使禾本科植物的雄性不育得以恢复的方法和雄性不育恢复剂的制作方法

专利名称：使禾本科植物的雄性不育得以恢复的方法和雄性不育恢复剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及使发生了雄性不育的植物、例如禾本科植物、特别是麦类植物的不育性得以恢复的方法及使麦类的不育性得以恢复的组合物。本发明特别涉及使由于高温或低温应激而发生了雄性不育的植物、例如禾本科植物、特别是麦类植物的不育性得以恢复的方法和组合物。
背景技术：
对于禾本科植物的小麦、大麦等麦类而言，由于地球规模的温暖化或由异常气候所导致的气温上升而发生花粉形成过程不全，从而导致世界范围内的谷物产量的减少。另外，对水稻而言，正如所知的东北地区的冷害，以约10年1次的频率发生的所谓“山背风”所导致的异常低温使花粉形成过程不全，从而使收获大幅度降低。东北地区的水稻的低温损害(冷害)是在孕穗期(花粉母细胞的减数分裂后) 内暴露于最高气温不足20°C的低温应激下数日时，发生花药壁绒毡层细胞(anther wall tapetal cell)的肥大、阻碍花粉形成。花药壁绒毡层细胞是对花粉供给营养、最终注定会因细胞凋亡而降解(collapse)的细胞。另一方面，与水稻相反，小麦或大麦等麦类植物对高温应激的敏感性高，在昼30°C 夜25°C (特别是夜间25°C以上的条件)的高温条件下，花药壁细胞以及花粉母细胞的细胞分裂停止，该高温条件持续4天以上时，则已经完全陷入不能恢复的状况，发生花药壁绒毡层细胞的早期降解。其结果，无法形成正常的花粉而发生花粉不育(雄性不育)，最终导致种子育性的降低。这些细胞分裂的停止或早期降解仅在花药中观察得到，对雌蕊、 叶、茎等的生育并无影响，仅在雄性的花粉形成中观察得到(Mkata等，Journal of Plant Research (2000) 113,395-402 ；Abiko φ, Sexual Plant Reproduction (2005) 18, 91-100)。通过利用DNA微阵列的详尽的表达分析可知在这种高温损害时发生大规模的基因表达的变化。其中，生长素抑制蛋白基因(auxin repressed protein genes)的表达在幼穗的高温损害时被诱导，该生长素抑制蛋白基因是其基因表达受到生长素抑制的基因 (Oshino 等，Molecular Genetics and Genomics (2007) 278, 31-42) 即，考察了作为植物激素之一的、在细胞的分裂或成长、发育和分化中起重要作用的生长素在高温条件下花药特异性的表达存在降低的可能性。已知，特别是在5叶期开始时放置于上述那样的高温环境时，绒毡层细胞和花粉母细胞的发育和分化停止，在之后所形成的花药中未能形成花粉 (Oshino 等，Molecular Genetics and Genomics (2007)278，31-42)。为了解决这些问题，正在通过利用以往的育种或基因重组技术制备重组体等来开发对高温或低温应激显示耐性的品种。生长素主要是促进植物生长的植物激素的总称，已知有天然生长素和合成生长素。作为天然生长素，已知有3-吲哚乙酸(IAA)、吲哚丁酸(IBA)；作为合成生长素，已知有4-氯吲哚乙酸、苯乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸Q，4-D)、α-萘乙酸(NAA)、2，6_ 二氯苯甲酸、吲哚丁酸(IBA)、4-氯苯氧乙酸、5-氯吲唑乙酸乙酯、萘氧乙酸和2，4，5_三氯苯氧乙酸等。这些生长素作为生长调节剂被利用，在实验室环境下被用于组织培养等，在田地中2， 4-D等作为除草剂被利用。现有技术文献非专利文献非专禾Ij 文献 1 :Tadashi Sakara 等，Journal of Plant Research(2000) 113, 395-402非专利文献2 :Mafumi Abiko 等，Sexual Plant Reproduction (2005) 18,91-100非专禾U 文献 3 =Takeshi Oshino 等，Molecular Genetics and Genomics(2007)278, 31-4
发明内容
发明要解决的问题本发明提供用于使禾本科植物的雄性不育、特别是高温或低温应激所导致的雄性不育得以恢复的方法以及用于使禾本科植物的雄性不育、特别是高温或低温应激所导致的雄性不育得以恢复的组合物。用于解决问题的方案本发明为以生长素为有效成分的、发生了雄性不育的禾本科植物特别是麦类植物用的育性恢复剂，以及包括将生长素散布于植物中的步骤的、发生了雄性不育的禾本科植物特别是麦类植物的育性恢复方法。更具体地说，本发明如下所述。(1)发生了雄性不育的禾本科植物用育性恢复剂，其用于以10_4M 10_7M(M 摩尔浓度)的生长素浓度散布到禾本科植物上。(2)根据(1)所述的育性恢复剂，其用于在最迟幼穗期的第5叶展开日或至其之前为止的期间内散布至少1次。(3)根据(1)所述的育性恢复剂，其用于在能够预测从第5叶展开日起连续3天以上夜间气温为25°C以上时，在至第5叶展开日的前1天为止散布至少1次。(4)根据(1)所述的育性恢复剂，其用于在从第5叶展开日起至5天后的期间内散布至少1次。(5)根据⑴ (4)中任一项所述的育性恢复剂，其中，生长素为3-吲哚乙酸 (IAA)、4-氯吲哚乙酸、苯乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、α -萘乙酸(NAA)、2，6_ 二氯苯甲酸、吲哚丁酸(IBA)、4_氯苯氧乙酸、5-氯吲唑乙酸乙酯、萘氧乙酸或2，4，5-三氯苯氧乙酸。(6) 一种使发生了雄性不育的禾本科植物的雄性不育得以恢复的方法，其包括以下步骤以10_% KTfiM的生长素浓度将生长素散布到麦类上。(7)根据(6)所述的方法，其在最迟幼穗期的第5叶展开日或至其之前为止的期间内散布至少1次生长素。(8)根据(6)所述的方法，其在能够预测从第5叶展开日起连续3天以上夜间气温为25°C以上时，在至第5叶展开日的前1天为止散布至少1次生长素。
(9)根据(6)所述的方法，其用于在从第5叶展开日起至5天后的期间内散布至少 1次生长素。(10)根据(6) (9)中任一项所述的方法，其中，生长素为3-吲哚乙酸(IAA)、 4-氯吲哚乙酸、苯乙酸、2，4_ 二氯苯氧乙酸Q，4-D)、α-萘乙酸(NAA)、2，6_ 二氯苯甲酸、 吲哚丁酸(IBA)、4_氯苯氧乙酸、5-氯吲唑乙酸乙酯、萘氧乙酸或2，4，5-三氯苯氧乙酸。本发明中，禾本科植物包含水稻、麦类植物。麦类植物包含大麦属、小麦属、黑麦属和燕麦属植物。另外，本发明为以阻碍生长素作用的物质为有效成分的、发生了雄性不育的水稻用育性恢复剂，以及以阻碍生长素作用的物质为有效成分的、使发生了雄性不育的水稻的育性得以恢复的方法。作为阻碍生长素作用的物质，包含氨氧基乙酸(AOA)、L-α-(2-氨基乙氧基乙烯基)甘氨酸(AVG)、对氯苯氧基异丁酸(PCIB)、三碘乙酸(TIBA)和萘基酞氨酸 (Naphthylphthalamic Acid NPA)。本说明书中雄性不育的“育性恢复”是指抑制植物中花粉形成过程不全、使形成正常花粉的能力得以恢复。发明的效果通过本发明可以简单地恢复由于高温或低温而导致雄性不育的禾本科植物特别是麦类植物和水稻的育性。基于本方法能够通过生长素水溶液的适当散布而完全地回避由于高温损害所导致的毁灭性雄性不育(花粉形成不全)所造成的种子生产的损害。


图1表示拟南芥的生长素应答性融合基因DR5-GUS在适温栽培条件下的花的发育过程中的表达。可观察到表达在花药的发育时期最强。图2表示拟南芥的生长素应答性融合基因DR5-GUS由于高温所导致的表达变化。 随着时间的经过，在花药中可观察到显著的GUS活性的降低和雌蕊或花瓣中的GUS活性诱导。㈧对照(适温栽培)、⑶高温处理第1天、(C)高温处理第5天、⑶高温处理第7 天图3表示大麦的生殖生长过程中可观察到的幼穗的发育。(A)表示高温处理时期。(B)表示幼穗的发育时期。在第5叶展开期可观察到雄蕊的原基(sp)和原基(ρρ)。 此时期，高温损害最易发生。图4表示在大麦的雄蕊发育过程中可观察到的高温损害。高温处理从幼穗达到 2 3mm的第5叶展开期起进行至幼穗为IOmm左右为止。(A)表示高温处理的时期与幼穗长度的对应。(B)表示对照区和高温处理区(发生雄性不育)的花粉母细胞的减数分裂和绒毡层细胞的降解。CIO、C15、C20分别为对照区的幼穗长度10mm、15mm、20mm时期的雄蕊显微镜照片。H10、H15和H20分别为高温实验区的幼穗长度10mm、15mm、20mm时期的雄蕊显微镜照片。图5表示从大麦第5叶展开期起在昼30°C夜25°C的高温下暴露5天、之后恢复至通常的昼20°C夜15°C继续生长时所观察到的未发育的花药和彻底的花粉形成不全。(A)表示对照个体(适温栽培)的出穗期的雄蕊和雌蕊以及花药内的花粉。(B)表示高温处理个体的出穗期的异常雄蕊和雌蕊以及花药内的花粉粒形成的缺乏。
图 6 表示利用实时 RT-PCR 法对 DNA 微阵列 22K Barleyl GeneChip (Affymetrix 公司制)上的Contig 7516_at的生长素抑制蛋白基因(auxin-impressed protein gene) 在各幼穗长度下的基因表达水平的相对比进行定量化的结果。纵轴表示生长素抑制蛋白基因(auxin-r印re ssed protein gene)的相对表达量，横轴表示幼穗长度。空心柱表示对照区(适温栽培)，黑色柱表示高温处理区。“发芽”表示使用播种后第5天的个体、进行了 5天的同样高温处理的地上部分中的同一基因由于高温处理所导致的表达变化。图7表示大麦第5叶展开期的高温处理时期。将各浓度的生长素水溶液以每盆G 个体)25ml散布于植物体。散布在播种后第18天、19天、21天和23天进行。图8表示生长素水溶液的散布所导致的出穗期的花药长度的恢复。虚线表示对照区(适温栽培)，实线表示高温处理区。图9表示生长素水溶液的散布所导致的出穗期的雄蕊和雌蕊的形态以及花粉育性的恢复的例子。(A)对照区(适温栽培)的个体、(B)高温处理区的个体、(C)高温处理和散布了各浓度生长素的实验区的个体。图10表示通过散布生长素来恢复种子育性的例子。对于对照区(适温栽培)和高温处理区的个体分别散布的生长素(NAA)。左边的2个照片表示利用生长素的高温处理区个体的种子育性的恢复。
具体实施例方式适于应用本发明的植物是由于高温或低温应激而导致生长素水平大幅变化、而生长素水平较大影响花粉形成过程的植物。这种植物包括禾本科植物、特别是包含大麦属植物(大麦等)、小麦属植物(面包小麦(bread wheat)、硬粒小麦(durum wheat)、密穗小麦 (club wheat)、斯卑尔脱小麦(spelt wheat)、二粒小麦(emmer wheat)等)、黑麦属植物 (黑麦等)和燕麦属植物(皮燕麦(Avena sativa)、燕麦(oats)、野燕麦(Avena fatua) 等)的麦类植物以及水稻。一般来说，在包括麦类植物的单子叶植物和双子叶植物中，在花药的初期发育过程中可观察到较高的生长素活性，但由于高温其活性显著降低。其结果认为，高温导致生长素缺乏、使花粉母细胞以及花药壁细胞的细胞分裂停止以及发生早期降解，最终导致花粉不育、种子育性降低。另一方面，水稻的低温损害认为通常随着花药成熟而应该减少的生长素信号由于低温而不会减少，其结果阻碍了花药壁绒毡层细胞的降解，从而发生雄性不育。因而，在小麦、大麦等麦类植物的花药的发育和分化过程中发生高温应激时，通过人为地散布具有生长素作用的物质，补偿被预计为由于高温应激而导致的花药特异性生长素的缺乏，使花粉母细胞以及花药壁细胞的细胞分裂、发育分化正常地进行，从而可以恢复发生了雄性不育的麦类植物的育性。另一方面，当水稻的花药在发育分化过程中暴露于低温应激的情况下，通过给予水稻阻碍生长素作用的物质，补偿被预计为由于低温应激而导致的花药特异性的生长素作用的过剩，使花药壁细胞的降解正常地进行，其结果可以从雄性不育中得以恢复。本说明书中，将具有与作为天然生长素的3-吲哚乙酸同样作用的物质总称作“生长素”或“具有生长素作用的物质”。本发明中使用的生长素可以是天然生长素也可以是合成生长素。本说明书中，天然生长素包括3-吲哚乙酸(IAA)，合成生长素包括4-氯吲哚乙酸、苯乙酸、2，4_ 二氯苯氧乙酸Q，4-D)、α-萘乙酸(NAA)、2，6-二氯苯甲酸、吲哚丁酸 (IBA)、4_氯苯氧乙酸、5-氯吲唑乙酸乙酯、萘氧乙酸和2，4，5-三氯苯氧乙酸。本发明中可使用的生长素并无特别限定，可使用所有的天然生长素和合成生长素。当担心散布于植物中的生长素的微量残留的影响时，从安全性和被消费者接纳评价的观点出发，相比较于虽然廉价但稳定而难以分解的人工生长素2，4-D，更优选利用分解更快的天然ΙΑΑ。另外，本发明中使用的阻碍生长素作用的物质包括氨氧基乙酸(AOA)、 L-α-(2-氨基乙氧基乙烯基)甘氨酸(AVG)、对氯苯氧异丁酸(PCIB)、三碘乙酸(TIBA)和萘基酞氨酸(NPA)。本发明中可利用的植物是容易因高温或低温而导致雄性不育的植物、特别是因高温应激可发生雄性不育的植物。这种植物除了禾本科植物、特别是麦类植物之外，还包括禾本科玉米属(例如玉米)、茄科茄属(例如番茄、茄子、辣椒、青椒和红辣椒)、豆科豇豆属 (例如小豆和豇豆)、十字花科芸苔属(例如油菜子)的植物。特别适合利用本发明使雄性不育得以恢复的植物是禾本科植物。禾本科植物包括水稻、麦类植物。麦类植物包括大麦属、小麦属、黑麦属和燕麦属植物。大麦属植物包括大麦，小麦属植物包含面包小麦、硬粒小麦、密穗小麦、斯卑尔脱小麦和二粒小麦，黑麦属植物包含黑麦，燕麦属植物包含皮燕麦、燕麦和野燕麦。作为向麦类植物给予生长素或阻碍生长素作用的物质的方法，优选这些物质的水溶液或使用了对植物体有害性低的溶剂的这些物质的溶液向植物体的散布，例如向叶和茎的整个地上部分或部分地上部分的散布。散布优选通过喷雾(喷雾)进行。另外，还可以在幼穗所处的叶柄或茎的部分涂布生长素。在大麦或水稻的情况下，由于在用于散布生长素的适当的时期幼穗还没有出穗，因而无法直接散布于幼穗，但当在适当时期幼穗露出时， 也可直接将生长素散布或涂布在该幼穗上。进而，特别是双子叶植物的情况下，也可以将生长素直接散布或涂布在露出至外部的花序或花芽上。通过本发明，为了使禾本科植物、特别是麦类的育性得以恢复而给予生长素时，生长素的浓度优选为IO-4M 10、、更优选为IO-4M ΙΟΙ、特别优选为IO-5M ΙΟ—Μ。特别是为麦类以外的单子叶植物时，更优选为 10_7M、特别优选为IOl 10、。双子叶植物相比较于单子叶植物而言，对生长素的敏感性通常更高，因而更优选为1(ΤΜ 10_8M、 特别优选为KTfiM 1(ΓΜ。散布的生长素浓度过高时，在植物体内发生生长素诱导性的乙烯合成，作为其作用可能会导致老化或成长阻害。因而，当散布的生长素浓度较高时，还可添加显示该诱导性乙烯合成的阻害效果的氨氧基乙酸(AOA)或L-α-(2-氨基乙氧基乙烯基)甘氨酸(AVG)。由此，可以减轻由于生长素诱导性的乙烯合成所导致的副作用。根据情况，为了提高本发明的育性恢复剂在植物体上的铺展性，还可在本发明的育性恢复剂中添加表面活性剂。或者，根据本发明，在向禾本科植物给予生长素时也可根据需要添加表面活性剂例如Tween20。表面活性剂的浓度优选为约0. (ν/ν) 0按照本发明向禾本科植物给予生长素时，优选在生长素水平可影响花粉形成的时期进行。给予生长素的优选时期一般来说是从雄蕊的分化开始时期或者茎顶开始分化成幼穗的时期(大约第4叶展开期)至花粉母细胞的减数分裂结束(大约第6叶展开期)和孢子期的期间。更准确地说，例如对于各植物种或植物品种而言，制备在生长素应答性的转录活化序列DR5上融合有β-葡萄糖苷酸酶基因(GUQ的重组植物，研究该重组植物的雄蕊、特别是花药的GUS活性的经时变化，从而可以明确给予生长素的优选时期。花药的GUS活性显著上升或减少的时期可以说是应该给予生长素的适当时期。对于雄蕊的分化开始时期未知的植物而言，也可如上所述决定给予生长素的优选时期。重组植物体的制备对于各植物种而言，可以根据公知的方法进行。另外，还可使用抗生长素抗体，在组织学或生化学上直接测定花药内的生长素水平。对于各植物种或植物品种而言，也可同样地研究最佳的生长素浓度。更具体地说，例如在大麦或小麦等麦类植物的情况下，优选在幼穗期的第5叶展开日或至其之前为止的期间内给予至少1次本发明的育性恢复剂或根据本发明的生长素。 特别是，夜间气温高于白天气温易于导致麦类植物的花粉不育性。因而，当能够预测到从第 5叶展开日起连续有3天以上夜间气温为25°C以上时，特别优选在至第5叶展开的前1天为止给予至少1次本发明的育性恢复剂或根据本发明的生长素。而且，优选在从第5叶展开日起至5天后的期间内给予至少1次本发明的育性恢复剂或根据本发明的生长素，例如优选在第5叶展开日或至其之前为止向禾本科植物给予至少1次、进而在至5天后的期间内向禾本科植物给予数次，但使用生物降解性快的生长素(例如IAA)时，也可进行连日散布。另外，对于温度以及浓度的适用范围在各个植物种中各自不同，因而在栽培各个植物种或植物品种的条件下预料到高温损害的发生时，如上所述，优选对于各植物种或植物品种以预先决定的最佳浓度进行利用。水稻的低温损害是在孕穗期(花粉母细胞的减数分裂刚结束)在最高气温不足 20°C的低温应激中暴露数日所产生的，因而当能够在花粉母细胞的减数分裂刚结束的时期预料到低温时，散布阻碍生长素活性的物质是有效的。另外，处理浓度按照使用了各物质的已知的能发挥生理效应的范围内的使用方法来确定。实施例11.花药特异性的生长素表达和发育特异性的生长素表达使用作为模型植物之一的拟南芥，解析花药特异性的生长素表达、发育时期特异性的生长素表达和高温条件下的花药特异性的生长素降低。实验中，引入了在生长素应答性的转录活性序列DR5上融合有β -葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的融合基因的拟南芥使用重组体(Plant Cell 9，1963-1971，1997)。该植株对生长素应答并表达融合基因DR5-β-葡萄糖苷酸酶。予以说明，本植株购自Tom Guilfoyle 氏(University of Missouri, Columbia)。在直径8公分的盆中播种约10 20粒的DR5-GUS株系的拟南芥，通过23°C下的孵育进行培育，约4周开始形成花芽。对该花芽进行采样，用丙酮处理后，以2mM的浓度使 β-葡萄糖苷酸酶的底物即X-Gluc发挥作用，检测表达β-葡萄糖苷酸酶(Gus)的细胞。 在23°C的条件下，在花粉的减数分裂期前后至小胞子期的期间，在花药壁绒毡层细胞和花粉母细胞中观察到很强的GUS的表达(染色成蓝绿色)(图1)。之后，随着从花药壁绒毡层细胞的降解时期起的花粉形成的进行，GUS表达降低、在成熟花粉中完全地消失(图1)。即， 花药中的生长素水平显示出在花药的发育时期最强、花药壁绒毡层细胞消失而花粉成熟的过程中逐渐降低这样的发育时期特异性的动态变化。作为高温处理将具有在23°C下生长的花芽的植物体移至31°C的孵箱中经时地进行GUS表达。在高温处理1天后的花芽中，花药壁绒毡层细胞和花粉母细胞的信号显著变弱(图2-B)。当进行高温处理5天、7天时，花药的⑶S信号完全消失(图2-C、图2-D)。而且，这些结果是与大麦同样地产生由于花粉形成不全所导致的雄性不育。另一方面可确认在雌蕊或花瓣等其他的组织中⑶S的表达信号在高温下有所增加(图幻。到目前为止已报道了在发芽等营养生长组织中高温会增加生长素的表达信号； 在雌蕊或花瓣中的表达增加在这方面是一致的，但认为在雄蕊的花药的发育分化过程中， 高温造成完全相反的影响是由于高温损害在雄蕊中易于显著地发生。2.大麦中由于高温应激所导致的雄性不育实验所使用的大麦是作为二棱大麦的栽培品种的二棱大麦(Hordeum vulagare L. cv Haruna-nijo)。将4°C避光下保存的种子在25°C避光下催芽48小时，将10粒发芽的种子以圆形播种于装有1升园艺用育苗培土(全农KUREHA培土 氮0. 4g kg—1、磷酸1. 9g kg—1、钾0.6g kg-1、镁0.2g kg-1)的直径Ilcm的圆形盆中。利用人工气象器(artificial climate chamber)(株式会社日本医科器械制作所BI0TR0N LH300RDS)在昼温20°C、夜温 15°C、日长16小时的条件下对它们进行培育。作为光源使用20根植物培育用荧光灯(16 根，National FL40S FR-P ；4 根，National FL20S FR-P)。以播种当日为第 0 天，从第 5 叶出现的播种后第18 19天开始，在昼温30°C、夜温25°C、日长16小时的高温条件下进行培育，进行5天(120小时)的高温处理。在经过5天的播种后第23 M天，返回至昼温 20°C、夜温15°C的栽培条件，停止高温处理，继续栽培直至之后的出穗、种子成熟。对大麦而言，在第5叶展开的时期，幼穗长度为2 3mm，各颖花(glumous flower) 中，雄蕊以及雌蕊的原基进行发育分化，之后生殖生长连续地进行(图3、4)。从该第5叶展开起的5天内，幼穗达到IOmm左右，完成由含绒毡层细胞的4层构成的花药壁细胞，开始进入花粉母细胞的减数分裂。之后，在15mm的幼穗长度下，花粉母细胞开始减数分裂，在20mm 的幼穗长度下，形成花粉孢子，同时进行花药壁绒毡层细胞的降解。从上述的IOmm左右达到20mm的幼穗需要5天。另一方面，在从第5叶展开的时期开始的5天内的高温处理区中，幼穗长度的伸长与对照区相比有相同或者进一步被促进的倾向，在花药壁细胞以及花粉母细胞中，细胞分裂早期停止，进而，在IOmm的幼穗长度下，花粉母细胞开始未成熟状况下的减数分裂，最终花粉孢子也退化(图4)。在此高温条件下，含雌蕊的其他组织或器官的发育分化未发生异常，其结果，在开花期形成完全没有花粉的花药，但雌蕊具有育性，从而发生完全的雄性不育(花粉不良) (图 5)。在这些幼穗中观察到基因生长素抑制蛋白基因(auxin repressed protein genes)的表达在高温条件下与对照区相比显著地提高(图6)。即，强烈暗示着与拟南芥同样，在高温条件下大麦中的生长素也降低。3.利用生长素处理使由于高温应激所导致的雄性不育得以恢复在确认生长素效果的实验中，除了使用上述园艺用育苗培土之外，为了使生长素水溶液的处理的控制更容易，将2个长方形的种植箱(60mmX60mmX IOOmrn(长X宽X 高)、AGC TECHNOGLASS CO. , LTD.种植箱(型号CUL-JAR300))叠置成上下两段，在上段侧的底部中央开一个直径Icm左右的孔，通入打结的长度6cm的酒精灯芯，在其上填塞蛭石(NITTAI. Co. , Ltd.农业园艺用蛭石)300ml。在下段的箱中放入ΗΥΡ0ΝΕΧ 0. 2% (ν/ν)(HYPONeX JAPAN CORP.，LTD.)，作为植物的营养水源。将4°C避光下保存的种子在25°C避光下催芽48小时，将发芽的春性二棱大麦以每盆4粒播种于上段容器的4个角落。利用人工气象器(Nippon Medical & Chemical Instruments Co.，Ltd.，BIOTRON LH300RD S)在昼温20°C、夜温15°C、日长16小时的条件下对它们进行培育。作为光源使用20根植物培育用荧光灯(16 根，National FL40S FR-P，4 根，National FL20S FR-P)。在该栽培法中，与使用培养土的情况同样，以播种当日为第0天时，第5叶出现并开始展开的时间是播种后的第18 19天。从播种后第19天开始，在昼温30°C、夜温25°C、 日长16小时的高温条件下进行栽培，进行5天(120小时)的高温处理，之后(播种后第M 天)返回至通常的昼温20°C、夜温15°C、日长16小时的条件。分别使用3-吲哚乙酸(IAA 和光纯药工业(株)制造编码094-00183)、1-萘乙酸(NAA 和光纯药工业(株)制造编码148-00092)、2，4-二氯苯氧乙酸Q，4_D 和光纯药工业(株)制造编码040-1853 ，最初用二甲基亚砜(DMS0:和光纯药工业(株)制造编码043-07216)分别调整成10_3M、10_2M、IO4M的储备溶液，在使用之前于_20°C避光下保存。 在要散布这些储备液之前进行解冻，用蒸馏水分别稀释至1000倍，调整成10_6M、10_5M、10_4M 三个等级，作为生长素水溶液使用。此时，以0.1% (ν/ν)的浓度添加作为表面活性剂的属于Tween20的药品(聚氧乙烯00)山梨糖醇酐单月桂酸酯(相当于ICI公司商标Tween20 的产品)和光纯药工业(株)制造编码167-1151 。作为生长素处理区的比较对照区，制备DMSO和表面活性剂分别为0.1% (ν/ν)浓度的混合液，散布到植物体上。在植物体上的散布在用蒸馏水将上述储备液稀释后的30分钟内实施。生长素水溶液在植物体上的散布共计进行4次，即播种开始后的第18天(高温处理前日)、第19天(高温处理前)、第21天(高温处理期间)、第23天(高温处理期间) (图7)。高温处理期间中的生长素水溶液的散布如下进行迅速将植物体取出人工气象器之外，在10分钟以内对地上部分的叶或茎的整体大致均勻地进行喷雾散布，迅速送回至人工气象器内。散布的生长素水溶液的量为每1盆25ml (每个大麦个体约6ml)。从播种的第33 40天出穗的大麦的穗中各采集3粒开花受粉前的颖花。将它们用FAA固定液(甲醛5%、乙酸5%、乙醇45%、H2045% )在4°C避光下固定M小时，最终浸泡于0. IM磷酸缓冲液(pH7.2)中，在4°C下保存。利用实体显微镜(0L YMPUS SZX12)从固定的颖花中解剖雄蕊以及雌蕊，利用显微镜照相机(0L YMPUS DP70)进行数码照片拍摄。各个花药长度以数码图像为基础，使用图像处理软件的Image J(花药大小的测定由美国国立卫生研究所免费公开)进行测定。对于各生长素的各浓度，对3个个体的9粒(每1个个体为3粒)种子进行观察，测定各个种子内存在的3个花药的大小，求得其平均值及标准误差(每个浓度处理区测定约27个花药。为了调查花粉的成熟度，使用碘化钾染色液(MERCK公司制卢戈氏溶液(Lugol' s solution) (产品编号109261))对每一个浓度处理区的3个花药进行染色，进行利用显微镜(0L YMPUS BX51)的花粉观察和利用显微镜照相机(0L YMPUS DP70)的数码照片拍摄。大麦出穗期的正常花药长度为3mm左右，在实验对照区中即便散布10_6M、10_5M、 10_4M的IAA、2，4-D、NAA的任一种生长素，也基本未见变化。另外，花粉也正常地形成。但是，在的2，4-D处理区中，叶子在早期开始枯萎，对植物体而言，产生了生长素所导致的负面影响。
高温处理区中，作为生长素效果的比较对照，在仅散布使DMSO和表面活性剂分别为0.1% (ν/ν)浓度的混合液、水时，出穗期的花药伸长被显著地抑制，花药长度仅伸长至 1.5mm左右(图8)，而且内部完全没有观察到正常的花粉粒的形成(图9B)，与未散布任何东西的情况同样，没有获得恢复效果。在散布KT6M的IAA、2，4-D或NAA时，花药长度伸长至1. 8mm 2mm左右，在散布IOl和1(Γ4Μ的生长素水溶液时，花药长度均伸长至2. 5mm左右，说明即使在高温条件下也能显著地恢复(图8)。另外，通过10、、1(ΤΜ、10_4Μ的任一种生长素处理使花药长度得以恢复的花药内被碘化钾染色液染成黑紫色，可确认形成了充分蓄积淀粉的正常的成熟花粉(图9C)。如上所述，在高温处理样品中，在的2，4-D处理区中，叶在早期开始枯萎，对植物体而言，产生了生长素所导致的负面影响，但IAA以及NAA 即便是10_4Μ也基本未观察到副作用。大麦在自然界中基本是自花受粉，结果在高温处理区中虽然可观察到出穗，但未发生受粉，没有结出种子(图10)。另一方面，在此次的花粉育性得以恢复的任一生长素处理区(除了早期枯萎的10_4M 2，4-D处理区之外)中，在高温下也结出种子，在IOl的任一生长素下各穗均结出了 30% 80%左右的种子，在处理区的任一生长素下各穗均结出了 70% 85%左右的种子，在IO-4M IAA以及NAA处理区中各穗均结出了 90%左右的种子，可确认种子育性得以恢复(图10)。另外，即便使生长素的散布为最初的1次时，也可观察到显著的育性恢复效果，同时在使用园艺培养土的栽培中，完全同样地确认到利用生长素处理能够回避高温损害。
权利要求
1.一种育性恢复剂，其用于发生了雄性不育的禾本科植物，该育性恢复剂以生长素为有效成分。
2.根据权利要求1所述的育性恢复剂，其用于以10_4M 10_7M的生长素浓度散布到禾本科植物上。
3.根据权利要求1或2所述的育性恢复剂，其用于在最迟幼穗期的第5叶展开日或至其之前为止的期间内散布至少1次。
4.根据权利要求1或2所述的育性恢复剂，其用于在能够预测从第5叶展开日起连续 3天以上夜间气温为25°C以上时，在至第5叶展开日的前1天为止散布至少1次。
5.根据权利要求1或2所述的育性恢复剂，其用于在从第5叶展开日起至5天后的期间内散布至少1次。
6.根据权利要求1 5中任一项所述的育性恢复剂，其中，生长素为3-吲哚乙酸 (IAA)、4_氯吲哚乙酸、苯乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、a-萘乙酸(NAA)、2，6-二氯苯甲酸、吲哚丁酸(IBA)、4_氯苯氧乙酸、5-氯吲唑乙酸乙酯、萘氧乙酸或2，4，5-三氯苯氧乙酸。
7.根据权利要求1 6中任一项所述的育性恢复剂，其中，禾木科植物为麦类植物。
8.根据权利要求7所述的育性恢复剂，其中，麦类植物为大麦属、小麦属、黑麦属或燕麦属植物。
9.一种使发生了雄性不育的禾本科植物的雄性不育得以恢复的方法，其包括以下步骤以10_4M 10_7M的生长素浓度将生长素散布到禾本科植物上。
10.根据权利要求9所述的方法，其在最迟幼穗期的第5叶展开日或至其之前为止的期间内散布至少1次生长素。
11.根据权利要求9所述的方法，其在能够预测从第5叶展开日起连续3天以上夜间气温为25°C以上时，在至第5叶展开日的前1天为止散布至少1次生长素。
12.根据权利要求9所述的方法，其用于在从第5叶展开日起至5天后的期间内散布至少1次生长素。
13.根据权利要求9 12中任一项所述的方法，其中，生长素为3-吲哚乙酸(IAA)、 4-氯吲哚乙酸、苯乙酸、2，4_ 二氯苯氧乙酸Q，4-D)、α-萘乙酸(NAA)、2，6_ 二氯苯甲酸、 吲哚丁酸(IBA)、4_氯苯氧乙酸、5-氯吲唑乙酸乙酯、萘氧乙酸或2，4，5-三氯苯氧乙酸。
14.根据权利要求9 13中任一项所述的方法，其中，禾木科植物为麦类植物。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，麦类植物为大麦属、小麦属、黑麦属或燕麦属植物。
全文摘要
本发明提供能够抑制由于高温和低温应激所导致的花粉形成过程不全并恢复花粉育性的方法及组合物。本发明提供以生长素为有效成分的育性恢复剂以及包括散布生长素的步骤的、恢复禾木科植物育性的方法。另外，本发明还提供以阻碍生长素作用的物质为有效成分的育性恢复剂以及包括散布阻碍生长素作用的物质的步骤的、恢复水稻育性的方法。作为生长素，优选10-4M～10-7M的3-吲哚乙酸(IAA)、4-氯吲哚乙酸、苯乙酸、2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、α-萘乙酸(NAA)、2，6-二氯苯甲酸、吲哚丁酸(IBA)、4-氯苯氧乙酸、5-氯吲唑乙酸乙酯、萘氧乙酸或2，4，5-三氯苯氧乙酸。
文档编号A01N63/00GK102348385SQ201080011059
公开日2012年2月8日 申请日期2010年1月7日 优先权日2009年1月8日
发明者东谷笃志, 渡边正夫, 阪田忠 申请人:国立大学法人东北大学