专利名称：一种大别山冬青离体快繁的方法
技术领域：
本发明涉及大别山冬青1# (Ilex dabieshanensis K Yao.et M.P.Deng.)组织培养繁殖
方法，属于木本植物种苗繁殖的技术领域。
背景技术：
大别山冬青(Ilexdabieshanensis K Yao.et M.P.Deng.)属冬青科(Aquifoliaceae)冬 青属(Ilex)植物。常绿小乔木，高约5米，全株无毛，树皮灰白色，平滑；小枝暗红色， 具棱角，叶革质，卵状长圆形、卵形或椭圆形，先端急尖呈刺尖状，基部近圆形，边缘 稍反卷，具4-8对刺齿，上面深绿色，具光泽，花期3-4月，果期10-11月，核果近圆球 形至椭圆形，成熟时鲜红色。耐修剪；喜光耐半阴，抗寒耐旱；土壤要求不高，在酸性 及含腐殖质多的土壤中生长茂盛，要求肥沃，湿润而排水好；喜温暖湿润气候，年平均 温度16°C为宜，能耐最高温度为39°C，较耐寒，_8°C也不受冻害，花期遇低温会影响开 花授粉和花的发育。大别山冬青1#为江苏省中国科学院自主选育出的优良品种，该树种适宜于庭园 绿化，观赏，四季常青，叶色青翠，果实红艳，耐热、耐旱，适宜于庭院、草坪孤植， 绿篱建植，高速公路两旁绿化，是国内外都深受人们喜欢的优良常绿阔叶树种之一，也 是制作盆景的好材料，是近年开发的新、优园林绿化树种之一，有广阔的应用前景。目前该品种种苗数量在国内非常少，相关研究表明大别山冬青1#的种子繁殖和 扦插繁殖还未突破，因此大别山冬青1#资源非常缺乏，且应用也是“有市无货”。木本植物组织培养研究起步于20世纪50年代初，直到70年代后期才得到较大 的发展。目前，不完全统计有90多属300多种木本植物经组织培养获得再生植株。而 关于冬青属植物组织培养的研究，国内外报道很少。近5年，仅见有报道对冬青(Ilex chinensis Sims)(见温州农业科技，2007年第4期，冬青的组织培养与快速繁殖技术)、和 美洲冬青[Ilex verticillata(Linn.) A.Gray](见植物生理学通讯，2007年第2期，美洲冬青的 组织培养与快速繁殖)进行组织培养，而关于大别山冬青1#的离体快繁研究尚未见有报 道。综上所述，采取组织培养繁殖大别山冬青1#是解决大别山冬青1#资源短缺的重 要途径之一，对大别山冬青1#的开发和推广利用都具有着非常重要的意义。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是公开大别山冬青1#的组织培养繁殖方法。为解决该技术采用如下的技术方案A)外植体消毒；B)芽的分化诱导取消毒后的外植体切割为1.0-1.5cm长的茎段，其中每 个茎段带一个腋芽，将茎段接种于诱导培养基中进行芽的分化诱导，控制培养温度在 20-26首先在黑暗中培养20-26h，然后进行正常培养25-35天，所述正常培养为光照时间10-16h/天，光照强度为1600-2000Ix ；C)继代培养与增殖将步骤B)中所 得大别山冬青1#嫩梢切割后接入继代培 养基中进行继代培养25-35天，培养温度20-26°C，光照时间10_16h/天，光照强度为 1600-2000Ix ；D)根的诱导将步骤C)所得大别山冬青1#试管苗接入生根培养基中进行生根 培养10-15天，培养温度20-26°C，光照时间10-16h/天，光照强度为1600-2000Ix。外植体可选择大别山冬青1#的一年生扦插苗当年生枝条上带腋芽的茎段；步骤 A)中的外植体消毒过程为用清水冲洗干净，然后用洗衣粉漂洗一次，用84消毒液摇床 上振荡消毒15_20min，流水冲洗20_30min后，于无菌操作台上用75%乙醇消毒50_60s， 立即倒入0.1%的升汞消毒lOmin，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3_5min。步骤B)和步骤C)中可采用MS基本培养基添加激素细胞分裂素、植物生 长素和赤霉素等三类激素，其中步骤B)中采用的诱导培养基为MS+6-BA0.5mg/ L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L,步骤 C)中采用的继代培养基为 MS+6-BA0.3mg/L+IBA 0.02mg/L+GA30.3mg/L ；步骤 D)中可采用的生根培养基为 l/2MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.4mg/L ；同时步骤B)、C)、D)中采用的培养基中还可添加 琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l，同时控制培养基pH为5.8-6.0。本发明相对现有技术的有益效果为采用组织培养的方法对大别山冬青1#进行 繁殖，能够有效的得到大量的大别山冬青1#无菌苗，解决大别山冬青1#资源短缺的问 题；通过对外植体、诱导培养基、继代培养基及生根培养基的选取，能够使得萌发率达 IlJ 70-90%,增殖率达到5-8倍，生根率达到95-100%，能够高效的得到大别山冬青1# 无菌苗。
具体实施例方式实施例一1、选取50株茁壮的大别山冬青1#一年生扦插苗。剪取当年生嫩梢部分，去除 叶片，以茎段为外植体，每茎段带一腋芽，长约2cm。将外植体用清水冲洗干净，然后 用洗衣粉漂洗一次，用84消毒液摇床上振荡消毒15min。流水冲洗20min后，于无菌操作 台上用75%乙醇消毒50s，立即倒入0.1%的升汞消毒lOmin，最后用无菌水洗涤4次，每 次振荡3min。将消毒灭菌过的外植体两端分别切除0.5cm，以去除受伤部分。接入诱导 培养基 MS+6-BA0.5mg/L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L 中。每瓶接 3 株， 共接入50瓶。在温度24°C，光照时间IOh/天，光强20001x的条件下，进行培养。2、外植体接入培养基7d后，腋芽开始萌动。至30d时，污染10株，萌发率达 75%,共获得105株不带根的初代无菌苗。无菌苗株高约4cm，每株茎上带有已萌动的 腋芽3至6个。将叶片去除，主干切为带芽茎段，每段带一个腋芽，共得420段。接入 继代增殖培养基MS+6-BA0.3mg/L+IBA 0.02mg/L+GA30.3mg/L中，培养条件同上。培 养15d后，腋芽开始陆续出梢，30d后，增殖率达到8.6倍，即每株继代苗上平均含有8.6 个腋芽，共得到腋芽3612个。3、将第1次继代增殖得到的继代无菌苗切为带2个或3个腋芽的茎段，得到茎 段1204段。进行第2次继代，IOd后腋芽开始出梢，30d后得到平均带有8个腋芽的无菌苗1150株(其余20株污染，34株未萌动)。重复进行第3次继代，得到茎段3070段， 30d后获得平均带有6个腋芽的继代无菌苗约3000株(其余20株污染，50株未萌动)。4、将经过3次继代的无菌苗切成带2个或3个腋芽的小段，接入生根壮苗培养 基l/2MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.4mg/L，共接入6000株，培养条件同上。培养IOd后， 开始生根，15d后生根率达100%，至此获得带根无菌苗6000株。以上培养基中还添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l，同时控制培养基pH为5.8-6.0。实施例二 1、选取30株茁壮的大别山冬青1#一年生扦插苗。剪取地上部分，去除叶片， 以茎段为外植体，每茎段带一腋芽，长约2cm。将外植体用清水冲洗干净，然后用洗衣 粉漂洗一次，用84消毒液摇床上振荡消毒18min。流水冲洗25min后，于无菌操作台上 用75%乙醇消毒55s，立即倒入0.1%的升汞消毒lOmin，最后用无菌水洗涤4次，每次振 荡4min。将消毒灭菌过的外植体两端分别切除0.5cm，以去除受伤部分。接入诱导培养 基 MS+6-BA0.5mg/L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L 中。每瓶接 3 株，共接 入50瓶。在温度25°C，光照时间16h/天，光强16001x的条件下，进行培养。2、外植体接入培养基9d后，腋芽开始萌动。至35d时，污染20株，萌发率达 80%,共获得104株不带根的初代无菌苗。无菌苗平均株高4.5cm，每株茎上带有已萌动 的腋芽3至6个。将叶片去除，主干切为带芽茎段，每段带一个腋芽，共得到茎段420 段。接入继代增殖培养基MS+6-BA0.3mg/L+IBA 0.02mg/L+GA30.3mg/L中，培养条件 同上。培养IOd后，腋芽开始陆续出梢，30d后，增殖率达到7.2倍，即每株继代苗上平 均含有7.2个腋芽，共得腋芽3024个。3、将第1次继代增殖得到的继代无菌苗切为带2个或3个腋芽的茎段，得到茎 段1008段。进行第2次继代，IOd后腋芽开始出梢，30d后得到平均带有8个腋芽的无 菌苗968株(其余10株污染，30株未萌动)。重复进行第3次继代，得到茎段2581段， 30d后获得平均带有6个腋芽的继代无菌苗约2500株(其余11株污染，71株未萌动)。4、将经过3次继代的无菌苗切成带2个或3个腋芽的小段，接入生根壮苗培养 基l/2MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.4mg/L，共接入5000株，培养条件同上。培养IOd后开 始生根，15d后生根率达97%。至此获得含根无菌苗4850株。以上培养基中还添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l，同时控制培养基pH为5.8-6.0。实施例三1、选取40株茁壮的大别山冬青1#一年生扦插苗。剪取地上部分，去除叶片， 以茎段为外植体，每茎段带一腋芽，长约2cm。将外植体用清水冲洗干净，然后用洗衣 粉漂洗一次，用84消毒液摇床上振荡消毒20min。流水冲洗30min后，于无菌操作台上 用75%乙醇消毒60s，立即倒入0.1%的升汞消毒lOmin，最后用无菌水洗涤4次，每次振 荡5min。将消毒灭菌过的外植体两端分别切除0.5cm，以去除受伤部分。接入诱导培养 基 MS+6-BA0.5mg/L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L 中。每瓶接 3 株，共接 入50瓶。在温度26°C，光照时间16h/天，光强16001x的条件下，进行培养。2、外植体接入培养基IOd后，腋芽开始萌动。至35d时，污染10株，萌发率 达87.10%，共获得122株不带根的初代无菌苗。无菌苗平均株高4.5cm，每株茎上带有 已萌动的腋芽3至6个。将叶片去除，主干切为带芽茎段，每段带一个腋芽，共得茎段488 段。接入继代增殖培养基 MS+6-BA0.3mg/L+IBA 0.02mg/L+GA30.3mg/L 中，培养
条件同上。培养13d后，腋芽开始陆续出梢，30d后增殖率达到5.3倍，即每株继代苗平均含有5.3个腋芽，共得腋芽2585个。3、将第1次继代增殖得到的继代无菌苗切为带2个或3个腋芽的茎段，得到茎 段861段。进行第2次继代，5d后腋芽开始出梢，30d后得到平均带有8个腋芽的无菌 苗800株(其余61株未萌动)。重复进行第3次继代，得到茎段2133段，30d后获得平 均带有6个腋芽的继代无菌苗约2100株(其余33株未萌动)。4、将经过3次继代的无菌苗切成带3个腋芽的小段，接入生根壮苗培养基 l/2MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.4mg/L,共接入4200株，培养条件同上。培养IOd后开始 生根，15d后生根率达95%。至此获得含根无菌苗3990株。以上培养基中还添加琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l，同时控制培养基pH为5.8-6.0。
权利要求
1.大别山冬青1#组织培养繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤A)外植体消毒；B)芽的分化诱导取消毒后的外植体切割为1.0-1.5cm长的茎段，其中每个茎段带 一个腋芽，将茎段接种于诱导培养基中进行芽的分化诱导，控制培养温度在20-26°C， 首先在黑暗中培养20-26h，然后进行正常培养25-35天，所述正常培养为光照时间 10-16h/ 天，光照强度为 1600-2000Ix ；C)继代培养与增殖将步骤B)中所得大别山冬青1#嫩梢切割后接入继代培养 基中进行继代培养25-35天，培养温度20-26°C，光照时间10_16h/天，光照强度为 1600-2000Ix ；D)根的诱导将步骤C)所得大别山冬青1#试管苗接入生根培养基中进行生根培养 10-15天，培养温度20-26°C，光照时间10-16h/天，光照强度为1600-2000Ix。
2.根据权利要求1所述的大别山冬青1#组织培养繁殖方法，其特征在于，步骤A)中 的外植体选取大别山冬青1#的一年生扦插苗。
3.根据权利要求1或2所述的大别山冬青1#组织培养繁殖方法，其特征在于，步骤 A)中的外植体消毒过程为用清水冲洗干净，然后用洗衣粉漂洗一次，用84消毒液摇床 上振荡消毒15_20min，流水冲洗20_30min后，于无菌操作台上用75%乙醇消毒50_60s， 立即倒入0.1%的升汞消毒lOmin，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3_5min。
4.根据权利要求1所述的大别山冬青1#组织培养繁殖方法，其特征在于，步骤B)中 采用的诱导培养基为MS+6-BA0.5mg/L+KT0.05mg/L+NAA0.05mg/L+GA30.1mg/L。
5.根据权利要求1所述的大别山冬青1#组织培养繁殖方法，其特征在于，步骤C)中 采用的继代培养基为MS+6-BA0.3mg/L+IBA0.02mg/L+GA30.3mg/L。
6.根据权利要求1所述的大别山冬青1#组织培养繁殖方法，其特征在于，步骤D)中 采用的生根培养基为l/2MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.4mg/L。
7.根据权利要求4至6中任何一项所述的大别山冬青1#组织培养繁殖方法，其特征 在于，所述的培养基中还含有琼脂6.5g/l，蔗糖30g/l，培养基pH为5.8-6.0。
全文摘要
本发明提供了大别山冬青(Ilex dabieshanensis K Yao.et M.P.Deng.)组织培养繁殖方法，包括以下步骤首先进行外植体消毒，消毒后接种于诱导培养基中进行芽的分化诱导，控制培养温度在20-26℃，先在黑暗中培养20-26h，然后在光照时间10-16h/天、光照强度为1600-2000Ix下进行正常培养25-35天，接着将所得大别山冬青嫩梢切割后接入继代培养基中进行继代培养25-35天，最后将大别山冬青无菌苗接入生根培养基中进行生根培养10-15天，培养温度20-26℃，光照时间10-16h/天，光照强度为1600-2000Ix。通过该方法能够有效的解决大别山冬青快速推广的问题。
文档编号A01H4/00GK102017896SQ201010543619
公开日2011年4月20日 申请日期2010年11月15日 优先权日2010年11月15日
发明者李乃伟, 李云龙, 郭忠仁, 陆小清 申请人:江苏省·中国科学院植物研究所