专利名称：雌核发育鲤鱼的培育方法
技术领域：
本发明涉及一种鱼类的培育方法，尤其涉及一种雌核发育鱼的培育方法。
背景技术：
人工雌核发育技术被用于快速构建鱼类纯系，有非常明显的效果；同时，在鱼 类性别决定、基因图谱的建立等领域也有着重要的意义和价值。一般雌核发育鱼的培育 是采用鱼类单倍体卵子经遗传物质灭活的精子激活，再经过染色体的加倍处理，形成主 要依靠卵子的遗传物质来发育的二倍体后代。用来激活卵子的精子，一般是异源精子， 虽然经过灭活处理，但是存在“异精效应”。这种“异精效应”对雌核发育后代可能产 生遗传改良的作用。另外，利用冷休克的方法进行雌核发育，使卵子经历了冷休克的过 程，该过程能够淘汰体质弱胚胎，而筛选出具有生命力强的存活后代。鲤鱼(CyprinuscarpioL.，2n = 100)属于鲤科、鲤亚科、鲤属，是我国淡水鱼类 中品种最多、分布最广、产量最高的鱼类之一。团头鲂(Megalobrama amblycephala，2n =48)属于鲤科、舶亚科，其生长速度快，肉质细嫩。如何利用团头鲂使鲤鱼在体型和 肉质方面得到改良，并且保证较高的存活率，是值得我们研究的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种后代性状优良、存 活率高、遗传稳定、对生物学遗传育种研究具有重要意义的雌核发育鲤鱼的培育方法。为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种雌核发育鲤鱼的培育方 法，其步骤为以雄性团头鲂和雌性普通鲤鱼作为父、母本亲鱼进行人工催产，然后将 经过紫外线灭活的团头鲂精子与普通鲤鱼的成熟卵子混合，经lmin 2min激活后，将被 激活的卵子置于0°C 4°C温度条件下冷休克处理30min 40min，再将冷休克处理后得 到的胚胎置于20°C 21°C水温下孵化，获得二倍体雌核发育鲤鱼。上述的雌核发育鲤鱼的培育方法中，所述人工催产的具体方法优选为在繁殖 季节，对所述用作父、母亲鱼的团头鲂和普通鲤鱼进行注射，先对所述普通鲤鱼注射绒 毛膜促性腺激素和促黄体素释放激素类似物，绒毛膜促性腺激素的用量为800IU/kg 1000IU/kg,促黄体素释放激素类似物的用量为20 u g/kg 30 i! g/kg ； 3h 4h后再对所 述团头鲂注射绒毛膜促性腺激素和促黄体素释放激素类似物，注射剂量相比普通鲤鱼减 半；注射后按1 (1 1.5)的数量比将所述父、母亲鱼放入同一产卵池中进行催产。上述的雌核发育鲤鱼的培育方法中，所述紫外线灭活的具体方法优选为先对 所述人工催产后的团头鲂进行挤压，挤出的团头鲂精子用Hank’ s液按1 4的体积比稀 释，然后以薄层形式平铺在4°C预冷的培养皿中，然后将培养皿置于垫有冰袋的摇床上， 并用紫外灯在距离10cm 12cm处进行照射处理；在照射15min后，每隔2min沾取少量 精液涂于载玻片上，用水激活，于显微镜下镜检判断其活性，当90%的精子只能原地转 圈时停止照射，得到紫外线灭活的团头鲂精子。该优选的紫外线灭活的具体方法中，所述 Hank，s 液的配方优选为KC10.40g、NaCl 8.00g、NaHCO3 0.35g、KH2PO4 0.06g、 Na2HPO4 · 7H20 0.09g、Na2HPO4 · 12H200.10g、MgSO4 · 7H20 0.10g、MgCl2 · 6H20 0.10g、CaCl2 0.14g、Glucose 1.OOg ；加蒸馏水配至 1L。本发 明创新性地选用团头鲂精子作为刺激源通过冷休克处理来人工诱导雌核发 育鲤鱼，因为团头鲂具有体背高、肉质好的特点，通过团头鲂的“异精效应”可以使得 雌核发育鲤鱼在体背、肉质等方面得到遗传改良；通过冷休克处理，可以筛选到生命力 强的雌核发育鲤鱼，达到提纯复壮的目的。另外，根据鲤鱼卵子质量发育较好的特点， 本发明适当延长冷休克处理的时间，提高了染色体加倍的效率，从而也提高了雌核发育 鲤鱼的存活率。同时，本发明中二倍体雌核发育鱼较易与远缘杂交后代及单倍体后代在 外形、染色体等方面区分开来，有利于筛选出二倍体雌核发育鲤鱼。与现有技术相比，本发明的优点在于本发明获得的雌核发育鲤鱼不仅肉质得 到改良、体背增高，而且在鱼类遗传育种和生物进化方面具有重要意义。本发明方法用 与鲤鱼亲缘关系较远的团头鲂精子诱导鲤鱼卵子进行雌核发育，显著提高了人工雌核发 育的成功率和雌核发育后代的鉴定效率，表明用亲缘关系较远的灭活精子作为诱导源能 显著提高人工雌核发育鱼的存活率，获得的大量雌核发育鲤鱼。此外，本发明的培育方 法在生物进化研究和鱼类遗传育种方面也具有重要的生物学意义。
图1为本发明具体实施方式
中母本鲤鱼、父本团头鲂精子及正常形态雌核发育 鲤鱼苗的DNA含量峰值分析图；在该图中，X轴代表DNA含量的数量级，y轴代表测定 的细胞数，每一峰值代表一群DNA含量相同的细胞，其中的A图表示母本鲤鱼的DNA 含量峰值分析图；B图为刺激源团头鲂精子的DNA含量峰值分析图；C图为正常形态雌 核发育鲤鱼苗的DNA含量峰值分析图。图2为本发明具体实施方式
中制备的雌核发育鲤鱼成鱼的外形图。图3为本发明具体实施方式
中雌核发育鲤鱼染色体数目及性腺结构比较图；其 中，A图为雌核发育鲤鱼染色体中期分裂相(2η = 100) ； B图为雌核发育鲤鱼的性腺结 构(正常II期卵巢)。图4为本发明具体实施方式
中微卫星引物MFW4扩增的普通鲤鱼、雌核发育鲤 鱼图谱；其中A图为普通鲤鱼的电泳图谱，B图为雌核发育鲤鱼的电泳图谱；第一泳道 为 pBR322 marker。
具体实施例方式以下结合说明书附图和具体实施方式
对本发明作进一步描述。一种本发明的雌核发育鲤鱼的培育方法，具体包括以下步骤1.在繁殖期前2 3个月挑选性成熟特征明显、体型好、体色鲜艳、体质健壮、 无病无伤的雌性鲤鱼和雄性团头鲂个体作为亲鱼进行专池精养，合理投喂饲料，促进亲 鱼性腺良好发育。2.到了繁殖季节，挑选体征良好、性腺发育成熟的上述亲鱼注射绒毛膜促性腺 激素(HCG)与黄体素释放激素类似物(LRHA)的混合液，以进行人工催产。先注射雌性鲤鱼，注射雌性鲤鱼时HCG的用量为800IU/kg 1000IU/kg、LRH-A的用量为20 u g/ kg 30 y g/kg ； 3h 4h后再注射雄性团头鲂，剂量减半；注射后按1 (1 1.5)的 数量比将雌雄鱼放入同一圆形产卵池中，水面吊一纱窗网片，以检测亲鱼的发情产卵情 况；注射时均采用胸鳍基部凹陷无鳞处腹腔一次性注射的方法，以减少实验操作对亲鱼 的损害，提高亲鱼的产后存活率。当发现亲鱼在产卵池中呈“螺旋状”追逐、且纱窗网 片上沾有适量卵粒后，开始拉网打捞亲鱼并进行检测(注意要用软质网，操作要轻，水 中检测)；按一对一配对原则挑选2 3组催产效果良好的亲鱼进行后续的雌核发育鲤鱼 的诱导培育。3.对上述挑选出的亲鱼进行人工干法授精，先将挤出的团头鲂精子用Hank’ s 液按1 4的体积比稀释，以1mm薄层分布在培养皿中，然后将培养皿置于垫有冰袋的 摇床上，并用紫外灯在距离10cm 12cm处照射处理28min 32min (视精子活力情况而 定)。在照射15min后，每隔2min用牙签沾取少量精液于载玻片上，用水激活，于显微 镜下镜检判断其活性，当90%的精子只能原地转圈，活力明显丧失时停止照射。马上将 灭活的精子与雌性鲤鱼的成熟卵子混合，并用干净羽毛充分搅拌，再把卵子平铺到盛有 清水的培养皿中，lmin 2min后，将卵子置于0 4°C温度条件下冷休克处理30min 40min,冷休克处理得到的胚胎在20°C 21°C水温下孵化，获得二倍体雌核发育鲤鱼。Hank，s 液配方如下KC1 0.40g、NaCl 8.00g、NaHC03 0.35g、KH2P04 0.06g、 Na2HP04 7H200.09g、Na2HP04 12H20 0.10g、MgS04 7H20 0.10g、MgCl2 6H20 0.10g、CaCl20.14g、Glucosel.OOg ；加蒸馏水配至 1L。上述鲤鱼卵子在雌核发育过程中，胚胎的受精率为73% 76%，孵化率为 38% 41%，13% 14%的胚胎能存活到第一次开口摄食。作为对照组的用紫外灭活的 鲤鱼精子刺激鲤鱼卵子雌核发育，胚胎的受精率为69% 70%，孵化率为11% 12%，
8 % 9 %的胚胎能存活到第一次开口摄食。取母本鲤鱼和雄性团头鲂各1条以及获得的正常形态鱼苗10尾，用流式细胞 仪(PartecGmbH)检测其DNA含量；具体操作如下1)母本鲤鱼上机样品制备于尾 静脉取血，稀释成一定浓度，放入细胞核提取液(Partec)中约lOmin 15min，经过滤 器(Partec)过滤，用DNA染色液(Partec)染色约5ml 10ml ； 2)团头鲂精液上机样品 制备轻挤雄性团头鲂腹部，可见白色精液流出；取少量精液，稀释，经过滤器过滤， 用DNA染色液染色约5ml 10ml ； 3)鱼苗样品上机样品制备剪碎，加生理盐水转入 离心管中吹打，直至成为细胞悬液。经过滤器过滤，用DNA染色液染色样品约5ml 10ml。以母本鲤鱼体细胞DNA含量作为对照，各样品单独上机测定，分别测量团头鲂精 子、正常形态的鱼苗DNA含量，检测结果如图1所示。由图1的A图可见，母本鲤鱼的 平均相对DNA含量为103.09 ；由图1的C图可见，正常形态鱼苗的平均相对DNA含量 为102.12，是母本鲤鱼的1倍左右(P> 0.05)，这充分证明本发明方法培育出的是加倍成 功后的雌核发育鲤鱼；由图1的B图可见，团头鲂精子的平均相对DNA含量为34.59， 流式结果说明其只是起到了一个刺激鲤鱼卵子发育的作用。将上述检测初证后的雌核发育鲤鱼饲养到成鱼后，比较其外形与其母本普通鲤 鱼的区别，目测发现它们在外部形态方面没有明显的差异。雌核发育鲤鱼有两对口须， 外形保持明显的鲤鱼特征(见图2)。为了减小因鱼体大小不同而造成的误差，在综合分析时我们将传统的可量性状转换成可量比例性状，形态特征对比结果见下表1。表1 雌核发育鲤鱼与亲本的形态特征比较
鱼名体高/体长 口须 侧线鳞式侧线h鳞侧线下鳞背鳍
团头鲂0.43±0.01 无 52 59910 III+8 9
母本鲤鱼0. 35±0. 03 两对 34 385 65 6 III+16-19
雌核发育鲤鱼0.39±0.02 两对 3566 III+18从上表1可以看出，雌核发育鲤鱼体高/体长上有一定程度的增加，体高/体长 为0.39士0.02，介于刺激源团头鲂(0.43士0.01)和母本鲤鱼(0.35士0.03)之间，表现出体 背较普通鲤鱼高的优良特性。再用肾细胞直接制片法对雌核发育鲤鱼的体细胞染色体数目进行抽样检测，肾 细胞分裂中期染色体制备过程为实验鱼在18°C 22°C水温下培育Id 3d后，注射植 物血凝素(PHA) 1 3次，每次剂量为2 8 μ g/g体重，间隔时间为12h 24h，在解 剖取材前2h 6h，注射秋水仙素，注射剂量为2 4yg/g体重；解剖取出肾组织，在 生理盐水下研磨，20°C下用0.075mol/L的KCl溶液低渗处理40min 60min ；然后用冰 醋酸甲醇混合液(体积比1 3)固定肾细胞1 3次；冰冻载玻片滴片。显微镜下观 察染色体的形态和数目，统计其染色体数分布情况。由图3中的A图可见，用团头鲂精 子诱导的雌核发育鲤鱼为二倍体(2η= 100)，检查连续两年内得到的所有雌核发育鲤鱼 后代，无一尾鱼能挤出精液。随机解剖六月龄雌核发育鲤鱼后，肉眼可观察到粉红色性 腺；取性腺的组织学切片观察发现雌核发育鲤鱼性腺结构与母本鲤鱼相似，处于II期 卵巢，其中均勻分布许多II时相的卵母细胞，发育正常(参见图3中的B图)。切片时 采用的石蜡切片方法为取六月龄的雌核发育鲤鱼卵巢，在Bouin’ s液中固定3 7天 后，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，连续切片厚度为7μιη，H-E染色，中性树 胶封片，Olympus显微镜下观察，拍照。采用微卫星技术，对雌核发育鲤鱼和普通鲤鱼的遗传纯度进行检测。采用 Crooijmans等分离的普通鲤鱼的微卫星DNA引物及鲁翠云等分离的鳙鱼微卫星DNA引 物，分别为MFWl、MFW4、MFW7、MFWl 1、MFW14、MFW16、MFW24、MFW29、 MFW30、hljy2526和hljy3940 (见下表2)。PCR扩增反应总体积为20 μ 1，内含约 20ng 40ng 模板 DNA、0.25ymol/L 正、反向引物，0.6UTaq 酶，0.8 μ mol/L MgCl2, 0.05mmol/L dNTP和1 X Taq反应缓冲液。PCR反应程序94°C预变性5min ； 94°C变性 30s,退火30s (各对引物的特异退火温度见表2)，72°C延伸45s，35个循环；72°C终延伸 IOmin0表2: 10对微卫星 引物的序列、特异退火温度及等位基因范围引物引物序列(5’ -3’ ) 退火温度(°C) 等位基因范围(bp)
MFW1FGTCCAGACTGTCATCAGGAG GAGGTGTACACTGAGTCACGC62166"-220MFW4FTCCAAGTCAGTTTAATCACCG GGGAAGCGTTGACAACAAGC60135"-191MFW7FTACTTTGCTCAGGACGGATGC ATCACCTGCACATGGCCACTC64176"-240MFW11FGCAGTTTGCCTTGATGGTTGTG TCGTCTGGTTTAGAGTGCTGC60133"-196MFW14FCAGAAGCTTCTGGAAATCTGAG GCGAGAAGATTGATGGACAAC58100"-178MFW16FGTCCATTGTGTCAAGATAGAG TCTTCATTTCAGGCTGCAAAG64132"-158MFW24FGCTCCAGATTGCACATTATAG CTACACACACGCAGAGCCTTTC58200"-282MFW29FGTTGACCAAGAAACCAACATGC GAAGCTTTGCTCTAATCCACG64148"-182hljy2526FAACAGCCACATAACCAAT AGATAGCCGTTGTCATTC52156"-242hljy3940FGAACGCTCTACGGAATGG TCCTGTTACACTATCTGGGT50202"-219扩增产物用8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，电泳缓冲液为1XTBE，电压 280V，电泳3h左右。用0.5%的冰醋酸固定3min ； 2%的硝酸银染色5min ；双蒸去水漂 洗两次，第一次20s，第二次2min; 0.54%甲醛显影约5min ；最后用预冷的0.5%冰醋酸 终止反应。显色后用GDS7500凝胶成像分析系统进行扫描，并用GelWorkslD软件(3.0 版本)对每组微卫星引物所扩增出的DNA分子量大小进行估算。分析结果显示，所采 用的10对微卫星引物均能在普通鲤鱼、雌核发育鲤鱼中稳定重复地扩增出相应的PCR产 物，从带型来看，普通鲤鱼多样性较雌核发育鲤鱼丰富(参见图4中的A图和B图)。根 据扩增结果，计算了普通鲤鱼、雌核发育鲤鱼两个群体内的遗传相似系数，雌核发育鲤 鱼个体之间的遗传相似系数为(S = 0.9275)，普通鲤鱼的遗传相似系数为(S = 0.4466)， 说明经过一代的雌核发育，遗传纯度大大提高，已基本达到建立纯系的目的。任意两个个体间的遗传相似系数按照Nei等提出的相似率公式计算Sxy = 2Nxy/(Nx+Ny),其中，Nxy表示个体x和y之间共有的DNA扩增片段的数目，Nx和 Ny分别为个体x和个体y的DNA扩增片段的数目。群体内的遗传相似系数(S)是群体 内所有的两个个体间相似系数的平均值。<110>湖南师范大学<120>雌核发育鲤鱼的培育方法<140>201010547063.0<141>2010-11-16
<160>10<210>1<211>41bp<212>DNA<213>人工序列<400>1gtccagactg tcatcaggag gaggtgtaca ctgagtcacg c41<210>2<211>41bp<212>DNA<213>人工序列<400>2tccaagtcag tttaatcacc ggggaagcgt tgacaacaag c41<210>3<211>42bp<212>DNA<213>人工序列<400>3tactttgctc aggacggatg catcacctgc acatggccac tc42<210>4<211>43bp<212>DNA<213>人工序列<400>4gcagtttgcc ttgatggttg tgtcgtctgg tttagagtgc tgc43<210>5<211>43bp<212>DNA<213>人工序列<400>5cagaagcttc tggaaatctg aggcgagaag attgatggac aac43<210>6<211>42bp<212>DNA<213>人工序列<400>6gtccattgtg tcaagataga gtcttcattt caggctgcaa ag42
<210>7<211>43bp
<212>DNA<213>人工序列<400>7gctccagatt gcacattata gctacacaca cgcagagcct ttc 43<210>8<211>43bp<212>DNA<213>人工序列<400>8gttgaccaag aaaccaacat gcgaagcttt gctctaatcc acg 43<210>9<211>36bp<212>DNA<213>人工序列<400>9aacagccaca taaccaatag atagccgttg tcattc36<210>10<211>38bp<212>DNA<213>人工序列<400>10gaacgctcta cggaatggtc ctgttacact atctgggt 38
权利要求
1.一种雌核发育鲤鱼的培育方法，其步骤为以雄性团头鲂和雌性普通鲤鱼作为 父、母本亲鱼进行人工催产，然后将经过紫外线灭活的团头鲂精子与普通鲤鱼的成熟卵 子混合，经Imin 2min激活后，将被激活的卵子置于0°C 4°C温度条件下冷休克处理 30min 40min，再将冷休克处理后得到的胚胎置于20°C 21°C水温下孵化，获得二倍体 雌核发育鲤鱼。
2.根据权利要求1所述的雌核发育鲤鱼的培育方法，其特征在于，所述人工催产的具 体方法为在繁殖季节，对所述用作父、母亲鱼的团头鲂和普通鲤鱼进行注射，先对所 述普通鲤鱼注射绒毛膜促性腺激素和促黄体素释放激素类似物，绒毛膜促性腺激素的用 量为800IU/kg 1000IU/kg，促黄体素释放激素类似物的用量为20 μ g/kg 30 μ g/kg ； 3h 4h后再对所述团头鲂注射绒毛膜促性腺激素和促黄体素释放激素类似物，注射剂量 相比普通鲤鱼减半；注射后按1 (1 1.5)的数量比将所述父、母亲鱼放入同一产卵池 中进行催产。
3.根据权利要求1或2所述的雌核发育鲤鱼的培育方法，其特征在于，所述紫外 线灭活的具体方法为先对所述人工催产后的团头鲂进行挤压，挤出的团头鲂精子用 Hank’ s液按1 4的体积比稀释，然后以薄层形式平铺在4°C预冷的培养皿中，然后将 培养皿置于垫有冰袋的摇床上，并用紫外灯在距离IOcm 12cm处进行照射处理；在照 射15min后，每隔2min沾取少量精液涂于载玻片上，用水激活，于显微镜下镜检判断其 活性，当90%的精子只能原地转圈时停止照射，得到紫外线灭活的团头鲂精子。
4.根据权利要求3所述的雌核发育鲤鱼的培育方法，其特征在于，所述Hank’s液 的配方为KCl 0.40g、NaCl 8.00g、NaHC030.35g、KH2PO40.06g, Na2HPO4 · 7H20 0.09g、Na2HPO4 · 12H200.10g、MgSO4 · 7H20 0.10g、MgCl2 · 6H20 0.10g、 CaCl20.14g、Glucose 1.OOg ；加蒸馏水配至 1L。
全文摘要
本发明涉及雌核发育鱼的培育，具体公开了一种雌核发育鲤鱼的培育方法，其步骤为以雄性团头鲂和雌性普通鲤鱼作为父、母本亲鱼进行人工催产，然后将经过紫外线灭活的团头鲂精子与普通鲤鱼的成熟卵子混合，经1min～2min激活后，将被激活的卵子置于0℃～4℃温度条件下冷休克处理30min～40min，再将冷休克处理后得到的胚胎置于20℃～21℃水温下孵化，获得二倍体雌核发育鲤鱼。本发明方法培育的雌核发育鲤鱼后代性状优良、存活率高、遗传稳定，对生物学遗传育种研究具有重要意义。
文档编号A01K61/00GK102007879SQ20101054706
公开日2011年4月13日 申请日期2010年11月16日 优先权日2010年11月16日
发明者刘少军, 刘筠, 张纯, 罗凯坤, 肖俊, 肖军, 赵如榕, 邹拓谜, 陶敏 申请人:湖南师范大学