专利名称：欧美山杨杂种的组织培养快速繁殖方法
技术领域：
本发明涉及欧美山杨杂种的快速繁殖方法，尤其涉及欧美山杨杂种的组织培养快 速繁殖方法，属于欧美山杨杂种的组织培养领域。
背景技术：
欧美山杨杂种(Populus tremulaXP. tremuloides)是欧洲山杨和北美山杨的杂 交种，具有生长快、耐寒、耐贫瘠、树形高大、适应性强等特点，是温寒带山地造林的优良树 种。同时该杂种材质较软，细密，洁白，树干端直，是造纸、胶合板、刨花板等工业的优质原 料。研究表明在芬兰，欧美山杨杂种适于山地造林，平原造林长势更好，而且其轮伐 期和生长速度都快于一般的山地针阔叶造林树种。而我国北方很多地区的气候环境要好于 芬兰，土壤肥沃，温度高，日照长，生长期也长，直接采用弓丨进优良山杨杂种无性系造林，其 生长量更加显著。因此，该树种适于在我国黑龙江南部、吉林、辽宁以及华北地区种植。目 前作为优良用材树种被许多国家广泛引进。但在欧美山杨杂种组织培养的技术实施过程中，面临着培养基成本高、组培苗易 玻璃化和褐化、商品苗出苗时间长等问题，在欧美山杨组织培养技术操作的各个环节中，以 组培苗易出现玻璃化和褐化的问题最为严重，导致成苗率低，增加成本，这些问题严重限制 了欧美山杨的繁殖系数，并影响了欧美山杨大面积的推广种植。为此，去除欧美山杨组培苗 玻璃化和黄化以及缩短育苗时间的技术革新已经成为当务之急。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服欧美山杨杂种组织培养的过程中，所存在的培 养基成本高、组培苗易玻璃化和褐化、商品苗出苗时间长等问题，提供一种新的欧美山杨杂 种组织培养方法，该方法具有生产成本低、幼苗生长速度快、幼苗健壮，不易玻璃化，成活率 高等优点。本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的一种欧美山杨杂种组织培养的快速繁殖方法，包括以下步骤(1)欧美山杨杂种 的外植体消毒后接种在启动培养基上培养，得到无菌试管苗；(2)将步骤(1)所得到幼苗截 段，插入分化培养基中培养；(3)将步骤(2)所得到幼苗截段，插入生根培养基中进行生根 培养；(4)将生根后的幼苗截段后转接至生根培养基进行继代培养；(5)炼苗、移栽，即得。其中，步骤(1)中所述的欧美山杨杂种的外植体可以是欧美山杨杂种的嫩茎或新 叶；所述的消毒方式可以是在接种前用清水冲洗5min，无菌水冲洗3 4遍，再用75%酒 精浸泡30s，边浸泡边摇动。然后用0. 升汞灭菌2min，再用灭菌的蒸馏水洗4遍；所述 的启动培养基的组成优选为WPM+6-BA 1.0mg/L+2%绵白糖步骤(2)中所述的分化培养基的组成及配制方法包括其组成成分去除肌醇的 WPM+6-BA1. Omg/L+KT 0. 5mg/L+2%绵白糖；其配制方法是采用自来水配制后并消毒。
为了达到更好的效果，步骤(2)中所述的苗木截段优选按照以下方法进行2cm以 下的幼苗切去生理下端叶片，直接插入分化培养基中培养；2cm以上的幼苗分割成1. 5-2cm 的截段，切去截段的生理下端叶片，分别得到尖端截段和中部截段(见图3)；步骤(3)或步骤(4)中所述的生根培养基的组成和配制方法包括(1)培养基的 组成去除肌醇的1/2WPM+IBA 0. 5mg/L+2%绵白糖；⑵配制方法用自来水代替蒸馏水配 制培养基；用卡拉胶代替琼脂配制培养基；配制后高温高压灭菌。步骤(3)或步骤(4)中所述的幼苗截段优选按照以下方法进行将幼苗从培养基 中取出，切取单棵幼苗；2cm以下的幼苗切去生理下端叶片；2cm以上的幼苗分割成1. 5-2cm 的截段，将截段生理下端叶片切去，分别得到尖端截段和中部截段(见图4)；本发明欧美山杨杂种的组织培养快速繁殖方法主要具有以下几方面的优点1.生产成本低、可实现工厂化生产本发明方法使用廉价的替代品配制培养基 (以普通自来水代替蒸馏水；以绵白糖代替分析用蔗糖，卡拉胶代替琼脂配制培养基)；去 除肌醇；降低大量元素用量；本发明方法的生产成本相比于现有技术有显著降低，可实现 工业化生产。2.幼苗生长速度快采用本发明组织培养方法，欧美山杨杂种生长20-30天即可 成苗，与常规的组织培养方法(分化培养)相比，生长时间缩短了一半。3.组培苗及移栽苗成活率高。组培苗从幼苗尖端截段转接生根培养基，成活率 高达98%以上；中、下端截段成活率也可达70%以上。移栽苗幼苗尖端截段，生根移栽成 活率50%以上；中、下端截段粗壮，生根移栽成活率60% -75%。4.幼苗健壮，叶色嫩绿，不易玻璃化。本发明使用生根继代培养来代替传统的无根继代培养技术采用生根培养后幼苗 截段，转接到生根培养基中，可以用于继代培养或直接成苗后移栽，从而克服欧美山杨杂种 多次继代后植株黄化、繁殖系数低、组培苗成活率低等的缺点。现有的组织培养方法多是分化培养后接着进行继代培养(图2)，分化培养后幼苗 细弱，多次继代培养后，幼苗易出现玻璃化、黄叶、落叶等现象，连续继代后需复壮幼苗；本 发明方法采用生根培养后再进行继代培养可避免这类现象省去复壮过程。生根继代培养虽 不及分化培养产生幼苗数量多，但生长速度快、成活率高、苗势健壮。因此，选用生根培养转 接生根继代培养的培养方法，可以防止由于长期继代后的幼苗玻璃化现象的出现。总之，本发明欧美山杨杂种的组织培养快速繁殖方法具有幼苗生长速度快，成活 率高，幼苗健壮，叶色嫩绿，不易玻璃化，生产成本低、可工厂化生产等优点。
图1本发明欧美山杨杂种的组织培养(生根继代)的流程图。图2常规欧美山杨杂种组培(无根继代)的技术流程图。图3本发明欧美山杨杂种的组织培养分化培养的幼苗(箭头所指部分是需要切取 的截段)。图4本发明欧美山杨杂种的组织培养生根培养的幼苗(箭头所指部分是需要切取 的截段)。图5本发明欧美山杨杂种的组织培养的有根继代植株(生根培养需要20天左
图6常规欧美山杨杂种组培的无根继代植株(分化培养45天)。图7本发明欧美山杨杂种的组织培养的幼苗尖端截段接入生根培养基中培养。图8本发明欧美山杨杂种的组织培养的生根培养基中培养14天的生根状态(幼 苗尖端截段)。图9本发明欧美山杨杂种的组织培养的生根培养基中培养30天的生根状态(幼 苗尖端截段)。图10本发明欧美山杨杂种的组织培养的生根培养基中培养21天的生根状态(幼 苗中部截段)。图11本发明欧美山杨杂种的组织培养的幼苗中部截段接入生根培养基中培养。图12生根培养基中培养30天的生根状态(幼苗中部截段)。
具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术 人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式 进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。WPM培养基的具体组成成分如下1)大量元素1. KNO32. NH4NO33. MgSO4 · 7H204. KH2PO42)微量元素1. MnSO4 · H2O2. ZnSO4 · 7H203. CuSO4 · 5H204. H3BO35. Na2MoO4 · 2H206. KI7. CoCl2 · 6H203)钙盐1. CaCl2 · 2H204)铁盐:1. FeSO4 · 7H202. Na2-EDTA5)维生素1.烟酸
(mg/L)
1900 1650 370 170
22. 3 8. 6 0. 025 6. 2 0. 25 0. 83 0. 025
440
27. 8 37. 3
0. 5
2.盐酸硫胺素(维生素B1)0. 43.盐酸吡哆酸(维生素B6)0. 56)氨基酸1.肌醇1002.甘氨酸2实施例1(一 )材料处理欧美山杨杂种的枝条经过水培后，取嫩茎和新叶接种，在接种前用清水冲洗5min， 无菌水冲洗3 4遍，再用75%酒精浸泡30s，边浸泡边摇动。然后用0. 升汞灭菌2min， 再用灭菌的蒸馏水洗4遍，接种在WPM+6-BA1.0mg/L+2%棉白糖培养基上使之启动，形成无
菌试管苗。( 二 )培养操作过程分化培养基用自来水替代蒸馏水配制培养基；②WPM(去除肌醇)+6-BAl. Omg/ L+KT 0.5mg/L+2%市售绵白糖(用自来水配制)。1、分化继代培养利用紫外灯将超净工作台灭菌30分钟。此次过程的全部操作均在超净工作台中 的无菌环境下进行。在超净工作台中，切取单棵幼苗。2cm以下的幼苗需要切去生理下端叶 片，直接插入分化培养基中培养；2cm以上的幼苗分割成1. 5-2cm截段(见图3)，切去截段 生理下端叶片，插入分化培养基中培养。2、生根培养生根培养基①1/2WPM(去除肌醇)+IBA 0. 5mg/L+2%棉白糖(用自来水代替蒸 馏水配制培养基；用卡拉胶代替琼脂配制培养基)。利用紫外灯将超净工作台灭菌30分钟。此次过程的全部操作均在超净工作台中 的无菌环境下进行。在超净工作台中，将幼苗从培养基中取出，切取单棵幼苗。2cm以下的 幼苗切去生理下端叶片；2cm以上的幼苗分割成1.5-2cm截段(见图4)，均切去截段后的生 理下端叶片，插入生根培养基中进行生根培养。图8为幼苗尖端截段生根培养基中培养21 天的生根状态；图9为幼苗尖端截段生根培养基中培养30天的生根状态；图10为幼苗中部 截段生根培养基中培养21天的生根状态；图12为幼苗中部截段生根培养基中培养30天的 生根状态；从幼苗尖端截段转接生根培养基，成活率高达98%以上；中、下端截段成活率也 可达70%以上。3、生根后继代培养将生根后的幼苗尖端截段后转接至生根培养基，成活率高达98%以上；中、下端 截段成活率也可达70%以上。在超净工作台中，将生根培养的幼苗从培养基中取出，切取单 棵幼苗。将幼苗分割成1. 5-2cm的截段(每段保证2-3片完整叶片)(图4)，切去截段生理 下端叶片，插入生根培养基中进行继代培养。继代培养所得到的幼苗健壮，叶色嫩绿，不易 玻璃化。4、炼苗及移栽生长20-30天即可成苗，炼苗移至大棚培养。幼苗尖端截段细嫩，生根移栽成活率
650%以上；中、下端截段粗壮，生根移栽成活率60% -75%。对比试验例1一、试验方法试验方法分为试验组和对照组；试验组为采用实施例1的欧美山杨杂种的组织培养方法；对照组采用图2所示的技术流程图(所用到的培养基和培养条件为现有的欧美 山杨杂种的组织培养方法所采用的培养基和培养条件)。二、试验结果对比试验结果见表1表1生根继代和无根继代的效果比较 从对比试验结果可见，试验组无论是从苗木成活率、植株长势还是生长速度等方 面都明显要优于对照组。
权利要求
一种欧美山杨杂种(Populus tremula×P.tremuloides)组织培养的快速繁殖方法，包括以下步骤(1)欧美山杨杂种的外植体消毒后接种在启动培养基上培养，得到无菌试管苗；(2)将步骤(1)所得到无菌试管苗截段，插入分化培养基中培养；(3)将步骤(2)所得到幼苗截段，插入生根培养基中进行生根培养；(4)将生根后的幼苗截段后转接至生根培养基进行继代培养；(5)炼苗、移栽，即得。
2.按照专利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于步骤(1)中所述的欧美山杨杂 种的外植体是欧美山杨杂种的嫩茎或新叶。
3.按照专利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于，步骤(1)中所述的消毒方式是 在接种前用清水冲洗5分钟，无菌水冲洗3 4遍，再用75%酒精浸泡30秒，边浸泡边摇 动。然后用0. 升汞灭菌2分钟，再用灭菌的蒸馏水洗4遍。
4.按照专利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于，步骤(1)中所述的启动培养基的 组成为WPM+6-BA 1. Omg/L+2%蔗糖。
5.按照专利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于步骤(2)中所述的分化培养基 的组成成分及配制方法包括其组成成分去除肌醇的WPM+6-BA1. Omg/L+KT 0. 5mg/L+2% 绵白糖；其配制方法是采用自来水配制后并消毒。
6.按照专利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于步骤(2)中所述的苗木截段按 照以下方法进行2cm以下的幼苗切去生理下端叶片，得到尖端截段直接插入分化培养基 中培养；2cm以上的幼苗分割成1. 5-2cm的截段，切去截段的生理下端叶片，分别得到尖端 截段和中部截段。
7.按照专利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于步骤(3)或步骤(4)中所述的生 根培养基的组成和配制方法包括培养基的组成去除肌醇的1/2WPM+IBA 0. 5mg/L+2%绵 白糖；其配制方法包括用自来水代替蒸馏水配制培养基，用卡拉胶代替琼脂配制培养基； 配制后高温高压灭菌。
8.按照专利要求1所述的快速繁殖方法，其特征在于步骤(3)或步骤(4)中所述的 幼苗截段按照以下方法进行将幼苗从培养基中取出，切取单棵幼苗；2cm以下的幼苗切去 生理下端叶片得到尖端截段；2cm以上的幼苗分割成1. 5-2cm的截段，将截段生理下端叶片 切去，分别得到尖端截段和中部截段。
全文摘要
本发明公开了一种欧美山杨杂种(Populus tremula×P.tremuloides)组织培养的快速繁殖方法，包括以下步骤(1)将欧美山杨杂种的外植体消毒后接种在启动培养基上培养，得到无菌试管苗；(2)将步骤(1)所得到试管苗截段，插入分化培养基中培养；(3)将步骤(2)所得到幼苗截段，插入生根培养基中进行生根培养；(4)将生根后的幼苗截段后转接至生根培养基进行继代培养；(5)炼苗、移栽，即得。本发明欧美山杨杂种的组织培养快速繁殖方法具有幼苗生长速度快，成活率高，幼苗健壮，叶色嫩绿，不易玻璃化，生产成本低、可工厂化生产等优点。
文档编号A01H4/00GK101897296SQ20101023088
公开日2010年12月1日 申请日期2010年7月15日 优先权日2010年7月15日
发明者孟凡娟, 杨传平, 王秋玉, 闫绍鹏, 魏志刚 申请人:东北林业大学