专利名称：温郁金1号的组织培养法的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种温郁金1号的组织培养法。
背景技术：
温郁金具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗艾滋病等多种药理活性，临床上用于治疗肺 癌、肝癌、乳腺癌、胸腹水等。其在浙南有一千多年的栽培历史，主产地浙江瑞安，且多栽培， 少野生。但因多年种植、管理混乱，并随着环境污染及土壤营养贫瘠等日趋严重，导致温郁 金药材种质退化、品质下降，这严重影响了温郁金药材产业的发展。温郁金1号作为温郁金的品种之一，可由乐清市源生中药材种植有限公司提供。 目前现有的温郁金1号的培育法为种茎繁殖，该方法具有如下缺陷年繁殖率仅为25倍左 右ο温郁金脱毒组织培养技术研究(汪洪，2009，药物生物技术)公开了一种温郁金的 培养方法，该方法具有如下不足之处不定芽的繁殖系数低，仅为2 4倍；增殖周期长，约 为4周；而且在不定芽增殖过程中，根原基被诱导，发育成大量根系，不定芽和不定根的同 时生长不仅严重影响了增殖效率，而且使不定芽的继代分割不易操作，最终导致种苗质量 下降，移栽成活率低，仅达85%。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种温郁金1号的组织培养法，采用该方法能快 速获得大量的温郁金1号组培种苗。为了解决上述技术问题，本发明提供一种温郁金1号的组织培养法，依次包括以 下步骤1)、将无病斑、无虫瘿且健壮饱满的温郁金1号块根放入生化培养箱进行催芽，直 至长成0. 5 2. Ocm高的小芽；培养条件为26 28°C暗培养；2)、割取上述小芽进行流水冲洗；3)、将上述流水冲洗后的小芽经常规消毒后，剥取3 5毫米大小的茎尖作为外植 体接种到无菌苗培养基上进行培养；培养条件为16小时光照，光照强度30 40μπιΟ1 m_2. s—1，温度为27 士 1°C ；8小时暗培养，温度为21 士 1°C ；上述光照和暗培养交替进行；4)、待上述茎尖长至1. 0 2. Ocm高时进行割取作为小苗I ；将上述小苗I接种到 不定芽诱导培养基上进行培养；培养条件为16小时光照，光照强度30 40μπιΟ1 nTU， 温度为27士 1°C ；8小时暗培养，温度为21 士 1°C ；上述光照和暗培养交替进行；5)、待从小苗I上诱导出的不定芽I长到1.0 3. Ocm高时，割取不定芽I作为 小苗II ；将上述小苗II接种到增殖培养基上进行培养；培养条件为16小时光照，光照强度 30 40 μ mol πΓ2. s—1，温度为26 28°C ；8小时暗培养，温度为20 22°C ；上述光照和暗 培养交替进行；6)、待上述小苗II上长出的不定芽II长到3. 0 6. Ocm高时，割取不定芽II作为小苗III ；将此小苗III接种到生根培养基中；培养条件为16小时光照，光照强度40 50μπιΟ1 m_2. s—1，温度为26 28°C ；8小时暗培养，温度为20 22°C ；上述光照和暗培养交替进行；7)待上述小苗III长到高4 8cm且具有至少3条长于2cm的根时，得可出瓶种植 的种苗。作为本发明的温郁金1号的组织培养法的改进将温郁金1号的小芽放入纱袋中， 无菌水冲洗1 2小时。作为本发明的温郁金1号的组织培养法的进一步改进步骤3)中的无菌苗培养基为1/2MS基本培养基+白砂糖20 30g/l+琼脂4 9g/l, pH 为 5. 5 6. 0 ；步骤4)中的不定芽诱导培养基为MS基本培养基+TDZ 0. 05 0. 5mg/l+白砂糖 20 30g/l+ 琼脂 4 9g/l, pH 为 5. 5 6. 0。步骤5)中的增殖培养基为MS基本培养基+TDZ 0. 05 0. 5mg/l+白砂糖20 30g/l+ 琼脂 4 9g/l，pH 为 5. 5 6. 0。步骤6)中的生根培养基为=IAMS基本培养基+白砂糖15 20g/l+琼脂4 10g/l, pH 为 5. 5 6. 0。在本发明中无菌苗培养基的制作方法具体如下以1/2MS基本培养基(即溶液中所有物质的 含量为MS基本培养基的一半)为基础，分别加入白砂糖、琼脂均勻混合，利用lmol/L的KOH 或lmol/L的HCl调节pH为5. 5 6. 0 ；每IL的1/2MS基本培养基中加20 30g白砂糖、 4 9g琼脂。不定芽诱导培养基的制作方法具体如下以MS基本培养基为基础，分别加入N-苯 基-N' -1,2, 3-噻二唑-5脲(TDZ)、白砂糖、琼脂均勻混合，利用lmol/L的KOH或lmol/L 的HCl调节pH为5. 5 6. 0 ；每IL的MS基本培养基加入0. 05 0. 5mg的TDZ、20 30g 白砂糖、4 9g琼脂。增殖培养基的制作方法具体如下以MS基本培养基为基础，分别加入N-苯 基-N' -1,2, 3-噻二唑-5脲(TDZ)、白砂糖、琼脂均勻混合，利用lmol/L的KOH或lmol/L 的HCl调节pH为5. 5 6. 0 ；每IL的MS基本培养基加入0. 05 0. 5mg的TDZ、20 30g 白砂糖、4 9g琼脂。生根培养基的制作方法具体如下以1/2MS基本培养基(即溶液中所有物质的含 量为MS基本培养基的一半)为基础，分别加入白砂糖、琼脂均勻混合，利用lmol/L的KOH或 lmol/L的HCl调节pH为5. 5 6. 0 ；每IL 1/2MS基本培养基中加15 20g白砂糖、4 IOg琼脂。本发明的温郁金1号组织培养法，属于一种离体快速繁殖的组织培养方法。依照 植物组织培养中细胞全能性的原理，可以在短时间内生产大量遗传背景相同、长势一致的 优质种苗(种子)，而且依靠实验室可以实现周年的长期提供优质种苗。在本发明的方法 中，将健康饱满的温郁金1号块根进行催芽，并割取小芽进行消毒；再通过合适的诱导培养 基进行诱导不定芽以及增殖不定芽，可以获得大量的无菌苗。采用本发明的方法，一般仅需 45 60天即可得到可出瓶种植的种苗；因此温郁金1号组培苗一周年内的繁殖系数理论 上为61(1倍以上。所以，本发明的温郁金的组织培养法，是一种不受季节等因素影响，高效、快速提供优质温郁金种苗的方法，可以加速良种推广速度，提高田间品种种植产量。综上所述，本发明建立的温郁金1号组织培养体系将为良种(温郁金1号)工厂 化育苗提供理论依据和技术支撑。本发明所得的种苗可采用以下常规方法进行种植待种苗高4 8cm且具有至少 3条长于2cm的根时，进行炼苗驯化，在室温下(25°C左右)放置2 3d后开瓶，然后在自 然光下放置2 3d后取出小苗，用温水(30°C左右)洗净根部琼脂，并晾干至根系发白，移 栽入营养土中，(泥炭珍珠岩蛭石=4 3 3的重量比)，于人工气候箱室培养，培养 条件温度20 25°C，湿度85% 90%，光照强度15 25μπι01 πΓ2. s—1 ；3 5周后光照 强度30 40 μ mo 1 πΓ2. s—1 ；2个月后，存活率达到95%以上。
具体实施例方式实施例1 一种温郁金1号的组织培养法，依次进行以下步骤1)、将无病斑、无虫瘿且健壮饱满的温郁金1号块根放入生化培养箱进行催芽，直 至长成0. 5 2. Ocm高的小芽；培养条件为26 28°C暗培养。2)、割取上述小芽转入纱袋，无菌水流水冲洗1 2小时。3)、将上述流水冲洗后的小芽经常规消毒后(即0. w/v HgCl2处理6 10分 钟后，无菌水冲洗5 8遍，然后用无菌滤纸吸干)，剥取3-5毫米大小的茎尖作为外植体接 种到无菌苗培养基上进行培养；培养条件为16小时光照，光照强度30 40μπιΟ1 nrU， 温度为27士 1°C ；8小时暗培养，温度为21 士 1°C ；上述光照和暗培养交替进行；无菌苗培养基为1/2MS基本培养基+白砂糖25g/l+琼脂7g/l，pH为5. 5 6.0。4)、待上述茎尖长至1. 0 2. Ocm高时，割取成单株的小苗I ；将上述小苗I接种 到不定芽诱导培养基上进行培养；培养条件为16小时光照，光照强度30 40μπιΟ1 m_2. s—1，温度为27 士 1°C ；8小时暗培养，温度为21 士 1°C ；上述光照和暗培养交替进行；不定芽诱导培养基为MS基本培养基+TDZ 0. 2mg/l+白砂糖25g/l+琼脂7g/l，pH 为 5. 5 6. 0。5)、待从小苗I上诱导出的不定芽I长到1.0 3. Ocm高时，割取成2 5株丛生 的小苗II ；将上述小苗II接种到增殖培养基上进行培养；培养条件为16小时光照，光照强 度30 40 μ mol πΓ2. s—1，温度为26 28°C ；8小时暗培养，温度为20 22°C ；上述光照和 暗培养交替进行；增殖培养基为MS基本培养基+TDZ 0. 25mg/l+白砂糖25g/l+琼脂6g/l，pH为 5. 5 6. O06)、待上述小苗II长出的不定芽II长到3. 0 6. Ocm时，割取得小苗III ；将此小苗 III接种到生根培养基中；培养条件为16小时光照，光照强度40 50μπιΟ1 nTU，温度为 26 28°C ；8小时暗培养，温度为20 22°C ；上述光照和暗培养交替进行；生根培养基为:1/2MS基本培养基+白砂糖17g/l+琼脂7g/l，pH为5. 5 6. 0。7)待上述小苗III长到高4 8cm且具有至少3条长于2cm的根时，得可出瓶种植 的种苗。依照上述方法，只需45 50天即可获得试管苗；因此采用本发明的方法可以长期 得到大量的试管苗。
实施例2、一种温郁金1号的组织培养法，仅对培养基的配方进行如下更改，其余 同实施例1 无菌苗培养基为1/2MS基本培养基+白砂糖20g/l+琼脂9g/l，pH为5. 5 6.0。不定芽诱导培养基为MS基本培养基+TDZ 0. 05mg/l+白砂糖30g/l+琼脂4g/l， pH 为 5. 5 6. 0。增殖培养基为MS基本培养基+TDZ 0. 45mg/l+白砂糖30g/l+琼脂4g/l，pH为 5. 5 6. O0生根培养基为:1/2MS基本培养基+白砂糖15g/l+琼脂10g/l, pH为5. 5 6. 0。依照上述方法，只需45 50天即可获得试管苗；因此采用本发明的方法可以长期 得到大量的试管苗。实施例3、一种温郁金1号的组织培养法，仅对培养基的配方进行如下更改，其余 同实施例1 无菌苗培养基为1/2MS基本培养基+白砂糖30g/l+琼脂4g/l，pH为5. 5 6.0。不定芽诱导培养基为MS基本培养基+TDZ 0. 5mg/l+白砂糖20g/l+琼脂9g/l，pH 为 5. 5 6. 0。增殖培养基为MS基本培养基+TDZ 0. 06mg/l+白砂糖20g/l+琼脂9g/l，pH为 5. 5 6. O0生根培养基为:1/2MS基本培养基+白砂糖20g/l+琼脂4g/l，pH为5. 5 6. 0。依照上述方法，只需45 50天即可获得试管苗；因此采用本发明的方法可以长期 得到大量的试管苗。综上所述，本发明的温郁金1号的组织培养法具有如下特点1、繁殖系数高(5-8 倍)，增值周期短(14-20天)；2、增值阶段不诱导根原基发育，不定芽的增殖一致性好。3、 激素TDZ的成本降低50倍左右，且种苗质量好，移栽成活率高达95%以上。对比例将温郁金1号块根改成按照现有的温郁金脱毒组织培养技术研究(汪洪， 2009，药物生物技术)进行培养，然后进行相同的移栽种植，结果为不定芽的繁殖系数低， 仅为2-4倍，增值周期长，约为4周；而且在不定芽增殖过程中，根原基被诱导，发育成大量 根系，不定芽和不定根的同时生长不仅严重影响了增殖效率，而且使不定芽的继代分割不 易操作，最终导致种苗质量下降，移栽成活率低，仅达85%。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发 明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容 直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
温郁金1号的组织培养法，其特征是依次包括以下步骤1)、将无病斑、无虫瘿且健壮饱满的温郁金1号块根放入生化培养箱进行催芽，直至长成0.5～2.0cm高的小芽；培养条件为26～28℃暗培养；2)、割取上述小芽进行流水冲洗；3)、将上述流水冲洗后的小芽经常规消毒后，剥取3～5毫米大小的茎尖作为外植体接种到无菌苗培养基上进行培养；培养条件为16小时光照，光照强度30～40μmol m 2.s 1，温度为27±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；4)、待上述茎尖长至1.0～2.0cm高时进行割取作为小苗Ⅰ；将上述小苗Ⅰ接种到不定芽诱导培养基上进行培养；培养条件为16小时光照，光照强度30～40μmol m 2.s 1，温度为27±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；5)、待从小苗Ⅰ上诱导出的不定芽Ⅰ长到1.0～3.0cm高时，割取所述不定芽Ⅰ作为小苗Ⅱ；将上述小苗Ⅱ接种到增殖培养基上进行培养；培养条件为16小时光照，光照强度30～40μmol m 2.s 1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；6)、待上述小苗Ⅱ上长出的不定芽Ⅱ长到3.0～6.0cm高时，割取所述不定芽Ⅱ作为小苗Ⅲ；将此小苗Ⅲ接种到生根培养基中；培养条件为16小时光照，光照强度40～50μmol m 2.s 1，温度为26～28℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；7)待上述小苗Ⅲ长到高4～8cm且具有至少3条长于2cm的根时，得可出瓶种植的种苗。
2.根据权利要求1所述的温郁金1号的组织培养法，其特征是所述步骤2)为将温郁 金1号的小芽放入纱袋中，无菌水冲洗1 2小时。
3.根据权利要求2所述的温郁金1号的组织培养法，其特征是步骤3)中的无菌苗培养 基为1/2MS基本培养基+白砂糖20 30g/l+琼脂4 9g/l，pH为5. 5 6. 0。
4.根据权利要求3所述的温郁金1号的组织培养法，其特征是步骤4)中的不定芽诱 导培养基为MS基本培养基+TDZ 0. 05 0. 5mg/l+白砂糖20 30g/l+琼脂4 9g/l，pH 为 5. 5 6. 0。
5.根据权利要求4所述的温郁金1号的组织培养法，其特征是步骤5)中的增殖培养基 为MS基本培养基+TDZ 0. 05 0. 5mg/l+白砂糖20 30g/l+琼脂4 9g/l，pH为5. 5 6. 0。
6.根据权利要求5所述的温郁金1号的组织培养法，其特征是步骤6)中的生根培养 基为1/2MS基本培养基+白砂糖15 20g/l+琼脂4 10g/l，pH为5. 5 6. 0。
全文摘要
本发明公开了一种温郁金1号的组织培养法，依次包括以下步骤1)将无病斑、无虫瘿且健壮饱满的温郁金1号块根放入生化培养箱进行催芽；2)割取小芽进行流水冲洗；3)将小芽经常规消毒后，剥取3～5毫米大小的茎尖进行培养；4)割取茎尖作为小苗Ⅰ接种到不定芽诱导培养基上进行培养；5)割取小苗Ⅰ上诱导出的不定芽Ⅰ作为小苗Ⅱ进行增殖培养；6)割取小苗Ⅱ上长出的不定芽Ⅱ作为小苗Ⅲ进行生根培养；7)待上述小苗Ⅲ长到高4～8cm且具有至少3条长于2cm的根时，得可出瓶种植的种苗。采用该方法能快速获得大量的温郁金1号组培种苗。
文档编号A01H4/00GK101953300SQ201010265480
公开日2011年1月26日 申请日期2010年8月24日 优先权日2010年8月24日
发明者毛碧增, 陈丽闽 申请人:浙江大学