水稻细条斑病菌HpaG_xooc基因片段hpaG_28-126的应用的制作方法

专利名称：水稻细条斑病菌HpaG_xooc基因片段hpaG_28-126的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，涉及水稻细条斑病菌HpaGx。。。基因片段hpaG28_126的 应用。
背景技术：
Hrp基因广泛分布于革兰氏阴性植物病原体中，其中它们是成簇的、保守的并在某 些情况下是可互换的。每个hrp基因都含有三类基因，分别编码构成III型分泌系统的因 子、被III型分泌系统分泌的效应分子以及对III型效应因子表达与分泌起调控作用的因 子。Harpins蛋白质是III型效应分子的重要成员，该类蛋白质非常特别，性质活跃而且功 能多样。Harpins类激发子都具有相似的生化特征富含甘氨酸、不含半胱氨酸、热稳定、对 蛋白酶敏感，其主要共同生物效应是在烟草等非寄主植物上诱导过敏反应。本实验室前期研究发现了一种新的Harpins蛋白HpaGx。。。蛋白。HpaGx。。。蛋白均 含有一个半胱氨酸残基，而HrpNEa和HrpZPss等其他harpin蛋白均不含有半胱氨酸残基。 尽管HpaGx。。。蛋白的结构同其他harpin蛋白有所不同，但他们在植物上具有相同的效应。 HpaGxooc蛋白无论体外施用于植物还是进行转基因之后，HpaGxooc都能激活不同的信号途径 而促进植物生长、诱导HCD的产生及诱导植物防卫反应。HpaGxooc的体外喷施，能增加水稻抗 病性，促进植物生长，并伴随有伸展素(expansin)基因OsEXPl的表达(Ren et al，2006)。HpaGxooc蛋白编码基因hpaGx。。。来自于水稻细菌性条斑病菌(Xanthimonas. oryzae. Oryzicola)，全长413bp，编码137个氨基酸，分子量约为15. 18kD，它包含的两个 GRM结构域分别位于72到77位氨基酸和107到112位氨基酸(刘芳等，“HpaGx。。。中的富含甘 氨酸基序和半胱氨酸抑制了其在植物上的很多作用” Phytopathol96 1052-1059 (2006))； 本实验室通过大量实验研究获得了水稻细条斑病菌HpaGx。。。蛋白编码基因hpaGx。。。的9个部 分缺失片段hpaG ι-315、hpaGi—282、hpaG^ss、IipaG1H4、hpaG19—138、hpaG184—414、hpaG28—126、hpaG283—414、 hpaG25Q_282，这九个片段分别依次对应蛋白片段HpaGH^HpaGBpHpaGimHpaGH^HpaG^p HpaG62-137、!1ρ&010—42、!1ρ&095—137、!1ρ&084—94。HpaG10_42 不会在水稻和烟草上引起过敏反 应，但却可以增加这些作物的抗病性，并增强水稻的生长，增加水稻的产量。但是，到目前为 止尚无关于HpaG1(1_42抗虫性功能的报道。

发明内容
本发明的目的是提供水稻细条斑病菌HpaGx。。。基因片段hpaG28_126的应用。本发明的另一目的是提供该基因编码的蛋白片段HpaG1(l_42的应用。本发明的又一目的是提供一种包含基因hpaG28_126的重组表达载体及其应用。本发明的技术方案如下核苷酸序列为SEQ ID NO. 1的水稻细条斑病菌HpaGx。。。蛋白片段基因hpaG28_126在 导入植物获得抗虫害胁迫的品种中的应用。一种基因hpaG28_126编码的水稻细条斑病菌HpaGx。。。蛋白片段HpaG1(1_42在植物抗虫
3害胁迫中的应用，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。一种重组表达载体，该重组表达载体由SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列与44P启 动子联合形成表达组合和HYG基因被替换为manA基因的pCAMBIA1300载体组成。所述的转基因植物为转基因小麦。所述的重组表达载体在提高转基因农作物抗病性中的应用。所述的重组表达载体在提高转基因农作物抗病性和产量中的应用。本发明的有益效果由水稻细条斑病菌HpaGx。。。基因片段hpaG28_126编码的蛋白片 段HpaG1(1_42能够增强一些抗蚜虫相关基因的表达，拟南芥喷施HrpG1(1_42相对于喷施EVP，蚜 虫数量明显减少；而且喷施HrpG1(1_42后相对于喷施EVP能明显减少小菜蛾对拟南芥的取食 量，因此水稻细条斑病菌HpaGx。。。蛋白片段HpaG1(1_42、其编码基因hpaG28_126可在导入植物获 得抗病虫害胁迫的品种中的应用。本发明所述的含水稻细条斑病菌HpaGx。。。基因片段hpaG28_126的重组表达载体，能 够明显提高小麦的产量，增强小麦的抗病能力。


图lhpaG28_126基因的酶切图谱。图2HpaG1Q_42纯化蛋白电泳图。图3喷施HrpG1Q_42后抗蚜虫效果。图4HrpG1Q_42对生长相关基因的影响。
图5喷施HrpG1(1_42后抗对小菜蛾取食影响。图6重组载体中转基因单元结构示意图，manA: :6his 带有6个组氨酸标签的磷酸甘露糖转移酶基因；44P :Myb44基因启 动子。图 7pCAMBIA1300: :ManA: :44P 载体酶切验证，其中1300::44p*pCAMBIA1300::ManA::44P，M*marker。图 8pCAMBIA1300: :ManA: :44P: :hpaG28_126: :6His 的酶切图谱，其中1300: :hrf99 为 pCAMBIA1300: :ManA: :44P: :hpaG28_126: :6His，M 为 marker。
具体实施例方式实施例lhpaG28_126基因的获得方法水稻条斑病菌基因组DNA提取取Iml过夜培养的水稻条斑病菌培养物于 1.5mlEP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于Iml TE(pH8. 0)中，加 入6μ1 50mg/ml的溶菌酶(生兴，中国)，37°C作用2h。再加2mol/L NaCl 50μ 1,10% SDSllOy l,20mg/ml的蛋白酶K(生兴，中国)3 μ 1，50°C作用3h (此时菌液应为透明粘稠液 体)。菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚氯仿异戊醇(25 24 1)，混勻，室 温放置5-lOmin。12000rpm离心lOmin，进行抽提，抽提两次，加0. 6倍体积的异丙醇，混勻， 室温放置lOmin。12000rpm离心lOmin，沉淀用75%的乙醇洗涤，抽干后，溶于50 μ 1 ddH20 中作PCR模板用。PCR扩增hpaG28_126基因引物序列为上游引物SEQ ID NO. 3，下游引物:SEQ
4IDN0. 4 ；在上游引物的5，端加入EcoRI酶切位点，在下游引物的5，端加入HindIII酶切位 点，在下游引物中加入两个连续的终止密码子(CTA和TTA)。利用上述引物进行PCR，25 μ L 反应体系为10XEx taq buffer 2. 5 μ L，dNTP 2. O μ L，Mg2+L 5 μ L，上、下游引物各 1 μ L， Ex taq 0. 2 μ L，水稻条斑病菌基因组DNA 1 μ L, ddH2015. 8 μ L。反应程序为95°C 3min, 95°C 50sec，58°C 50sec，72°C lmin，72°C IOmin0 PCR 产物经纯化回收后，连接到 pMD 19-T Simple Vector载体(Takara，Japan)上，使用EcoRI和HindIII进行双酶切，获得酶切图 谱如图1，重组载体转化大肠杆菌感受态细胞DH5 α (Takara, Japan)，送上海invitrogen公 司测序。实施例2水稻细条斑病菌HpaGx。。。蛋白片段HpaG1(1_42的获得方法使用EcoRI和HindiII对实施例1中构建的插入hpaG28_126基因片段的pMD 19-TSimple Vector载体进行双酶切，获得hpaG28_126基因片段，以正确方向插入到 pET30a(+) (invitrogen USA)载体中，重组载体转化大肠杆菌BL21 (Takara，Japan)。菌体接 种于LB液体培养基中，在28°C条件下，200rpm振荡培养18-20小时，用分光光度计测定细 菌浓度，要求0D620彡2. O。此时加入终浓度为0. 4mM的IPTG(生兴中国)诱导培养隔夜， 进行菌体收集。同样的方法转化pET30a(+)空载体，产生的无活性蛋白溶液(EVP)作为对 照。蛋白按照常规方法提取(Bauer et al,1995 ；Liu et al，2006)。5，OOOXg离心15分 钟以收集菌体，重悬于二十分之一或十分之一体积的咪唑结合缓冲液中。加入终浓度1 μ 1/ ml 的 Ready-Lyse (Epicenter Biotech. , Rockford, IL, USA)和 100 μ g/ml 的蛋白酶抑制剂 苯甲基磺酰氟(Phenylmethyl Sulfonyl Fluoride，PMSF)，冰上放置10分钟。菌液用超声 波进行破碎，在冰浴的条件下破碎菌液至澄清透明。再用4°C，10，OOOg离心20分钟去沉淀。 上清液在沸水浴中煮10分钟，12，000 X g，离心20分钟，去除沉淀所得的上清液于_20°C冷 冻过夜，解冻后离心(12，OOOXg，20分钟)，获得新的上清液即为不含细胞的蛋白制备液。 蛋白使用 HisTrap HP Kit (Amersham Biosci Corp, Piscataway, NJ, USA)的柱子进行镍 柱亲合层析纯化。镍柱用IOmL咪唑结合缓冲液先结合，注意浓度与溶解蛋白的咪唑结合缓 冲液一致。使用DANStar软件预测蛋白质的分子量，然后利用聚丙烯酰胺凝胶电泳技术确 证蛋白分子大小如图2。实施例3HrpG1(1_42蛋白片段对蚜虫的抗性HrpG10^42蛋白使用镍柱亲合层析纯化后，按照(Dong, H.，Delaney，T. P.，Bauer, D. W. ,and Beer,S. V. 1999. Harpin induces disease resistance in Arabidopsis through thesystemic acquired resistance pathway mediated by salicylic acid and the NIMl gene. Plant J. 20 :207_215.)的方法确定浓度，蛋白配制成12 μ g/ml的浓度，并加入 0. 03Silwet-77 (Momentive Performance Materials Inc. ,China Branch, Beijing)喷施生长30天的拟南芥，以喷施EVP做对照。每株拟南芥接种1龄蚜虫15头于 于心叶，接种后使用网罩套起，每天记录叶片蚜虫的数量，连续记录1周，每个实验做10个 重复。如图3，从图3可以看出喷施HrpG1Q_42相对于喷施EVP的蚜虫数量明显减少。实施例4HrpG1(1_42蛋白片段诱导抗蚜虫相关基因表达将拟南芥培养30天，然后喷施12 μ g/ml HrpG10^42 (实施例3制备)和EVP 1天后， 接种蚜虫，分别于0天，3天取样，取植株完全展开的顶部嫩叶lOOmg，液氮冷冻研磨；将勻 浆转移至2mL Eppendorf管中，加入Trizol (Takara，Japan)溶剂lmL，混勻，室温放置5分钟；加入氯仿0. 2mL，旋涡振荡器15秒；室温放置2-15分钟；4°C, 12000rpm离心15分钟； 将上层无色的水相转移至新的Eppendorf管中；加入0. 5mL异丙醇，颠倒几次混勻；室温放 置5-10分钟，使RNA沉淀；4°C，12，OOOrpm离心15分钟；加入ImL 75%乙醇冲洗或保存； 4°C, 12, OOOrpm离心15分钟，弃上清；室温干燥去除多余乙醇；加入适量的DEPC处理的无 RNase超纯水；在RNA溶液中加入无RNAase的DNase，至终浓度为0. IU/ μ L，37°C处理0. 5 小时；苯酚/氯仿/异戊醇(25 24 1)抽提；4°C，12，OOOrpm离心15分钟；取上层水 相加入2倍体积的无水乙醇，轻轻混勻，-20°C过夜；4°C，12，OOOrpm离心20分钟，弃上清； 70%冰乙醇洗沉淀，室温干燥后用DEPC处理过的超纯水溶解RNA。RT-PCR从得到的总RNA 中扩增抗蚜虫相关基因AtEXPU AtEXP2、Hell、PDFl. 2、EFl α，PCR反应体系为25 μ L反 应体系为10XEx taq buffer 2. 5 μ L, dNTP 2. 0 μ L，Mg2+L 5 μ L，上、下游引物各 1 μ L，Ex taq 0. 2 μ L，基因组 DNA 1 μ L，ddH2015. 8 μ L。反应程序95°C 3min，95°C 50s，58°C 50s， 72°C 50s, 72°C lOmin，30cycles。基因AtEXPl的PCR扩增上、下游引物序列分别为SEQ ID NO. 5, SEQ ID NO. 6;基因AtEXP2的PCR扩增上、下游引物序列分别为SEQ ID NO. 7, SEQ ID NO. 8 ；基因Hell的PCR扩增上、下游引物序列分别为SEQ ID N0. 9，SEQ ID NO. 10 ；基因 PDFl. 2的PCR扩增上、下游引物序列分别为SEQ ID N0. 11，SEQ ID NO. 12 ；基因EFl α的 PCR扩增上、下游引物序列分别为SEQ ID Ν0. 13, SEQ ID NO. 14。扩增后进行琼脂糖凝胶电 泳，如图4所示在喷施HrpG1Q_42下AtEXPl，AtEXP2，Hel 1，PDFl. 2这三个基因明显增强表达， 表明HrpG1(l_42可以增强一些抗蚜虫相关基因的表达。实施例5HrpG10_42蛋白片段对小菜蛾取食影响分别用EVP和12 μ g/ml hrpG10_42 (实施例3制备)处理拟南芥3天后，接种2头 孵育72h的小菜蛾幼虫(2龄，2-3mm)到拟南芥新叶上，每天观察记录拟南芥的被取食情况。 如图5所示，喷施HrpG10-42后相对于喷施EVP明显减少了小菜蛾对拟南芥的取食量。实施例6转基因单元的构建使用 pN0V2820 (Syngenta, Research Triangle Park, North Carolina)载体 上的PMI (ManA)基因替换pCAMBIA1300 (购自CAMBIA公司)载体上的HYG基因成为 PCAMBIA1300: ManA (此过程有金思特公司完成)。 44P启动子的获得1)拟南芥基因组DNA的获得液氮研磨0. 1 g叶片，加 ImlCTAB(国药中国)(2% )，65°C水浴lh，隔10-20min，混勻样品一次加入等体积苯酚，混 勻，室温，7000rpm，IOmin取上清，加入等体积氯仿/异丙醇(24 1)，混勻，4°C，lOOOOrpm， IOmin取上清，重复上步，再次抽提，至两液面无杂质，取上清，加入1/10体积预冷的3M NaAC(pH7. 0)及2倍体积的冷无水乙醇，缓慢摇勻，_20°C过夜。4°C，12000rpm，15min，弃 上清12000rpm，15min，分别用75 %和95 %冷无水乙醇洗涤一次，之后，风干DNA。加入 100 μ LddH2O 及 0. 5 μ LRNase(10y g/ml)，37°C，30minl %胶检测，-20°C保存。
2)PCR扩增44P 设计上游引物SEQ ID N0. 15，和下游引物SEQ ID N0. 16，在上 游引物的5’端加入EcoRI酶切位点，在下游引物的5’端加入SacI酶切位点。以上述引 物进行 PCR，25 μ L 反应体系为10 X Ex taq buffer 2. 5 μ L, dNTP 2. 0 μ L，Mg2+1. 5 μ L， 上、下游引物各lyL，Ex taq 0. 2 μ L，拟南芥基因组DNA 1 μ L，ddH2015. 8 μ L。反应 程序如下为 95 °C 3min，95°C 50sec，58°C 50sec，72°C lmin，72°C IOmin0 PCR 产物经纯 化回收后，进行EcoRI/SacI双酶切得到44P启动子，插入到pCAMBIA1300: :ManA，成为PCAMBIA1300: :ManA: :44P。酶切验证如图 7，其中 1300: 44P 为 pCAMBIA1300 :ManA: :44P, M为marker。送上海invitrogen公司测序。以实施例1构建的插入hpaG28_126基因片段的pMD 19-T Simple Vector载体 为模板，利用上游引物SEQ ID NO. 17、下游引物SEQ ID NO. 18扩增hpaG28_126基因片段，在上 游引物的5’端加入SacI酶切位点，在下游引物的5’端加入BamHI酶切位点，并在下游引物 引入6个GTG位点，得到含有6个His标记的hpaG28_126基因片段。PCR反应体系按照实施例 1。将扩增得到的基因 hpaG28_126 连接到 pMD 19-T Simple Vector 载体(Takara，Japan)，将 该重组载体命名为T: :hrf28_126，重组载体T: :hrf28_126转入大肠杆菌DH5 α中，测序正确后， 然后将载体 PCAMBIA1300: :ManA: :44P 用 Sac I/BamHI 酶切，将载体 T: :hrf28_126 也用 SacI/ BamHI 酶切得到 hpaG28_126 片段，hpaG28_126 片段与 pCAMBIA1300: :ManA: :44P 载体连接，得到 表达载体 pCAMBIA1300: :ManA: :44P: :hpaG28_126: :6His，将载体转入 DH5 α，图 6 为 pCAMBIA 1300: :ManA: :44P: :hpaG28_126: :6His 表达载体图谱；图 7 中为 pCAMBIA1300: :ManA: :44P 的 酶切图谱，其中 1300: :44p 为 pCAMBIA1300: :ManA: :44P ；图 8 为 pCAMBIA1300: :ManA: :44P :hpaG28_126: :6His 的酶切图谱。其中 1300: :hrf99 为 pCAMBIA1300: :ManA: :44P: :hpaG28_12 6: : 6Hi s, M 为 marker。实施例7基因枪微粒子弹的准备提取实施例6 中的转基因载体单元 pCAMBIA1300: :ManA: :44P: :hpaG28_126: :6His 和空载体 PCAMBIA1300: :ManA: :44P。称金粉30mg(BIA_RAD公司美国)，溶于500 μ 1无水酒精，离心2次，加 入500μ1(ΜΗ20，金粉浓度为60μβ/μ1，置-20°c冰箱备用。配备2.5M Cacl2，称取 5. 549gCacl2 — 20mlddH20，抽滤或高压灭菌，置-20°C冰箱备用。配备0. IM亚精胺，称取 145. 2mg亚精胺加入20mlddH20，抽滤或高压灭菌，置-20°C冰箱备用。取15 μ 1金粉在1. 5ml离心管，1400rpm离心30秒，去掉上清液，加Iml无菌水，离 心5分钟，去掉上清液，分别加实施例6中构建的载体pCAMBIA1300: :ManA: :44P: :hpaG28_12 6: :6His 载体和空载体 pCAMBIA1300: :ManA: :44P 25 μ 1 (浓度均为 1 μ g/μ 1)+220 μ 1 ddH20+250 μ 1 2. 5Μ CaCl2 (sigma USA)+50 μ 1 0. IM 亚精胺(sigma USA)涡旋10分钟(最好在_4°C )，离心5分钟，去掉上清液，加600 μ 1无水酒精，离心 1分钟，去掉酒精，加250 μ 1酒精悬浮。实施例8HpaG1(1_42转基因小麦产生过程采集开花后12-14天的未成熟种子(温室条件下，随温度的变化时间有所变化，幼 胚直径约1mm，处于从透明向半透明过渡时期)，70%乙醇消毒2分钟，0. 1 %升汞消毒15-20 分钟，无菌水冲洗4-5次，于超净工作台上用解剖刀取出幼胚，盾片朝上接种于MSY愈伤诱 导培养基(SD2，改良MS培养基都可以)，25 °C黑暗培养。培养6-7天，挑选质地优良的幼胚愈伤组织，集中于含0. 4M渗透压培养基(0. 2M 甘露醇+0. 2M山梨醇)的培养皿中心，直径为2. 5cm,大约50个幼胚，渗透压预处理4小时。经过渗透压预处理的幼胚愈伤组织，使用实施例7中制得的两种微粒子弹，使用 BIA-RAD公司生产的PDS 1000/He基因枪进行轰击，(psill00，Hg 27.5)轰击后的愈伤组织
7在渗透压培养基上后处理16小时。将愈伤组织转移到MSY培养基(SD2或改良MS培养基)恢复培养2周。恢复培养 后的愈伤组织转移到1/2MS附加NAAlmg/L，KTlmg/L(或ZT 5mg/L)的分化筛选培养基，筛 选剂甘露糖(西亚试剂中国)的浓度为10g/L，24-26°C光照培养。待愈伤组织分化小苗后转移到1/2MS无激素的生长筛选培养基上，筛选剂甘露糖 的浓度为10g/L，24-26°C光照培养。如果转化苗数量较多，可再筛选一次。经过2-3次筛选的转化小苗转移到V2MS附加IAAO. 5mg/L (生兴中国)和MET (多 效矬)(生兴中国)的壮苗培养基上壮苗，待苗高7-8cm且根系发达的转化苗准备移栽。为了提高移栽成活率，小麦组培苗移栽需要一个低温保湿阶段，先把小苗移栽在 纸营养钵中，放在光照培养箱或可控温室中，温度控制在15°C左右，覆盖塑料布保湿，注意 适当通气以免长霉，还苗后移到温室。实施例9HpaG1(1_42转基因小麦和转空载体转基因系产量比较各采集成熟的小麦种子1000粒，比较其重量，重复5次，发现HpaG1Q_42转基因小麦 千粒重高于空载体转基因系10%。实施例10HpaG1(1_42转基因小麦和空载体转基因系抗赤霉病比较用接种针挑去赤霉菌菌丝少许，置于绿豆汤培养液中25-28°C振荡培养4-7天 检测浓度。取少量孢子悬浮液于一无菌瓶中，将赤霉孢子的浓度用无菌水调节到10(目 镜)X20(物镜)的视野下20-30个孢子左右为宜。在小麦齐穗期至始花期，选择尚未开花 的麦穗，使用配好的孢子液，针注接种。21天后计算病粒数。发现HpaG1(l_42转基因小麦较空 载体转基因系具有明显少的病粒数。
权利要求
核苷酸序列为SEQ ID NO.1的水稻细条斑病菌HpaGxooc基因片段hpaG28 126在导入植物获得抗虫害胁迫的品种中的应用。
2.—种权利要求1所述的基因hpaG28_126编码的水稻细条斑病菌HpaGx。。。蛋白片段 HpaG1(1_42在植物抗虫害胁迫中的应用，其氨基酸序列为SEQ ID NO. 2。
3.一种重组表达载体，其特征在于该重组表达载体由SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列 与44P启动子联合形成表达组合和hyg基因被替换为manA基因的pCAMBIA1300载体组成。
4.权利要求3所述的重组表达载体在提高转基因农作物抗病性和/或产量和/或抗虫 害胁迫中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于所述的农作物为小麦。
6.权利要求3所述的重组表达载体在提高转基因农作物抗病性中的应用。
7.权利要求3所述的重组表达载体在提高转基因农作物抗病性和产量中的应用。全文摘要
本发明属于分子生物学领域，公开了水稻细条斑病菌HpaGxooc基因片段hpaG28-126的应用。本发明提供了水稻细条斑病菌HpaGxooc基因片段hpaG28-126在导入植物获得抗虫害胁迫的品种中的应用。以及该基因编码的水稻细条斑病菌HpaGxooc蛋白片段HpaG10-42在植物抗虫害胁迫中的应用。本发明还提供一种重组表达载体，该重组表达载体由hpaG28-126基因片段与44P启动子联合形成表达组合和hyg基因被替换为manA基因的pCAMBIA1300载体组成。该重组载体能够明显提高小麦的产量，增强小麦的抗病能力。
文档编号A01H5/00GK101974540SQ201010528319
公开日2011年2月16日 申请日期2010年11月2日 优先权日2010年11月2日
发明者刘昌来, 李小杰, 王颖, 董汉松, 蔡洪生, 邹保红, 钱君, 陈蕾, 龙菊英 申请人:南京农业大学