专利名称：一种食线虫真菌及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于微生物农药技术领域，具体涉及一种食线虫真菌及其制备法与应用。
背景技术：
植物寄生线虫是一类重要的病原微生物，分布广、种类多，全世界已报道的植物线 虫有200多属5000余种，给农林业生产造成严重为害(冯志新，2001)。据估计全球每年由 植物寄生线虫所造成的作物损失达780亿美元(Barker et al，1998)。就现今危害最为严 重的线虫种类——根结线虫来讲，其有着广泛的寄主，且为世界性分布，可给全球作物总产 量造成10%以上的损失(Whitehead，1998)。植物线虫具有隐蔽性，多寄主性，顽固性，易传播的特点，其种群增长迅速，给防治 上带来了诸多的困难。自从20世纪40年代化学技术的革命后，化学杀虫剂被广泛用于农 林业生产，并在害虫防治中占居重要地位。但由于人们长期过分依赖化学农药，且缺乏生态 意识，造成了严重的环境污染。单杀线虫剂而言，以往使用的多为高毒力化学农药，这些药 物对人畜不安全，对环境污染严重，并易使线虫产生抗药性，对有益生物杀伤力强。同时，随 着人们环保意识的增强，对健康食品要求的日益增高，以往用于植物线虫防治的高毒农药 多以法律的形式给予禁用。因此，可以满足以上诸多难题的生物防治方法在植物线虫病害 的防治地位尤显重要。鉴于此，人们将目光转向了生物防治。食线虫菌物是一类线虫天敌，目前市场上成功上市的线虫生防制剂均来源这类菌 物。其中，隔指孢菌是重要的类群。研究开发隔指孢菌具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是弥补现有技术的不足，提供一株新的具有杀线虫功能的食线虫真 菌一海南隔指孢真菌。本发明的另一个目的是提供所述海南隔指孢真菌的制备方法。本发明还有一个目的是提供所述海南隔指孢真菌的应用。本发明的目的通过下述技术方案予以实现提供一株食线虫真菌，本申请人从感染根结线虫的空心菜根际土样中分离得 到的一株对线虫具有很好毒杀作用的隔指孢属新种，命名为海南隔指孢(Dactylella hainanensis lg21_l)。菌株于2010年2月4日保存于中国湖北武昌珞珈山中国典型培养 物保藏中心，保藏号为CCTCC NO :M2010042o所述海南隔指孢(Dactylella hainanensis lg21_l)，(D. hainanensislg21_l)， 菌株形态特征为在PDA上生长菌丝稠密乳白色，气生菌丝较多；当菌落生长数天后，中央 的气生菌丝消失，并有大量的串生厚垣孢子生成。当在CMA培养基上生长，菌落近无色， 生长较缓慢，25°C暗培养lld，菌落可达6. 8cm ；周边菌丝透明， 有隔，通常宽度在2. 5 4. 5 μ m。分生孢子棒状，远轴端钝圆，长17. 7 40. 5(27. 7) μ m，宽4. 8 10. 1(7. 0) μ m，分 生孢子多数为孢子梗顶部单端生，少顶部多生，最多不超过4个，分生孢子梗无色，直立，有分隔，长146. 7 260. 6 μ m，基部宽2. 0 4. 0 μ m，端部约2. 0 μ m，端部少数顶部分枝。分 生孢子有0 4个隔，大多数1 3个分隔。老熟菌丝易生厚垣孢子，厚垣孢子近圆形，直径 大小一般在7. 5 12. 5 (11. 3) μ m。菌株的捕食器官为黏性球，黏性球的柄长5 27. 5 μ m， 柄宽2. 3 3. 2 μ m，球部长5. 0 10. 0 μ m，宽4. 5 9. 0 μ m。多数黏性球的柄垂直伸出菌
丝生长。菌株lg21-l的分生孢子中无中间特大细胞，分生孢子梗直立，无色，通常单生，分 生孢子单生于孢子顶端，少多生，符合隔指孢属特征，因此根据菌株采集地命名为海南隔指 包(Dactylella hainanensis lg21_l)。与海南隔指孢在形态上相似的种有弱捕隔指孢(D. asthenopaga)、D. querci和回 笋隔指孢(D. huisuniana)。和弱捕隔指孢相比，海南隔指孢在较老的菌丝上易生成串生的厚垣孢子，弱捕 隔指孢未观察到厚垣孢子；海南隔指孢分生孢子稍小(海南隔指孢分生孢子长17. 7 40. 5 μ m，宽4. 8 10. 1 μ m ；弱捕隔指孢分生孢子长20 46 μ m，宽6. 5 9. 2 μ m)；分 生孢子梗稍长(海南隔指孢分生孢子梗长146. 7 260. 6 μ m ；弱捕隔指孢分生孢子梗长 100 200 μ m)；粘球柄稍长(海南隔指孢粘球柄长5 27. 5 μ m，弱捕隔指孢粘球柄长3 10 μ m)；分生孢子分隔数不同(海南隔指孢0 4个，弱捕隔指孢1 5个)。与D. querci相比，海南隔指孢在较老的菌丝上易生成串生的厚垣孢子，D. querci 无厚垣孢子；海南隔指孢粘球柄稍长(海南隔指孢粘球柄长5 27. 5 μ m，弱捕隔指孢粘 球柄长0 5.5 μ m)；分生孢子梗较长，(海南隔指孢分生孢子梗长146.7 260. 6μπι; D. querci分生孢子梗长130 180 μ m)；与回笋隔指孢相比，两者分生孢子形态与大小均有所不同(海南隔指孢分生孢子 较为短粗，多为棍棒状，大小为25 52. 5 X 4 6 μ m ；回笋隔指孢分生孢子狭长，多呈纺锤 形，大小为17. 7 40. 5X4. 8 10. Iym)；回笋隔指孢产孢细胞合轴多育，呈烛台状，而海 南隔指孢无。进一步对海南隔指孢进行分子鉴定，扩增靶标序列为ITS区，ITS序列如表SEQ ID N0:1所示。所述基因的获得包括以下步骤(1)基因组DNA的提取(a)用解剖刀刮取PDA平板上25°C培养IOd的菌丝在液氮中研磨成粉状；将菌丝 粉迅速放入1. 5mL的液氮预冷离心管中，每管0. 3g ；(b)用 500yL DNA 抽提缓冲液悬浮(IOOmM Tris-HCl, 750mM NaCl, 40Mm EDTA)， 并加入50 μ L 20% SDS轻轻混合，37°C处理Ihr ；(c)加入 75 μ L 的 5Μ NaCl 禾口 65 μ L CTAB 溶液(0. 75Μ NaCl 含 10% CTAB)，65°C 水浴20min ；(d)加入等体积的酚-氯仿-异戊醇(25 24 1)抽提，5000g离心lOmin，取上 清；(e)重复步骤d ；(f)力卩 2 μ L RNase (10mg/mL) 37°C处理 30min ；(g)加入等体积的异丙醇混勻，5000g，离心IOmin沉淀DNA ；(h)用0. 5mL 70%的酒精洗剂沉淀，离心2min，到掉酒精，风干；
(i)力口 30 μ L TEdOmM Tris-HCl, IMm EDTA, ρΗ8· 0)重新悬浮 DNA ；(j)每个样取2 μ L，Marker2000取5 μ L，用1 %的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的纯度。(2) ITS 区的 PCR 扩增以菌株的基因组DNA为模板，用真菌通用引物ITSl和ITS4扩增ITS区的片段。ITSl 5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3‘；ITS4 5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3‘；反应体系模板lyL;10x缓冲液 2. 5yL;4x dNTP 0. 5yL;引物 ITSl IyL;引物 ITS4 1 μ L ；酶0. 25 μ L ；水18. 75 μ L。以不加模板为阴性对照。反应程序94"C 5min ；94 "C 30sec — 55 "C 30sec — 72 "C lmin, 35 个循环； 720C 2min ；4°C ⑴。PCR产物切胶回收，连接到PMD-18T载体，最后转化克隆送交上海英骏生物技术有 限公司测序。(3)序列分析序列分析的结果通过国际互联网进行序列同源性检索，检索主程序采用BLASTN， 即核酸序列对核酸序列数据库的检索，序列分析采用DNA Star软件进行。比对结果发现海南隔指孢与3个近似种，即弱捕隔指孢、D. querci和回笋隔指孢 的相似性分别为77. 9%、82%和84. 7%，进一步证明该新种与这3个近似种为不同种。本发明同时提供了所述海南隔指孢(Dactylella hainanensislg21-l)菌的制备 方法，包括试管种培养、液体培养基培养或固体培养基培养方法。所述试管种培养基配方为马铃薯琼脂培养基(PDA) :200g马铃薯，20g葡萄糖，20g 琼脂粉，IOOOml水；方法为将Dactylella hainanensislg21_l菌丝体接种到PDA培养基斜 面上，20 30°C下培养6 12天，得到试管种。所述液体培养基可采用LMZ培养液，配方为每1升磷酸缓冲液中含2g明胶、8g胰 蛋白胨、Ig 酵母浸出粉、0. 5g(NH4)2SO4^O. OlgFeSO4 · 7Η20、0· 5gMgS04 · 7H20，所述磷酸缓冲 液组成为 11. 28gNa2HP04 · 12Η20/10· 687g NaH2PO4 · 2H20, pH 6· 5。或者采用LMZ+B. χ培养液，配方为加入松材线虫的LMZ培养液。液体培养方法是每个250mL三角瓶装50mL培养液，湿热灭菌后，冷却。接活化的 海南隔指孢菌圆片，每瓶5片。在180转/min 28士2°C情况下，暗培养8d，中性中速滤纸无 菌过滤，滤液保存于4°C冰箱中待用。所述固体培养基CMA配方为20g玉米粉，15g琼脂粉，IOOOml水。培养方法是每个 90mm的培养皿中倒入约1/3厚的培养基，接种D. hainanensis后，用封口膜封口后于25°C 下培养6 12天。本发明对海南隔指孢(D. hainanensis lg21_l)菌进行了杀线虫药效试验，确定其 对线虫的作用，可应用于制备植物寄生线虫生防制剂。海南隔指孢(Dactylella hainanensis lg21_l)菌应用于制备植物寄生线虫生防 制剂方面时，优选利用其幼嫩孢子，优选的剂量范围是8 X IO5 1. 6 X IO6个孢子/kg 土壤。本发明的有益效果是本发明提供了一株新的海南隔指孢(Dactylella hainanenSiSlg21-l)菌，具有良好的杀线虫活性，可应用于制备杀线虫活性制剂。本发明提供了海南隔指孢(Dactylella hainanensis lg21_l)菌的多种培养方法及应用，为生物防治生物防治线虫提供重要的技术基础。
图1海南隔指孢液体培养液对松材线虫的击倒作用情况图2海南隔指孢孢子萌发黏附于根结线虫卵的情况图3海南隔指孢施菌量对南方根结线虫的效果的情况(根结级数)图4海南隔指孢施菌量对南方根结线虫的效果的情况(防治效果)图5不同处理组对南方根结线虫在作物番茄上的防效情况图6海南隔指孢不同施菌量对番茄伸长生长的影响的情况图7海南隔指孢不同施菌量对番茄生物量的影响
具体实施例方式下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。实施例1海南隔指孢(Dactylella hainanensis lg21_l)菌试管种培养培养基配方为马铃薯琼脂培养基(PDA) :200g马铃薯，20g葡萄糖，20g琼脂粉， IOOOml /K。将Dactylella hainanensis lg21_l 菌丝体接种到 PDA 培养基斜面上，20 30°C 下培养6 12天，得到试管种。实施例21g21_l菌的固体培养将海南隔指孢(Dactylella hainanensis lg21_l)菌保存菌接种到CMA培养基 (组成20g玉米粉，15g琼脂粉，IOOOml水)进行活化，然后接种到YMA培养基(组成2g 酵母浸出粉，20g麦芽糖，1000ml水)上(直径75mm培养皿)，25°C下暗培养16d。将菌保 存于4°C冰箱中待用，或直接配备孢子培养液使用。实施例31g21_l菌的固体培养将海南隔指孢(Dactylella hainanensis lg21_l)菌保存菌接种到CMA(组成 20g玉米粉，15g琼脂粉，IOOOml水)培养基进行活化，然后接种到以下配方的培养基lg KH2PO4，0.5g MgSO4,0. 5g NaCl，0. 05gZnS04，0. 05g FeSO4,15g 琼脂粉，20g 葡萄糖，加入 1000ml超纯水，调pH值至6. 5 7. 0。其他同实施例2。实施例41g21_l菌的固体培养将海南隔指孢(Dactylella hainanensis lg21_l)菌保存菌接种到CMA(20g玉 米粉，15g琼脂粉，IOOOml水)培养基进行活化，然后接种到以下配方的培养基lg KH2PO4, 0. 5g MgSO4,0. 5g NaCl，0.05g ZnSO4,0. 05g FeSO4,15g琼脂粉，4g酵母浸出粉，加入 1000ml 超纯水，调pH值至6. 5 7. 0。其他同实施例2。实施例51g21_l菌的液体培养选用LMZ液(Zhao et al，2004)或LMZ+B. χ作为培养液，每个250mL三角瓶装50mL 培养液，湿热灭菌后，冷却。接活化的海南隔指孢菌圆片，每瓶5片。在180转/min 28 士 2°C 情况下，暗培养8d，中性中速滤纸无菌过滤，滤液保存于4°C冰箱中待用。
LMZ液配方为每一升磷酸缓冲液中含2g明胶，8g胰蛋白胨，lg酵母 浸出粉，0. 5g(NH4)2S04，0. Olg FeS04 7H20，0. 5g MgS04 7H20，磷酸缓冲液为 11. 28gNa2HP04 12H20/10. 687g NaH2P04 2H20, pH 6. 5 ；LMZ+B. x 培养液配方为加入约 1000 条松材线虫的LMZ培养液。所述松材线虫来源于农业部批准设立的线虫学和杀线活性物研 究机构一华南农业大学植物线虫研究室，也可以采用本领域实验室常规实验使用的松材线 虫。实施例61g21_l菌的液体培养选用LMZ+B.x作为培养液，每个250mL三角瓶装50mL培养液，湿热灭菌后，冷却。 接活化的海南隔指孢菌圆片，每瓶5片。在180转/min28士2°C情况下，暗培养8d，中性中 速滤纸无菌过滤，滤液保存于4°C冰箱中待用。LMZ+B. x液配方为加入约1000条松材线虫的LMZ培养液。实施例7海南隔指孢(D.hainanensis Y. Z. Li et J. L. Liao, sp. nov.) lg21_l 杀线虫活性 试验1、制备试验用线虫(1)将全齿复活线虫(Pnanagrellus redivivus)(来自中国科学院微生物研究 所，也可以采用本领域实验室使用的同类线虫)接种于燕麦片培养基(组成10g燕麦片， 30ml水)上，25°C下培养6天左右，置于4°C冰箱备用。使用前将所需线虫用贝曼漏斗法洗 出，置于5ml离心管内加入无菌水，瞬时离心，弃上清，重复3次得到洁净供试线虫。(2)制备丰公材线虫(Bursaphelenchus xylophilus)在倒入1/3厚PDA培养基的培养皿中接入拟盘多毛孢(Pestalotiopsis sp.)(华 南农业大学植物线虫研究室保存)，25°C培养4 7天。待菌丝铺满培养皿后，接种松材线 虫，25°C培养5 8天。用无菌水将线虫冲洗，制成含量为2条/ yl的线虫悬浮液。(3)制备根结线虫取爪哇根结线虫(采自云南昆明，单卵块纯化后保存于华南农业大学植物线虫研 究室)的单卵块接种至预先在消毒土壤中培育2周的感病番茄或马铃薯植株上，约45d后， 将根拔起用自来水洗净，于解剖镜下挑取根上卵块，将其放在双层网筛(铁丝网和滤纸) 上，网筛浸于加有灭菌水的灭菌培养皿内，25°C孵化3天收集已孵化的二龄虫。2、试验方法(1)对 P. redivivus 生测试验参照实施例2、3或4，将在PDA斜面上保存的菌株在CMA平板上活化7d后，用直径 9mm的打孔器打取菌圆片接种到直径75mm的CMA平板上，25°C暗培养7天，每皿加入无菌 水配制的P. redivivus虫液250 y L (约500条)，用玻璃三角棒推平，25°C暗培养30hr，在 10x立式解剖镜下随机选取10个区域(所选区域随机均勻分布，总面积占培养皿总面积的 1/5)，记录已捕食和未捕食的线虫数。计算线虫捕捉率和平均值，数据处理同上。捕捉率公 式如下
<formula>formula see original document page 7</formula>
虫液密度的确定取收集的活跃线虫P.redivivus，于玻璃广口瓶中，吸取10ul显 微镜下观察，计数三次。计算虫的实际数量密度后，测量实际总体积数，再用灭菌水进行稀 释至2000条/mL。将计数稀释后的各皿封起，放回25°C暗培养，至加虫起计算达3天时，取出在 10XlOx显微镜下观察计数捕食器的数量。每皿随机选取10个视野，记录总和。三个重复 求平均。(2)液体培养滤液对松材线虫的作用效果选用LMZ液(Zhao et al，2004)或LMZ+B. x作为培养液，每个250mL三角瓶装50mL 培养液，湿热灭菌后，冷却(参照实施例5或6)。接活化的海南隔指孢菌圆片(同前述生测 试验)，每瓶5片。在180转/!^11、28士21条件下，暗培养8d，中性中速滤纸无菌过滤，取滤 液处理松材线虫，选用24孔细胞培养板，每孔加滤液450 u L，加松材线虫液50 y L (约100 条)，每个处理三个重复。25°C、无光条件下处理18hr，在4X10x显微镜下记录静止和活动 的线虫数。清水稀释测试线虫混合液恢复2hr并用针刺线虫，检验线虫的死活。<formula>formula see original document page 8</formula>(3)孢子对根结线虫卵作用的观察用灭菌水将预先用PDA平板培养的海南隔指孢的孢子洗下，浓度约4000个孢子/ mL,向24孔板中每孔加450 u L，加爪哇根结线虫卵50 u L，约100粒。25°C暗培养48h观察， 并将卵吸入载玻片上，盖片拍照。(4)对南方根结线虫的盆栽试验将活化的菌株接种到YMA培养基(组成2g酵母浸出粉，20g麦芽糖，1000ml水) 上(直径75mm培养皿)，25°C、暗培养16d，用于土壤处理菌种，处理土壤前，先计数每皿的 孢子数。孢子的计数方法为每个菌株取三皿，各加入含有0. 吐温80无菌水8mL，用玻 璃棒轻轻推动，使孢子脱离菌丝。将孢子悬浮液悬浮均勻，取2 y L用血球计数板在lOXlOx 显微镜下计数，每个皿计数3次。三个皿计数的平均值乘以4000既为每个皿的实际孢子量。番茄苗的培养播种前，先将番茄种子用50 55°C水浴30min，以钝化种子携带的 病毒，静置浸泡8hr ；浸种后将种子略晾一下，用湿布包好，室温下催芽。催芽期间每天用清 水淘洗1次，防止发霉。种子发芽后，先将育苗土浇足水，将土层上表面整平，将发芽的种子 均勻散布于上，播后覆土 1 1. 5cm。育苗土为基质土(组成菜园土 有机肥碧糠灰= 5 2 3)经 121°C 灭菌 2hr。土壤的处理病土取自广州市良田镇大田土壤，6个处理，混合均勻装盆。以灭菌 土、病土和阿维菌素(0. 05g阿维菌素/kg 土壤)分别为阴性、阳性和药剂对照，4X105个孢 子/kg 土壤，8 X 105个孢子/kg 土壤和1. 6 X 106个孢子/kg 土壤三个浓度处理。菌株对番茄根结线虫的防治效果将接种线虫6周的番茄扣盆将根部土轻轻去除，用自来水洗净，观察根上根结发 生情况，并依照以下记载标准记录线虫侵染级别。根结线虫危害的记载标准(参照方中达《植病研究方法》)
100%
感染级别症状描述
0无根结
1有少数根结
2大部分根上有根结
3有大量根结，少数根结联合膨大
4有大量根结，许多根结连结在一起膨大 根据下面公式计算根结指数和防治效果.
II
数
匕曰
结 根
防效(％)=
E (各级植株数X级值) (调查总株数X 4)
对照指数一处理指数
X100
x100
对照指数
菌量对番茄伸长生长的影响 将处理的番茄植株，用毫米刻度尺测量株高和根长。 株高从番茄最上生侧根的点到心叶尖的距离； 根长从番茄最上生侧根的点到最长根尖的距离。
对每个处理的株高和根长用应用DPS中Duncan新复极差法进行数据分析。 菌量对番茄生物量的影响
将处理的番茄植株，用电子天平称量地上重和地下重。 地上重从番茄最上生侧根的点，将其切断，上面部分的重量； 地下重从番茄最上生侧根的点，将其切断，下面部分的重量； 4、试验结果
(1)对P. redivivus生测试验
将菌株在CMA25°C暗培养7天，接种P. redivivus 24小时，菌株对其扑捉率达
(2)液体培养液对线虫的作用
用LMZ等培养液培养的海南隔指孢的滤液对线虫的效果显示，LMZ中菌的培养滤 液对线虫的作用效果和培养液的对照没有明显区别，在培养液成分中加有松材线虫的菌的 培养滤液对松材线虫的击倒率明显高于培养液对照和不加线虫的海南隔指孢的培养滤液， 见附图1所示。说明松材线虫对菌株产生击倒线虫的物质有一定的诱导作用。附图1中1 为LMZ空白对照(ck)培养液；2为海南隔指孢菌LMZ培养液培养滤液；3为海南隔指孢菌 LMZ+B. x培养液培养滤液；相同的字母表示在P < 0. 05时，差异不显著，误差线为S. E.；纵 坐标为线虫击倒率(％ )。(3)孢子萌发菌丝对根结线虫卵作用的观察海南隔指孢的孢子对爪哇根结线虫卵作用的观察试验显示；孢子萌发产生的菌丝 可以黏附于卵的体表，用挑针可以将菌丝和卵一起挑出，但显微镜下没有观察到明显侵入 现象。说明该菌对根结线虫卵没有寄生作用，见附图2。(4)对南方根结线虫防效的盆栽试验(a)海南隔指孢的不同施菌量对南方根结线虫的防效试验结果表明，施入土壤的
9菌量明显影响菌株对线虫的防治效果，在试验范围内，施菌量越多防效越好。施菌和药剂的 处理组的番茄的平均根结级数明显下降，在施入不同菌量的处理组中可以明显的看到，它 们的平均根结级数呈梯度下降，见附图3、附图4和附图5。
附图3和附图4中，a根结级数；b防治效果；CK1灭菌土壤；CK2病土 ；A 4X 105个 孢子/kg;B 8X105个孢子/kg ;C 1.6X106个孢子/kg ;G阿维菌素；相同的字母表示在P < 0.01时，差异不显著，误差线为S.D.，n = 15。附图5明显的显示出不同处理组对南方根结线虫在作物番茄上的防效，1.6X106 个孢子/kg 土壤处理组的防效达58. 9%，与肯邦线尊的药剂处理组差别不到10%。附图5中CK1灭菌土壤；CK2病土；A 4X 105个孢子/kg ;B 8X 105个孢子/kg ;C 1.6X106个孢子/kg ；G阿维菌素；相同的字母表示在P < 0. 05时，差异不显著，误差线为 S. D. , n = 15。(b)对番茄伸长生长的影响不同的施菌量对番茄伸长生长的影响试验结果显示，加入不同菌量的各处理组之 间在根长和株高上没有显著差异，与病土对照组相比有显著差异，明显好于病土对照组，但 与灭菌土对照组相比，又明显差与灭菌土对照组；而与药剂处理组相比显示，株高低于药剂 处理组，而根长大于药剂处理组，见附图6。附图6中CK1灭菌土壤；CK2病土；A 4X 105个孢子/kg ;B 8X 105个孢子/kg ;C 1.6X106个孢子/kg ；G阿维菌素；相同的字母表示在P < 0. 05时，差异不显著，误差线为 S. D. , n = 15。(c)各个处理番茄生物量的影响不同的施菌量对番茄生物量的影响试验结果显示，加入菌量不同的各处理组之间 在生物量上显示出一定的差异。在地上重上看，4X 105个孢子/kg 土壤和8X 105个孢子/ kg 土壤处理组之间无显著差异，1.6X106个孢子/kg 土壤处理组和4X 105个孢子/kg 土 壤、8 X 105个孢子/kg 土壤处理组有差异，1. 6 X 106个孢子/kg 土壤处理组地上部重于其他 两组，说明菌株对线虫侵染的抑制一定程度上促进了植物的生长。在地下重上看，8X105个 孢子/kg 土壤和1. 6X 106个孢子/kg 土壤处理组组间无差异，而4X 105个孢子/kg 土壤处 理组与8 X 105个孢子/kg 土壤、1. 6 X 106个孢子/kg 土壤处理组有差异，4 X 105个孢子/kg 土壤组地下重重于其他两组，是因为根结数多且大于其他两组的结果。不同菌量各处理组与病土对照组相比有差异，比病土对照要好；但与灭菌土对照 组相比，又明显差与灭菌土对照组。从地上重来看，1.6X106个孢子/kg 土壤处理组明显重 于病土对照组，而轻于灭菌土对照组。从地下重来看，8 X105个孢子/kg 土壤和1. 6X106个 孢子/kg 土壤处理组与病土对照无区别(这与病土组的根结膨大的重量弥补其被阻止的伸 展重量有一定关系)，但与灭菌土对照组比，显著低于对照。不同菌量的各处理组与药剂处 理组相比，生物量都低于药剂处理组，见附图7。附图7中，相邻的两个方柱，左边的为地上 重，右边的为地下重。附图7中CK1为灭菌土壤；CK2为病土；A 4X 105个孢子/kg ;B8X 105个孢子/kg C 1.6X106个孢子/kg ；G阿维菌素；相同的字母表示在P < 0. 05时，差异不显著，误差线 为 S. D. n = 15。试验结果表明，海南隔指孢对卵没有寄生作用，对线虫的作用主要是通过捕捉运动的线虫而实现的。海南隔指孢对线虫的作用方式显示，不同活性的菌丝对线虫捕捉能力 是不同的，活力强的幼嫩菌丝(加入靶标线虫后生长3d的菌丝)对线虫的捕捉能力强。海 南隔指孢产生的孢子萌发并产生黏性球，可以直接黏着于线虫体上，见附图2，侵入其体内， 以线虫为营养进行生长繁殖，黏着于线虫体壁的孢子不能立刻使线虫致死，可以跟随线虫 的运动而带到新的地方，被动地得到了传播，增加了菌丝侵染新的寄主的机会。因此，使用 海南隔指孢的大量的孢子进行植物线虫防治是一种更为有效的方法。
施入不同的菌量对番茄根结线虫病的防效试验显示，增加菌量可以明显降低南方 根结线虫在寄主作物上的发病指数，且对作物没有明显的负面效果，表明海南隔指孢作为 生防物的可应用和开发潜力巨大。
权利要求
一种食线虫真菌(Dactylella hainanensis lg21-1)，于2010年2月4日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NOM 2010042。
2.一种权利要求1所述食线虫真菌的制备方法，其特征在于是将所述真菌菌丝体接种 到PDA培养基斜面上培养得到；所述PDA培养基为200g马铃薯、20g葡萄糖、20g琼脂粉和 1000ml
3.—种权利要求1所述食线虫真菌的制备方法，其特征在于是将所述真菌圆片接种于 液体培养液培养暗培养后过滤得滤液待用；所述液体培养液为LMZ培养液或LMZ+B. x培养 液；所述LMZ培养液配方为每一升磷酸缓冲液中含2g明胶，8g胰蛋白胨，lg酵 母浸出 ijSO. 5g(NH4)2S04,0. 01gFeS04 7H20,0. 5gMgS04 7H20,磷酸缓冲液为 11. 28gNa2HP04 12H20/10. 687g NaH2P04 2H20，pH 6. 5 ；所述 LMZ+B. x 培养液配方为加入松 材线虫的LMZ培养液。
4.一种权利要求1所述食线虫真菌的制备方法，其特征在于是将所述真菌接种于固体 培养基CMA培养得到，所述固体培养基CMA配方为20g玉米粉，15g琼脂粉，1000ml水。
5.一种权利要求1所述食线虫真菌的应用，其特征在于应用于制备植物寄生线虫生防 制剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于采用所述真菌的幼嫩孢子制备植物寄生线 虫生防制剂。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于所述真菌应用于制备植物寄生线虫生 防制剂的剂量范围是8xl05 1. 6xl06个孢子/kg 土壤。
全文摘要
本发明公开了一种食线虫真菌及其制备方法与应用。所述食线虫真菌为隔指孢属新种的海南隔指孢(Dactylella hainanensis lg21-1)，于2010年2月4日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NOM 2010042。本发明提供了所述食线虫真菌的制备方法，包括试管种培养法、液体培养法或固体培养法。本发明菌株对线虫具有毒力高的突出优点，可应用于制备植物寄生线虫生防制剂，具有较好的应用前景。
文档编号A01P5/00GK101831388SQ20101018118
公开日2010年9月15日 申请日期2010年5月18日 优先权日2010年5月18日
发明者卓侃, 廖金铃, 李玉中, 罗梅 申请人:华南农业大学