专利名称：一种适用于植物组织培养的抑菌剂组合物及使用方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域中的植物组织培养技术；涉及一种适用于植物组织培养 的抑菌剂组合物及使用方法。
背景技术：
植物组培苗工厂化生产在我国发展速度很快，组织培养各方面的技术日渐完善。 但在组织培养中常常出现不同程度的污染。据了解，很多学者在初代培养这一阶段，很难得 到无菌苗，或者虽然在初代培养得到了无菌苗，但在继代培养时往往出现大量污染甚至全 部污染。因此，控制或降低污染率是植物组织培养工厂化生产中不可忽视的关键技术环节， 同时也是衡量组织培养工作效率高低的重要指标之一。从植物组织培养的全过程来看，每 一环节都可能出现污染，为了实现低污染率，在组织培养过程中除了加强无菌意识，提高无 菌操作各环节的技术规程，注重无菌操作训练，提高操作水平外，同时在培养基中针对性的 加入抑菌剂、抗菌素等，也是减少或防止真菌和细菌污染的重要手段和方法。研究和筛选、 推广使用新型抑菌剂，对于减少或防止真菌和细菌污染、降低种苗生产成本，具有十分重要 的意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种适用于植物组织培养的抑菌剂组合物及 使用方法。用于植物组织培养中，可减少或防止真菌和细菌污染的抑菌剂组合物。它可广 泛应用于植物组织培养快速繁殖、再生植株体系建立等植物生物技术领域。本发明的技术方案是适用于植物组织培养的抑菌剂组合物(以下简称抑菌剂)是指含ε “聚赖氨酸、 异噻唑啉酮和中草药诃子、千里光、香薷水提物及其他如柠檬酸、苯甲酸钠及稳定剂等。用 于植物外植体消毒处理中，先用本发明的抑菌剂浸泡后再常规消毒处理，可减少升汞或次 氯酸钠的消毒时间，从而达到既灭菌又可保持外植体较高存活率的目的；在初代或继代培 养基中加入抑菌剂，可以有效减少或防止真菌和细菌污染，使植物组织正常生长发育，对植 物的生根、生长、分化等几乎无不良影响，提高组织培养成功率；应用在植物开放式组织培 养中，如植物培养后期的壮苗生根阶段，可用塑料杯(瓶、盒)作培养容器，省去培养基高压 灭菌程序，且不需超净工作台也可接种，脱离严格无菌的操作环境，可以节约大量的能源、 大大降低了植物组培苗的生产和运输成本。一种适用于植物组织培养的抑菌剂，其特征在于其组成成分及配比为在抑菌剂组合物总体积IOOml中含有ε-聚赖氨酸2. 5ml，其中有效含量彡50%、异噻唑啉酮混合物，其中有效含量彡50% 22 29. 5ml、中草药水提物10 15ml 中药水提物由诃子、千里光及香薷1 1 2加水浸泡 4h后用温火煎煮而成，每IOOml中含生药4g、
柠檬酸、苯甲酸钠水溶液，其浓度为3. 5% 2.5ml、稳定剂=MgCl2，水溶液，其浓度5. 5% 3.5ml、无离子水 47. 0 59. 5ml。所述的一种适用于植物组织培养的抑菌剂，其使用方法1)用于植物外植体消毒处理中，先用抑菌剂浸泡后，再常规消毒处理，可减少升汞 或次氯酸钠的处理时间；2)在初代或继代培养基中加入抑菌剂0.25 0.4%，可有效减少或防止真菌和细 菌的污染；3)应用在植物开放式组织培养中，如植物培养后期的壮苗生根阶段，加入该抑菌 剂，可省去培养基高压灭菌程序，不需超净工作台也可接种。所述一种适用于植物组织培养的抑菌剂，其使用方法1)应用该抑菌剂时，植物组织培养可在无菌或相对较少有菌条件下实施；其详细 过程包括(1)按先后顺序取ε-聚赖氨酸2.5ml、异噻唑啉酮混合物，有效含量彡50%，的 22 29. 5ml、中草药水提物10 15ml、柠檬酸、苯甲酸钠2. 5ml，放入IOOml容量瓶中，震荡 混合均勻，再加入稳定剂3. 5ml，用无离子水定容于100ml，倒入棕色试剂瓶中，放置于4。C 冰箱中保存备用；(2)将培养基煮沸溶解，进行常规的高温高压灭菌。待培养基冷却至45°C左右后， 以配制IL培养基计算，在培养基中加入该抑菌剂2. 5 4. Oml，然后分装于已高温高压灭菌 的培养容器内；(3)分装后，用封口膜、聚丙烯膜、玻璃纸或硫酸纸扎紧瓶口 ；(4)将分装封口后的培养基，放入操作室冷却，备用；(5)植物外植体在超净工作台内进行常规消毒处理后，将其直接接种于含有抑菌 剂的培养基中；(6)接种后的日常管理将接种后的培养材料置于满足植物组织培养的温度、光 照条件的房间或设施内进行培养；(7)壮苗生根培养可以在相对较少有菌的条件下实施培养基无需高压灭菌，接 种也不需超净工作台。本发明具有以下优点和特点本发明解决了植物组织培养产业化生产中防污染体系建立的重要难题。用于植物 外植体消毒处理中，先用本发明的抑菌剂浸泡后再常规消毒处理，可减少升汞或次氯酸钠 的消毒处理时间，从而达到既灭菌又可保持外植体较高存活率的目的；在初代或继代培养 基中加入抑菌剂，能有效减少或防止真菌和细菌污染，使植物组织正常生长发育，并且对植 物的生根、生长、分化等几乎无不良影响；应用在植物开放式组织培养中，如植物培养后期 的壮苗生根阶段，培养基中加入该抑菌剂，可省去培养基高压灭菌程序，且不需超净工作台 也可接种，因此可以节约大量的能源、大大降低了植物组培苗的生产和运输成本，提高了经 济效益。该抑菌剂应用方法简单、价廉、可靠、效果较好。针对植物组织培养过程中非常容易出现污染而造成重大损失的问题，本发明人进 行了大量的研究工作，最终筛选出一种适用于植物组织培养的新型抑菌剂。用于植物外植
5体消毒处理中，先用本发明的抑菌剂浸泡后再常规消毒处理，可减少升汞或次氯酸钠的消 毒处理时间，从而达到既灭菌又可保持外植体较高存活率的目的；在初代或继代培养基中 加入抑菌剂，能有效减少或防止真菌和细菌污染，使植物组织正常生长发育，并且对植物的 生根、生长、分化等几乎无不良影响，在较短时间内就可获得大量再生植株，建立试管苗的 无菌繁殖体系，从而大大地提高了植物组织培养的成功率；将该抑菌剂应用在植物培养后 期的壮苗生根阶段，可用塑料杯(瓶、盒)作培养容器，省去培养基高压灭菌程序，且不需超 净工作台也可接种，脱离严格无菌的操作环境，因此可以节约大量的能源、大大降低了植物 组培苗的生产和运输成本，提高了经济效益。1.该抑菌剂应用方法简单、价廉、可靠、效果较好等优点。2.应用到植物组织培养快速繁殖及再生植株体系建立中，可在较短时间内就可获 得大量再生植株，建立试管苗的无菌繁殖体系，从而大大地提高了植物组织培养的成功率， 具有很好的实际应用效果。3.应用本抑菌剂，与国内目前大多数人所采用的传统的在培养基中加入抗生素的 方法相比，可以较好地解决了一旦不再添加抗生素后真菌和细菌污染就会复发的问题。
图1植株组织培养抑菌剂的配制和应用路线图
具体实施例方式一种适用于植物组织培养的抑菌剂，其组成成分及配比为在抑菌剂组合物总体积IOOml中含有ε -聚赖氨酸2. 5ml (有效含量彡50% )、异 噻唑啉酮混合物(有效含量彡50% ) 22 29. 5ml、中草药水提物10 15ml (中药水提物由 诃子、千里光及香薷1 1 2加水浸泡4h后用温火煎煮而成，每IOOml中含生药4g)、柠檬 酸、苯甲酸钠(水溶液浓度为3. 5%)等2. 5ml、稳定剂(MgCl2等，水溶液浓度5. 5% ) 3. 5ml、 无离子水47. 0 59. 5ml。用于植物外植体消毒处理中，先用本发明的抑菌剂浸泡后再常规消毒处理，可减 少升汞或次氯酸钠的消毒时间，从而达到既灭菌又可保持外植体较高存活率的目的；在初 代或继代培养基中加入抑菌剂0. 25 0. 4%，能有效减少或防止真菌和细菌污染，并对植 物的生根、生长、分化等无不良影响，提高了植物组织培养的成功率；应用在植物开放式组 织培养中，如植物培养后期的壮苗生根阶段，可用塑料杯(瓶、盒)作培养容器，在培养基中 加入该抑菌剂，省去培养基高压灭菌程序，且不需超净工作台也可接种，脱离严格无菌的操 作环境，因此可以节约大量的能源、大大降低了植物组培苗的生产和运输成本，提高了经济 效益。其特征在于植物组织培养是可在无菌或相对较少有菌条件下实施；其过程包 括将ε _聚赖氨酸、异噻唑啉酮、诃子、千里光及香薷水提物、柠檬酸、苯甲酸钠及稳定剂 等，按顺序依次按需要量吸取，并混勻，用无离子水定容；装入棕色玻璃瓶中，放入低温箱 (4°C )内保存；用于植物外植体消毒处理中，先用本发明的抑菌剂浸泡后再常规消毒处理， 可减少升汞或次氯酸钠的消毒处理时间，从而达到既灭菌又可保持外植体较高存活率的目 的；制备培养基时，将培养基煮沸溶解，加入激素，进行常规高温高压灭菌；待培养基冷却
6至45°C后，在培养基中加入抑菌剂，然后分装于已高温高压灭菌的培养容器内；植物外植 体在超净工作台内进行常规消毒处理后，可将其直接接种于含有抑菌剂的培养基中；将接 种后的培养材料置于满足植物组织培养的温度、光照条件的房间或设施(如温室)内进行 培养；外植体将被诱导出愈伤组织或分化出的不定芽与植株；壮苗生根培养在相对较少有 菌条件下实施；壮苗生根培养基无需高压灭菌，接种也不需超净工作台。本发明较好地解决了植物组织培养产业化生产中防污染体系建立的重要难题。用 于植物外植体消毒处理中，先用本发明的抑菌剂浸泡后再常规消毒处理，可减少升汞或次 氯酸钠的消毒处理时间，从而达到既灭菌又可保持外植体较高存活率的目的；在初代或继 代培养基中加入抑菌剂，能有效减少或防止真菌和细菌污染，使植物组织正常生长发育，并 且对植物的生根、生长、分化等几乎无不良影响，提高了组织培养成功率；应用在植物开放 式组织培养中，如植物培养后期的壮苗生根阶段，用塑料杯(瓶、盒)作培养容器，培养基 可省去高压灭菌程序，接种可不需超净工作台，脱离严格无菌的操作环境，因此可以节约大 量的能源、大大降低了植物组培苗的生产和运输成本，提高了经济效益，从而形成了一种简 单、易行且在无菌条件下短时间内大量获得再生植株，建立试管苗的无菌繁殖体系。下面通过具体实施例，进一步详细介绍本发明实施例1红掌茎尖愈伤组织的诱导和植株再生实施例1是在无菌条件下实施。(一)愈伤组织的诱导(1)取红掌植株的幼嫩侧芽或顶芽作为外植体；(2)将侧芽或顶芽先用洗衣粉液浸泡lOmin，用流水冲洗20min ；(3)在超净工作台上可先用本发明的抑菌剂浸泡6 8min，再用75%酒精处理 15s,0. 升汞处理7 Smin取出，用无菌水冲洗5次后浸入无菌水中备用；(4)将预处理后的侧芽或顶芽用已消毒的手术刀切去多余苞片，只剩下较小的茎 尖和芽尖，将其接种于含有0. 2%抑菌剂的诱导培养基上进行培养，接种时保持所述茎尖和 芽尖向上；(5)培养温度为23 27°C，先在连续黑暗条件下诱导20d，随后逐渐增加光照再生 长30 60d，即可诱导出愈伤组织或不定芽；( 二)不定芽的诱导和分化(1)将诱导出的所述愈伤组织或不定芽置于含有0. 2%抑菌剂的分化培养基上培 养，可以诱导分化出大量的不定芽。(2)培养温度为23 27°C、光照为每天12h ；(三)无菌苗的增殖培养将分化出的所述不定芽置于含有0. 2%抑菌剂的增殖培养基上增殖培养出生根的 无菌苗。实施例2红掌再生植株的壮苗生根培养实施例2是在相对较少有菌条件下实施。可用塑料杯(瓶、盒)作培养容器，培养 基省去高压灭菌程序，接种可不需超净工作台，脱离严格无菌的操作环境。(1)制备含有抑菌剂的壮苗生根培养基将培养基煮沸溶解，加入植物壮苗生根 的激素；待培养基冷却至45°C后，在培养基中加入该抑菌剂2. Oml/1，然后分装于已洗净并晾干的培养容内(如塑料杯、塑料瓶、塑料盒等)；用封口膜封口。(2)在较为洁净的植物组培操作室内，将诱导出的不定芽置于含有0.2%抑菌剂 的壮苗生根培养培养基上培养；(3)培养温度为23 27°C、光照为每天12h ；(4)培养20 30d，即可获得根系发育良好，生长健壮的植株；(5)当苗长至株高2 4cm、最大叶宽0. 7 0. 9cm且带有2 3条粗壮根时即可 进行移栽驯化。实施例3 ‘青苹果’竹芋植株幼嫩茎段和茎尖的外植体消毒处理(1)取‘青苹果’竹芋植株的幼嫩侧芽或顶芽作为外植体；(2)将侧芽或顶芽先用洗衣粉液浸泡20min，用流水冲洗30min ；(3)在超净工作台上，用本发明的抑菌剂浸泡6 8min，再用75%酒精处理15s、 0. 升汞处理9 IOmin取出，用无菌水冲洗5次后浸入无菌水中备用；(4)将预处理后的侧芽或顶芽用已消毒的手术刀切去多余苞片，只剩下较小的茎 尖和芽尖，将其接种于含有或不含抑菌剂的诱导培养基上进行培养，接种时保持所述茎尖 和芽尖向上。
权利要求
一种适用于植物组织培养的抑菌剂，其特征在于其组成成分及配比为在抑菌剂组合物总体积100ml中含有ε 聚赖氨酸2.5ml，其中有效含量≥50％、异噻唑啉酮混合物，其中有效含量≥50％ 22～29.5ml、中草药水提物10～15ml中药水提物由诃子、千里光及香薷1∶1∶2加水浸泡4h后用温火煎煮而成，每100ml中含生药4g、柠檬酸、苯甲酸钠水溶液，其浓度为3.5％ 2.5ml、稳定剂MgCl2，水溶液，其浓度5.5％ 3.5ml、无离子水47.0～59.5ml。
2.根据权利要求1所述的一种适用于植物组织培养的抑菌剂，其使用方法1)用于植物外植体消毒处理中，先用抑菌剂浸泡后，再常规消毒处理，可减少升汞或次 氯酸钠的处理时间；2)在初代或继代培养基中加入抑菌剂0.25 0. 4%，可有效减少或防止真菌和细菌的 污染；3)应用在植物开放式组织培养中，如植物培养后期的壮苗生根阶段，加入该抑菌剂，可 省去培养基高压灭菌程序，不需超净工作台也可接种。
3.根据权利要求2所述的一种适用于植物组织培养的抑菌剂，其使用方法应用该抑菌剂时，植物组织培养可在无菌或相对较少有菌条件下实施；其详细过程包括(1)按先后顺序取ε-聚赖氨酸2.5ml、异噻唑啉酮混合物，有效含量>50%，的22 29. 5ml、中草药水提物10 15ml、柠檬酸、苯甲酸钠2. 5ml，放入IOOml容量瓶中，震荡混合 均勻，再加入稳定剂3. 5ml，用无离子水定容于100ml，倒入棕色试剂瓶中，放置于4°C冰箱 中保存备用；(2)将培养基煮沸溶解，进行常规的高温高压灭菌。待培养基冷却至45°C左右后，以配 制IL培养基计算，在培养基中加入该抑菌剂2. 5 4. Oml，然后分装于已高温高压灭菌的培 养容器内；(3)分装后，用封口膜、聚丙烯膜、玻璃纸或硫酸纸扎紧瓶口；(4)将分装封口后的培养基，放入操作室冷却，备用；(5)植物外植体在超净工作台内进行常规消毒处理后，将其直接接种于含有抑菌剂的培养基中；(6)接种后的日常管理将接种后的培养材料置于满足植物组织培养的温度、光照条 件的房间或设施内进行培养；(7)壮苗生根培养可以在相对较少有菌的条件下实施培养基无需高压灭菌，接种也 不需超净工作台。
4.根据权利要求2所述的一种适用于植物组织培养的抑菌剂，其使用方法1)在制备该抑菌剂组合物时，按先后顺序取ε-聚赖氨酸2. 5ml、异噻唑啉酮混合物 (有效含量≥50% ) 22 29. 5ml、中草药水提物10 15ml、柠檬酸、苯甲酸钠等2. 5ml，放 入IOOml容量瓶中，震荡混合均勻，再加入稳定剂3. 5ml，用无离子水定容于100ml，倒入棕 色试剂瓶中，放置于4°C冰箱中保存备用；2)配制培养基时，用量筒将母液按顺序依次按需要量吸取各种成分，并混合在一起。将 不锈钢锅内加入一定的蒸馏水或其他洁净水和蔗糖，加入琼脂粉，加温溶解，再加蒸馏水定 容至所需体积，用氢氧化钠或盐酸将PH调至培养植物所需的要求值；3)按照组织培养不同植物和不同阶段需要加入不同的植物激素及用量；4)将培养基煮沸溶解，进行常规的高温高压灭菌；5)待培养基冷却至45°C左右后，以配制IL培养基计算，在培养基中加入该抑菌剂 2. 5 4. 0ml，然后分装于已高温高压灭菌的培养容器内；6)分装后，用封口膜扎紧瓶口。将分装封口后的培养基，放入操作室冷却，备用；7)植物外植体在超净工作台内进行常规消毒处理后，将其直接接种于含有抑菌剂的培养基中；8)接种后的日常管理将接种后的培养材料置于满足植物组织培养的温度、光照条件 的房间或设施(如温室)内进行培养；9)壮苗生根培养可以在相对较少有菌的条件下实施培养基无需高压灭菌，接种也不 需超净工作台。
全文摘要
本发明涉及一种适用于植物组织培养的抑菌剂组合物。其成分及配比为ε-聚赖氨酸、异噻唑啉酮混合物各占抑菌剂总体积(ml)的2.5％、22～29.5％；中药水提物占10～15％；山梨酸钾、苯甲酸钠等占2.5％；稳定剂占3.5％；无离子水占47.0％～59.5％。用于植物外植体消毒时，用本抑菌剂浸泡后再常规消毒，可减少升汞或次氯酸钠的处理时间，达到既灭菌又保持外植体较高存活率的目的；在初代或继代培养基中加入抑菌剂，可有效减少或防止真菌和细菌的污染，对植物生长无不良影响；应用在植物开放式培养中，如壮苗生根阶段，可省去培养基高压灭菌程序，不需超净工作台，可节约能源、降低组培苗的成本，提高效益。
文档编号A01H4/00GK101946809SQ20101025710
公开日2011年1月19日 申请日期2010年8月19日 优先权日2010年8月19日
发明者刘亚, 夏时云 申请人:天津市农业生物技术研究中心