳酸 菌(包括双歧杆菌)时，可将大量的活菌送达肠内，可迅速出现较强的调整胃肠功能的作 用。而且本发明的包含可再分化的植物细胞组织的人工种子胶囊，在常温干燥状态下的保 存稳定性强，而且播种至土壤后，胶囊皮膜膨润，再加上微生物作用而崩解，因此可迅速发 芽。与植物细胞培养技术、克隆技术、病毒分离技术相结合，可广泛用于农业、林业、园艺业、 花卉业等。
权利要求
一种人工种子，由具有最内层、覆盖所述最内层的内皮层、覆盖所述内皮层的外层的三层或三层以上的结构的无缝软胶囊构成，其特征在于，所述最内层中含有可再分化的植物细胞组织，所述内皮层由以固化油为主要成分的内皮膜构成，而且，所述外层为具有生物降解性的外皮膜。
2.如权利要求1所述的人工种子，其特征在于，所述外皮膜经过干燥处理。
3.如权利要求1或2所述的人工种子，其特征在于，所述可再分化的植物细胞组织选自 不定胚、不定芽、多芽体、茎顶、生长点、原始球茎样组织、不定根、和毛状根。
4.如权利要求1 3任一项所述的人工种子，其特征在于，所述内皮膜为常温下为固体 的具有微生物降解性的固化油。
5.如权利要求1 4任一项所述的人工种子，其特征在于，所述外皮膜选自蛋白质、多 糖类、以及生物降解性塑料，并具有微生物降解性。
全文摘要
本发明涉及一种人工种子，由具有最内层、覆盖所述最内层的内皮层、覆盖所述内皮层的外层的三层或三层以上的结构的无缝软胶囊构成，其中，所述最内层中含有可再分化的植物细胞组织，所述内皮层由以固化油为主要成分的内皮膜构成，而且，所述外层为具有生物降解性的外皮膜。本发明的人工种子，保存稳定性好，发芽率可以保持在很高水平。
文档编号A01H4/00GK101861832SQ20101015854
公开日2010年10月20日 申请日期2001年6月28日 优先权日2001年6月28日
发明者春原秀基, 波多野由美, 浅田雅宣, 釜口良诚 申请人:森下仁丹株式会社