生产在花瓣中含有花翠素的菊花植物的方法

专利名称：生产在花瓣中含有花翠素的菊花植物的方法
技术领域：
本发明涉及使用来自菊花的黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因的转录调控区域生产在花瓣中含有花翠素的菊花植物的方法、该调控区域的核酸、含有该核酸的表达载体或表达盒、及导入了该调控区域的菊花植物或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织、特别是花瓣、切花。
背景技术：
通过利用基因重组技术，使有用的基因在目的植物中表达，可将新的性状赋予该植物。如此制作的基因重组植物已被大范围栽培。基因表达的调控主要在转录阶段进行控制，转录调控在调控基因表达上最为重要。即为制作产业上有用的基因重组植物，在适当时期、用适当组织、以适当强度进行转录非常重要。转录在很多情况下通过位于翻译区域的5’ 侧的DNA序列来控制。将确定基因转录的起始位点，直接调控其频率的DNA上的区域称为启动子。启动子有时存在于起始密码子的5’侧数十bp处，多含有TATA盒等的序列。其还在 5’侧具有结合各种转录调控因子的顺式作用元件，这些顺式作用元件的存在控制着转录的时期、进行转录的组织、转录的强度。转录调控因子根据氨基酸序列的不同分为很多家族。 例如，Myb型转录调控因子、bHLH(碱性/螺旋-环-螺旋(basic helix loop helix))型转录调控因子等有名的家族。实际上，很多情况下，转录控制区域与启动子在同样意义上使用。作为花的颜色的主要成分的花色素苷为总称为类黄酮的次级代谢产物之一。花色素苷的颜色依赖于其结构。即作为花色素苷的发色团的花色素B环的羟基数增加时颜色变蓝。且还已知修饰花色素苷的芳香族酰基(香豆酰基、咖啡酰基等)的数量增加时，花色素苷的颜色变蓝(即最大吸收波长向长波长移动)，花色素苷的稳定性增加(以下参照非专利文献1)。与花色素苷的生物合成有关的酶及编码该酶的基因被广泛研究(参照相同非专利文献1)。例如，催化向花色素苷转移芳香族酰基的反应的酶基因可从龙胆、薰衣草、矮牵牛等中获得(以下参照专利文献1、专利文献2)。与红紫苏叶中积累的花色素苷(丙二酰基紫苏宁、3-0- (6-0- (E) -p-coumaroyl- β -D-glucopyranosyl) -5-0- (6-0-malonyl- β -D-glucopyranosyl)-cyanidin)(以下参照非专利文献幻的合成有关的酶基因以羟基肉桂酰辅酶A 花色素苷3葡萄糖苷-芳香族酰基转移酶(3AT)的基因{以下简称“紫苏花色素苷 3-酰基转移酶(3AT)基因”。}为代表已有报道(参照专利文献1)。而且也获得了关于花色素苷的生物合成酶基因转录控制(调控)的知识和见解。这些基因的位于起始密码子5’ 侧的转录调控区域中，具有Myb型转录调控因子、bHLH型转录调控因子结合的顺式作用元件序列。还已知Myb型转录调控因子和bHLH型转录调控因子控制矮牵牛、玉米、紫苏等的花色素苷的合成(参照非专利文献1)。在植物中负责基因转录的启动子(以下称转录调控区域)中，有无论在何种组织或发育阶段的何种时期均发挥功能的所谓组成型启动子、和仅在特定器官·组织中发挥功能的器官 组织特异性启动子、及仅在发育阶段的特定时期表达的时期特异性启动子。作为使有用基因在基因重组植物中表达的启动子，常用的是组成型启动子。作为代表性的组成型启动子，有花椰菜花叶病毒35S启动子(以后有时记为CaMV35S启动子)、以此为基础构建的启动子(以下参照非专利文献3)、Macl启动子(以下参照非专利文献4)等。但是，在植物中，很多基因均为组织·器官特异性或时期特异性表达。这说明使基因进行组织·器官特异性或时期特异性表达对植物来说是必需的。有利用此种组织 器官特异性或时期特异性的转录调控区域进行植物的基因重组的例子。例如，有使用种子特异性的转录调控区域使蛋白质在种中积累的例子。但是，植物虽可开出多种颜色的花，但由于种所具有的遗传性限制，所以能开出所有颜色的花的种很少。例如，在月季、康乃馨等中，自然界中不存在能开蓝色、紫色花的品种。原因是月季、康乃馨不具有用于合成许多开蓝色、紫色花的种所合成的称为花翠素的花色素时所必需的类黄酮3’，5’_羟化酶基因。通过在这些种中导入作为开蓝色、紫色花的种的矮牵牛、三色堇等的类黄酮3’，5’ -羟化酶基因，可使这些种的花色变蓝。为康乃馨的情况下，为使来自不同种的类黄酮3’，5’ -羟化酶基因转录，使用来自金鱼草或矮牵牛的查耳酮合成酶基因的转录调控区域。例如，作为包含来自金鱼草或矮牵牛的查耳酮合成酶基因的转录调控区域的质粒，可例举以下专利文献3中记载的质粒pCGP485、pCGP653，作为包含组成型转录调控区域的质粒，可例举质粒pCGP6^ (包含Macl启动子)、以下专利文献4中记载的质粒PSPB130 (包含附加有E12增强子的CaMV35S启动子)。但是，很难预测这样的启动子在重组植物中可在何种程度上发挥作用，是否可带来目的表达型。且为使复数的外源基因表达而反复使用相同启动子有时会引起基因的沉默，所以应考虑避免(以下参照非专利文献5)。因此，虽然一些启动子被用于改变花的颜色，但还进一步需要为了改变其他花的颜色而与宿主植物和目的相符合的有用的启动子。特别是菊花植物(也简称“菊花”。)约占日本全国批发价格(农林水产统计平成 19年花卉批发市场调查结果概要)中的30%，与月季约占9%、康乃馨约占7%相比，可见其重要性。菊花中虽有白色 黄色 橙色·红色·粉色·紫红色等的花色，但在已有品种、 近缘野生种中还没有紫色、蓝色等兰色系的花色。因此，蓝色系的育种成为用于唤起新需求的目标之一。菊花的花色通过花色素苷和类胡萝卜素的组合来体现。花色素苷由于作为基本骨架的花色素的结构不同、通过糖、有机酸而进行的修饰的不同等，可出现多种颜色。但是，已知负责菊花花色的花色素苷有花青素的3位被葡萄糖和丙二酸修饰的两种(cyanidin 3-0-(6" -Ο-monomalonyl-β -glucopy ranoside 禾口 cyanidin3_0_ (3 〃 ，6〃 -Ο-dimalonyl-β -glucopyranoside)(以下参照利文献6)。且其结构比较单纯(参照图1)。由此，菊花的花色素苷成为使显色范围极小的主要原因。但是，蓝色系的显色主要由花色素苷形成，但因菊花中不存在编码作为关键的酶类黄酮3’，5’ -羟化酶(F3’ 5’ H)的基因，所以，无法生物合成显蓝色的花翠素系花色素苷 (参照图1)。因此，为了能改变菊花花瓣中积累的花色素苷系色素，培育出具有蓝色系花色的菊花，期望开发出使用基因工程学的方法的菊花的花色素苷表达控制技术。如上所述，菊花在日本是最重要的花卉，但因具有六倍体这样的多倍性，且基因组尺寸大，所以不仅转化效率低，还会引起导入基因的沉默(钝化)，因而不易得到稳定表达导入基因的基因重组菊花。有如下报道，导入连接在CaMV35S启动子上的β -葡萄糖醛酸酶(⑶S)基因的菊花与导入相同基因的烟草相比，⑶S基因的活性为10分之1左右，且在转化后经过12个月以后，在几乎所有的个体中其活性均降低(以下参照非专利文献7)。 虽有报道指出，已得到用于在菊花中使外源基因稳定表达的在菊花中发挥良好功能的叶绿素a/b结合蛋白质的启动子，但该启动子不适合使基因在基本不存在叶绿素的花瓣中表达 (以下参照非专利文献8)。此外，还有如下报道，将连接在烟草的延伸因子(elongation factor) 1 (EF1 α )启动子上的⑶S基因导入菊花时，即使经过20个月以上⑶S基因还会在叶、花瓣中表达(以下参照非专利文献9)。而且，有使突变型乙烯受体基因在菊花中表达从而延长花的寿命的例子(以下参照非专利文献10)，有抑制菊花的AGAM0US基因表达而使花形改变的例子(以下参照非专利文献11)，有使用烟草的乙醇脱氢酶的翻译增强子(专利文献7参照)而提高外源基因在菊花中表达的例子(以下参照非专利文献12)。另一方面，作为通过基因重组改变菊花花色的成功例，有通过共抑制法抑制查耳酮合成酶(CHS)的基因而使粉色变为白色的报道(以下参照非专利文献13)，和通过RNAi 法抑制类胡萝卜素分解酶(CCD4a)的基因而使白色变为黄色的报道(以下参照非专利文献 14)，但其均为通过内源性基因的表达抑制来改变花色，还没有通过外源基因的过表达而改变花色的成功例，也没有实现花色素苷的结构及由其结构而形成的花色变化。通过外源基因过表达而改变花色的尝试，有导入编码用于合成花翠素所需要的酶即F3’ 5’的基因的报道(以下参照专利文献5、非专利文献15)，但还没有因导入的F3’ 5’H 基因的作用而产生的花翠素在舌状花瓣中积累，从而培育出蓝色系菊花的报道。在菊花中， 即使用CaMV35S启动子使F3’5’H表达，也未发现花翠素的产生(参照非专利文献15)。且利用CaMV35S启动子进行表达的基因的表达会随菊花转化体的生长发育而消失等，因而不适合稳定的表达(参照非专利文献7)。作为可使外源基因在菊花的舌状花瓣中高效且稳定地表达的启动子，已开发出马铃薯Lhca3. St. 1启动子(以下参照非专利文献16)、菊花 UEPl启动子(以下参照非专利文献17)、烟草EFl α启动子(以下参照专利文献6、非专利文献9)等。但是，还没有因使用了这些启动子的外源基因的过表达而改变菊花花色的报道。由上所述，为了通过基因重组而培育出改变了花色的菊花，需要确立包括开发适用于菊花的启动子在内的类黄酮生物合成体系基因的表达控制技术。基因的表达主要通过转录调控区域来控制，但也已知有使mRNA的翻译提高的序列。例如，已知来自烟草花叶病毒的Ω序列使与Ω序列连接的异种基因的翻译效率无论在体外(in vitro)还是在体内(in vito)均提高(以下参照非专利文献18)。此外，还已知烟草的乙醇脱氢酶的5，-非翻译区域(NtADH5，UTR)中存在的序列(ADH200)对提高异种基因的表达稳定性起作用(以下参照专利文献7)。而且，还报道了导入在CaMV35S启动子的3’侧连接该序列下游存在的94bp的翻译增强子(参照ADHNF、专利文献8)，进而连接 GUS基因的表达盒时，在菊花中该序列对提高翻译效率起作用(参照非专利文献12)。但是， 还没有使用该序列，而用于改变类黄酮的结构、组成、改变花的颜色的例子。为改变花的颜色，需要在类黄酮、花色素苷主要积累的上皮细胞中使异种基因表达，所以，从现有的结果来看，难于类推出NtADH5，UTR(ADH200、翻译增强子ADHNF)对改变花色是否有效。现有技术文献专利文献
专利文献1 WO 96/25500公报专利文献2 WO 01/72984公报专利文献3 WO 94/28140公报专利文献4 WO 05/17147公报专利文献5美国专利第5948955号公报专利文献6日本特开2004-65096号公报专利文献7美国专利第6573429号公报专利文献8日本特开2003-79372号公报非专利文献非专利文献1 Plant J. 54，737-749，2008非专利文献 2 Agricultural and Biological Chemistry, 53, 797-800,1989非专利文献3 Plant Cell Physiology, 37,49-59,1996非专利文献4 Plant Molecular Biology, 15，373-381，1990非专利文献5 Annals of Botany, 79，3-12，1997非专利文献6 Journal of Horticultural Science&Biotechnology，81,728-734， 2006非专利文献7 Plant Biotechnology，17，241-245，2000非专利文献8 Breeding Science，54，51-58，2004非专利文献 9 Japan Agricultural Research Quarterly, 39 :269-274,2005非专利文献 10 Postharvest Biology and Technology, 37,101-110,2005非专利文献11 Plant Biotechnology, 25 :55-59,2008非专利文献12 Plant Biotechnology, 25 :69-75,2008非专利文献13 Bio/Technology 12 :268,1994非专利文献14 Plant Physiology 142 :1193,2006非专利文献15 J. Plant Biol. ,50 :626,2007非专利文献16 Mol Breed 8 :335,2001非专利文献17 Transgenic Res 11 :437,2002非专利文献18 Nucleic Acids Research，15，3257-3273，198
发明内容
本发明欲解决的课题在于提供使用来自菊花的黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因的转录调控区域生产在花瓣中含有花翠素的菊花植物的方法、及导入了该调控区域的菊花植物或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织、特别是、花瓣、切花。本申请发明人为解决上述课题锐意研究，反复实验，结果发现使用来自菊花的黄烷酮3-羟化酶(F3H)的转录调控区域使类黄酮3’，5’ -羟化酶(F3’ 5’ H)在菊花中表达时，花翠素在花瓣中大量积累，花的颜色发生变化，而且在附加来自烟草的乙醇脱氢酶的翻译增强子时有更多的花翠素积累，花的颜色发生更大的变化，并通过实验确认出其有用性， 从而完成了本申请发明。即本发明如下。
[1] 一种方法，其特征在于，将选自以下⑴ ⑷中的核酸作为转录调控区域使用，以使类黄酮3’，5’ -羟化酶(F3’ 5’ H)在菊花植物中表达，从而生产在其花瓣中含有花翠素的菊花植物(1)核酸，其含有序列号34或序列号87中所示的碱基序列，(2)核酸，其可作为来自菊花的黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因的转录调控区域而发挥功能，且含有通过1个或数个碱基序列发生附加、缺失及/或取代而对序列号34或序列号87中所示的碱基序列进行修饰的碱基序列，(3)核酸，其可作为来自菊花的黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因的转录调控区域而发挥功能，且为可与由序列号34或序列号87中所示的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在高严谨条件下杂交的核酸，及(4)核酸，其可作为来自菊花的黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因的转录调控区域而发挥功能，且为与序列号34或序列号87中所示的碱基序列有至少90%序列同一性的核酸。[2]根据上述[1]中所述的方法，其特征在于，所述类黄酮3’，5’_羟化酶 (F3，5，H)来自风铃草、瓜叶菊(Cineraria)、马鞭草及三色堇#40。[3]根据上述[1]或[2]中所述的方法，其特征在于，不仅使用所述转录调控区域， 还进一步使用来自烟草的乙醇脱氢酶的翻译增强子。[4]根据上述[1] [3]中任一项所述的方法，其特征在于，使用所述翻译增强子与所述F3’ 5’ H基因的起始密码子直接连接的表达载体或表达盒。[5]根据上述[1] W]中任一项所述的方法，其特征在于，所述花瓣中花翠素的含有率为花色素合计量的25质量％以上。[6] 一种菊花植物或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织，其特征在于，含有上述[1]中所述的核酸或通过上述[1] [5]中任一项所述的方法生产。[7]根据上述W]中所述的菊花植物或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织， 其特征在于，其为切花。[8] 一种切花加工品，其特征在于，其使用上述[7]中所述的切花。根据本发明，可知使用来自菊花的黄烷酮3-羟化酶(F3H)的转录调控区域使类黄酮3’，5’ -羟化酶(F3’ 5’ H)在菊花中表达时，与使用其他启动子时相比，花瓣中积累了更多花翠素，花的颜色变得更蓝，而且附加来自烟草的乙醇脱氢酶的翻译增强子时花翠素积累得更多，花的颜色进一步变得更蓝。


图1表示导入了 F3’ 5’ H的转化菊花的类黄酮生物合成途径的示意2表示导入F3’ 5’ H基因用双元载体的示意3表示导入了菊花F3Hpro: ADHNF-风铃草F3，5，H: NOSter的转化个体中花色和花翠素的含有比例图 4 表示 pBI121 菊花 F3Hprolk: ADHNF-风铃草 F3，5，H: NOSter 的构建过程
具体实施例方式本发明涉及包括用以下载体转化菊花的生产(培育)在其花瓣中含有花翠素的菊花植物的方法，其中，该载体含有通过编码菊花(chrysanthemum)的黄烷酮3-羟化酶(F3H) 的基因的5’区域(以下也称为“CmF3Hpr0”、“chrySF3H 5，”。)而使类黄酮3’，5’ -羟化酶(F3’ 5’ H)表达的基因盒。在所述基因盒中，优选含有来自烟草的乙醇脱氢酶的翻译增强子(参照图2(最下))。所述花瓣中的花翠素的含有率优选为花色素合计量的25质量％ 以上，花瓣的颜色向蓝色方向改变。本发明涉及通过该方法生产的或包含CmF3Hpr0的菊花植物或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织。所述部分或组织优选为花瓣、切花。本说明书中，“表达盒”是指在任意核酸上连接有启动子和终止子的DNA片段。根据本发明，通过使F3’ 5’ H基因在菊花的舌状花瓣中表达，合成其酶蛋白质并发挥功能，合成及积累花翠素系花色素苷，即可培育出蓝色系花色的菊花。作为用于使F3’5’H 表达而使用的基因盒中所含有的启动子，使用Rose CHSpro (月季的查耳酮合成酶(CHS) 基因启云力子)、R. rugosa DFRpro (Rosa rugosa Thunb. ex Murray 的二S黄酮醇 4-还原酶 (DFR)基因启动子)、R. rugosa F3Hpro (Rosa rugosa Thunb. ex Murray 的黄烷酮 3-羟化酶 (F3H) ,Viola F3，5，H#40pro (三色堇的F3，5，H基因的启动子)时，虽可确认出花翠素的积累(最高5.4%)(参照表1)，但未使花色达到蓝色系。因此，为了发现用于提高菊花花瓣中花翠素的积累、使花色变为蓝色系的有效的启动子，使用各种启动子反复进行F3’ 5’ H 的表达实验，结果明确了 CmF3Hpr0为有效的启动子。通过使用CmF3Hpr0，与使用其他启动子时相比，花翠素的积累提高(参照表1，平均为31. 4%，最高80. 5% )，进而实现了蓝色系的花色(参照图3、RHS色谱标准79A、77A、72A、72B)。且还发现，在通过CmF3Hpro表达的 F3’ 5’ H基因内，来自风铃草(花翠素的积累率最高81% )、瓜叶菊(也称为Cineraria) (花翠素的积累率最高36% )、马鞭草及三色堇(花翠素的积累率最高27- % )的 F3’5’H具有使菊花的花色变为紫色的能力。而且，通过导入直接连接烟草ADH翻译增强子 (参照专利文献8)的基因盒，使以花翠素为基本骨架的花色素苷在菊花的舌状花中高效积累，从而成功地改变了花色(参照表1、图幻且直接连接是指在1的多核苷酸和其他多核苷酸之间不包含多余的核酸序列的连接。作为本发明中所涉及的转录控制区域，例如可例举由序列号34或序列号87中所示的碱基序列组成的核酸。但是，认为在由序列号34或序列号87中所示的碱基序列组成的核酸中，由数个(1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个)碱基发生附加、缺失及/或取代而进行修饰的碱基序列所组成的启动子也维持与原有启动子同样的活性。因此，本发明所涉及的转录调控区域中，只要作为来自菊花的黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因的转录调控区域发挥功能，也可为由通过1个或数个碱基序列发生附加、缺失及/或取代而对序列号34或序列号 87中所示的碱基序列进行修饰的碱基序列组成的核酸。本发明所涉及的转录调控区域进一步可为如下核酸，作为来自菊花的黄烷酮 3-羟化酶(F3H)基因的转录调控区域而发挥功能且可与序列号34或序列号87中所示的碱基序列在高严谨条件下杂交的核酸，或作为来自菊花的黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因的转录调控区域而发挥功能且与序列号34或序列号87中所示的碱基序列有至少90%序列同一性的核酸。作为这些核酸，可例举为可与含有序列号34或序列号87中所示的碱基序列的多核苷酸在严谨条件下杂交，由与序列号34中所示的碱基序列优选有约70%以上、更优选有约 80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%,96%,97%,98%,最优选有约99%的碱基序列同一性的碱基序列所组成的核酸。在此，严谨条件是指由本领域技术人员很容易确定的杂交条件，通常依赖探针长度、洗涤温度及盐浓度并可凭经验实现。通常，探针越长，用于适合退火的温度越高，探针越短退火温度越低。杂交通常依赖于互补链存在于接近但低于其熔点的环境中时变性DNA 的再退火能力。具体地说，例如作为低严谨条件，可例举在杂交后的筛选的洗涤阶段中，在 37°C 42°C的温度条件下，在5XSSC、0. 1% SDS溶液中洗涤等。此外，作为高严谨条件，例如可例举在洗涤阶段，在65°C、0. IX SSC及0. SDS中洗涤等。通过将严谨条件提高到更高，可得到同源性或同一性高的多核苷酸。在本发明中，所述类黄酮3’，5’ -羟化酶(F3’ 5’ H)优选来自风铃草、瓜叶菊 (Cineraria)、马鞭草及三色堇#40。在本发明中，不仅使用所述转录调控区域，还优选进一步使用来自烟草的乙醇脱氢酶的翻译增强子。此外，优选所述翻译增强子在表达载体的基因盒内与所述F3’ 5’ H基因的起始密码子直接连接。在本发明的方法中，所述花瓣中花翠素的含有率优选为花色素合计量的25质
量％以上。本发明涉及通过本发明的方法生产(培育)的或导入了所述核酸的菊花植物或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织，优选为花瓣、切花。本发明还涉及使用上述切花的加工品(切花加工品)。在此，作为切花加工品，包括使用该切花的押花、保鲜花、干花、树脂密封品等，但不限于这些。实施例以下通过实施例，具体说明本发明。只要不是特别限定，分子生物学的方法依据Molecular Cloning(Sambrook and Russell,2001)。以下参考例1 9为使用编码菊花(chrysanthemum)的黄烷酮3_羟化酶(F3H) 的基因的5’区域(CmF3Hpr0)以外的启动子的例子，另一方面，实施例1 10为与编码菊花(chrysanthemum)的黄烷酮3-羟化酶(F3H)的基因的5’区域(CmF3Hpro)有关的例子。参考例1 通过烟草EFla启动子的F3’，5’ H基因的表达通过用限制酶HindIII和BamHI酶切专利文献6中所记载的pBIEFl α，得到包含烟草EFl α的启动子序列的约1.21Λ的DNA片段。通过将该DNA片段插入到专利文献4中所记载的PSPB909的鸢尾DFR cDNA的5，侧，得到质粒pSFL339。同样，构建代替鸢尾DFR cDNA，插入到矮牵牛DFR cDNA(如国际公开公报W096/36716中所记载)的质粒pSFL340。在pSPB176(Plant Science 163，253-263，2002 中所述)的 BamHI 和 Sail 位点插入从专利文献4中所记载的pCGP1961中用BamHI和BioI部分分解而切出的三色堇F3’5’H 基因BP40的片段，将插入上述片段的质粒作为pSPB575。使用HindIII和BamHI，将该质粒的启动子部分换成上述烟草EFl α的启动子，作为pSFL338。在该AscI位点上，插入用 AscI酶切的pSFL339内包含鸢尾DFRcDNA的片段。将所得到的质粒作为pSFL346。该质粒 PSFL346如下设计，使三色堇的F3，5，H和鸢尾的DFR基因在烟草EFl α的启动子的控制下在植物中表达。包含薰衣草的F3，5，HcDNA的质粒pLHF8如国际公开公报WO 04/20637中所记载。通过将用BamHI和BioI酶切该质粒而得到的DNA片段与用BamHI和Mil酶切该质粒而得到的PSPB176的DNA片段内分子量大的DNA片段进行连接，得到质粒pSPB2772。在该质粒上，来自薰衣草的F3’ 5’ H cDNA与附加有E12增强子的CaMV35S启动子连接。使用 HindIII和BamHI，将该启动子部分换成上述烟草EFl α的启动子，得到质粒pSPB2778。在该AscI位点上，插入用AscI酶切的pSFL340中包含矮牵牛DFRcDNA的片段。将所得到的质粒作为PSPB2780。该质粒pSPB2780如下设计，使薰衣草的F3，5，H和矮牵牛的DFR基因在烟草EFl α的启动子的控制下在植物中表达。将Plant Biotechnol 23, 5-11 (2006)中记载的质粒 pSPB748 (来自蝶豆的 F3’ 5’ HcDNA与附加有E12增强子的CaMV35S启动子连接)的启动子部分使用HindIII和 BamHI，换成上述烟草EFl α的启动子，得到质粒pSPB2777。在该AscI位点上，插入在用 AscI酶切的pSFL340中包含矮牵牛DFR cDNA的片段。将所得到的质粒作为pSPB2779。该质粒pSPB2779如下设计，使蝶豆的F3’ 5’ H和矮牵牛的DFR基因在烟草EFl α的启动子的控制下在植物中表达。将上述各质粒pSFL346、pSPB2780及pSPB2779导入土壤杆菌，使用该转化土壤杆菌，导入菊花品种94-765中。分析转化菊花花瓣中的花色素，但未检测出花翠素。参考例2 导入了瓜叶菊F3’，5’ H基因启动子的菊花根据规定方法从蓝色Cineraria Senetti (三得利花卉株式会社)花蕾的花瓣中提取 RNA。使用由该 RNA 制备的 poly-A+RNA，ZAP-cDNA (注册商标)Library Construction Kit (Stratagene公司、产品编号200450)，根据制造者推荐的方法制作cDNA文库。将该cDNA 文库使用由 DIG 系统(Roche Applied Science 公司)标记的蝶豆 F3，5，H cDNA(Clitoria ternatea)(参照Plant Biotechnology 23，5-11 (2006))用该公司推荐的方法进行筛选。 纯化表示所得到的48个信号的噬菌体。用制造者(Mratagene公司)推荐的方法，通过体内切割(in vivo excision)从这些噬菌体中得到质粒。确定这些质粒中所包含的cDNA部分的碱基序列，对DNA数据库进行Blast搜索时，可得到许多与细胞色素P450显示同源性的基因，这些可分为8类。确定推测为其中被分类为CYP75B的CifelS的全碱基序列(参照序列号77)。将包含该序列的 pBluescriptSKII-的质粒作为 pSPB2774。从相同瓜叶菊的叶中提取染色体DNA，使用ABlueSTAR Xho I Half-Site Arms Kit (Novagen, http://www.merckbiosciences.com/product/69242)制作染色体文库。将所得到的20万噬菌斑使用由DIG标记的CifelS cDNA片段进行筛选。该cDNA片段使用引物(Ci5al8Fl (序列号 81) :5，-CATCTGTTTTCTGCCAAAGC-3，和 Ci5al8Rl (序列号 82) 5’ -GGATTAGGAAACGACCAGG-3’ )以为模板进行扩增。从所得到的17个噬菌斑中最终得到4个噬菌斑，将这些通过体内切割(in vivo excision)而转换为质粒。在确定这些的DNA碱基序列时，发现这些之中包含相同序列。将其中的gCiOl-pBluestar克隆用于以后的实验。gCiOl-pBluestar克隆碱基序列如序列号79所示。希望该序列包含如下5’ -非翻译区域、翻译区域、3’ -非翻译区域，该5’ -非翻译区域、翻译区域、3’ -非翻译区域包含具有瓜叶菊F3’ 5’ H启动子活性的序列。将从gCiOl-pBluestar中用PvuI和EcoRV切出的约5. 7kb的DNA片段(序列号 80)使用DNA blunting kit (TAKARA)进行末端平滑化。将该DNA片段克隆到pBinPLUS的 SmaI位点，将其命名为pSPB3130。该双元载体具有在T-DNA区域可用卡那霉素筛选使用的nptll基因。将pSPB3130通过土壤杆菌法导入菊花品种94_765。分析转化菊花花瓣中的花色素，但未检测出花翠素，花的颜色也未发生变化。3成聽_辟好白诚胃胃白妒Φ构建在国际专利申请PCT/AU03/01111中所记载的来自月季的查耳酮合成酶启动子上连接来自三色堇的F3，5，ΗΒΡ#18基因的双元载体，作为pBRBP18。如参考例1及2中所记载，将包含该双元载体的基因导入菊花品种94-765。在分析转化菊花花瓣中的花色素时，虽检测出相对于总花色素最高为5. 4%的花翠素，但未发现花的颜色发生变化。此外，作为使用月季查耳酮合成酶基因启动子的花翠素产生的例子，可例举表1 中从上开始第9行中记载的pSPB3325(月季CHSpro::三色堇#18+月季CHSp::菊花F3，H IR)，在该例子中，花翠素产生为最高3.6%。参考例4 利用三卢,革F3’ 5’ H某因启动子的花翠素的产牛(1) 1 跡避 3-1 胃_械·_械已知紫苏中有叶中积累花色素苷的红色变种和不积累花色素苷的绿色变种。从前者的叶中，将其染色体DNA用所报道的方法(参照Plant Mol Biol. December 1997 ；35 (6) 915-27)制备。将该染色体DNA用Sau3AI(T0Y0B0公司制)进行部分酶切，通过蔗糖密度梯度法回收含有10 151Λ的DNA片段的组分。通过将该片段使用公知的方法插入作为λ噬菌体载体的一种的EMBL3 (Promega公司制)的BamHI位点，制作染色体DNA文库。将所得到的文库以来自紫苏的作为花色素苷3-酰基转移酶的cDNA的pSAT208(参照Plant Cell Physiol. April 2000 ；41 (4) :495-502)为探针使用来进行筛选。文库的筛选根据已报道的方法(参照Plant Cell Physiol. July 1996 ；37 (5) :711-6)进行。将探针和杂交了的噬菌斑纯化后进行培养，从所得到的噬菌体中制备DNA。(2) m^ir^m^ 3-HmmM^immmmMmmm用)(bal酶切上述得到的DNAlO μ g，用0.7%琼脂糖凝胶分离后，在High Bond N(Amersham公司制)上转膜。将该膜用如上所述相同的方法杂交时，可知有约6. Skb的DNA 片段与探针杂交。用^CbaI酶切该DNA 20yg，用0.7%琼脂糖凝胶分离后，将约6.81Λ的 DNA片段用Gene Clean进行精制，与用)(bal酶切的pBluescriptSKII-连接。将所得到的质粒作为PSPB513。将该质粒中所含有的来自紫苏的DNA序列通过引物步查法来确定。其碱基序列如序列号4中所示。该序列中有与作为花色素苷3-酰基cDNA的pSAT208显示高同源性的区域，该区域编码的蛋白质的氨基酸序列(序列号6)与PSAT208的编码氨基酸序列相比，发现有19个氨基酸残基的取代和2个氨基酸的缺失，未观察到内含子。另外，与上述pSAT208显示高同源性的区域的序列在认为是其起始密码子的ATG的上游有3438bp的序列，在认为是其终止密码子的TAA的下游有2052bp的序列。在上述3438bp的序列内，存在不是花色素苷3-酰基转移酶的其他开放阅读框(0RF，序列号幻。除了该部分以外，为扩增紫苏花色素苷3-酰基转移酶基因的转录调控区域进行如下实验。(3)紫苏花代直苷以 Ing 的 PSPB513 为模板，使用 2 种引物(5’-AAGCTTAACTATTATGATCCCACAGAG-3’ ( 序列号7，下线部为HindIII的识别序列)、5，-GGATCCGGCGGTGTTGAACGTAGC-3’ (序列号8， 下线部为BamHI的识别序列)进行PCR(95°C保持1分钟后，25个循环的52°C 1分钟、72°C 2分钟、95°C 1分钟的反应)。用Hind III和BamHI酶切所扩增的约1. Ikb的DNA片段。用I^acI酶切专利文献4中所记载的质粒pSPB567(在附加有E12增强子的花椰菜花叶病毒35S启动子的3’侧连接来自三色堇的类黄酮3’，5’ -羟化酶基因，进而在其3’侧连接胭脂碱合成酶的终止子)，将包含来自三色堇的类黄酮3’，5’-羟化酶基因的DNA片段克隆到pBin+的I^cI位点。将在所得到的质粒内附加有E12增强子的花椰菜花叶病毒35S 启动子在PBin+的AscI位点附近存在时的质粒作为pSPB575。用HindIII和BamHI酶切该质粒，向其中插入用HindIII和BamHI酶切包含所述紫苏花色素苷3-酰基转移酶转录调控区域的约1. 11Λ DNA片段后的DNA片段。将所得到的质粒作为pSFL205。用HindIII和Mel酶切pSFL205，回收约IOObp的DNA片段。将该DNA片段、与将 PSPB513用SacI和XbaI酶切而得到的约4kb的DNA片段、和用HindIII和XbaI酶切的质粒 pBin+(参照 Transgenic Research 4,288-290,1995)连接，得到质粒 pSPB3311。该质粒PSPB3311成为包含序列号2中所示的碱基序列的双元载体，包含紫苏花色素苷3-酰基转移酶基因的转录调控区域和该基因的翻译区域及其3’侧的非翻译区域。(4)pSPB3323 的构津将三色堇的类黄酮3，，5，-羟化酶基因BP#40 (参照WO 04/020637)的转录调控区域使用 TaKaRa LA PC R in vitro Cloning Kit，如下进行扩增。从三色堇的叶中使用DNA easy plant kit (QIAGEN公司)制备染色体DNA。用限制酶Hindi 11酶切3 μ g的染色体DNA。将酶切的DNA使用Hindi 11末端DNA (在TaKaRa LA PCR in vitro Cloning Kit 中含有)和 Ligation High (Ta KaRa)，16°C下反应 40 分钟， 进行连接。将反应液4 μ 1用10 μ 1的水稀释，将连接后的DNA在94°C下处理10分钟变性后，在冰中冷却。加入 5pmol 的引物 Cl (5，-GTACATATTGTCGTTAGAACGCGTAATACGACTCA-3，， 序列号9，为HindIII盒序列的一部分序列，包含在Kit中)和5pmol的引物BP40_i5 (5，_A GGTGCATGATCGGACCATACTTC-3，，序列号10，相当于BP#40翻译区域的互补链)，根据试剂盒中的实验方法，在25 μ 1的反应液中重复进行30次98°C 20秒、68°C 15分钟的反应。将反应液用水稀释10倍。其中，以0. 5μ 1为模板，在包含5pmol的引物C2 (5，-CGTTAGAACGCGT AATACGACTCACTATAGGGAGA-3’，序列号11，为HindIII盒序列的一部的序列，包含在Kit中) 和 5pmol 的引物 BP40-i7(5，-GACCATACTTCTTAGCGAGTTTGGC-3，，序列号 12)的 25 μ 1 的反应液中进行98 °C 5分钟的反应后，重复进行30次98 °C 20秒、68°C 15分钟的反应。将所得到的DNA片段导入质粒pCR2. 1 (Invitrogen公司)中。在确定所插入的 DNA的碱基序列时，发现有其序列与BP#40的cDNA碱基序列不一致之处。这是因为在进行 PCR之际会引起错误。为扩增没有错误的序列，进行以下操作。为扩增约21Λ的BP#40的5，-非翻译区域和200bp的翻译区域，以200ng的三色堇的染色体DNA为模板，使用50pmol的引物BP40_i7 (序列号12)和50pmol的引物BP40 ρ ro-F(5' -ACTCAAACAAGCATCTCGCCATAGG-3，，序列号 13，BP#40 基因的 5，-非翻译区域中的序列)，在25 μ 1的反应液中进行PCR。在98°C处理5分钟后，重复进行30次98°C 20秒和 680C 15分钟形成的反应。将所扩增的DNA片段插入到pCR2. 1中。在该DNA片段中含有约 2. Ikb的5，-非翻译区域和200bp的翻译区域。将该质粒作为PSFL614。质粒pSFL614序列的碱基序列如序列号14中所示。为了转录BP#40基因，使用PSFL614中所含有的约2. 11Λ的5，-非翻译区域(BP40pro，序列号15)。此时，将BamHI位点变更为NheI。以Ing的pSFL614质粒为模板， 加入 50pmol 的引物 BP40pro-HindIII-F(5，-AAG CTT GTG ATC GACATC TCT CTC C-3，，序列号 16)禾口 50pmol 的引物 BP40pro-NheI-R(5，_CGA GGCTAG CTA AAC ACT TAT-3，，序列号 17) ,Ex-TaqDNA聚合酶，在25 μ 1的反应液中98°C下保持5分钟后，重复进行25次98 °C 20 秒、68°C 15分钟的反应。将扩增的DNA片段克隆到pCR2. 1上。通过确认碱基序列，确定该序列中没有因PCR引起的错误。将该质粒用HindIII和NheI酶切，得到470bp的DNA片段。 将该DNA片段作为片段A。以 Ing 的 pSFL614 质粒为模板，加入 50pmol 的引物 BP40pro-NheI_F(5，-TTT AGC TAG CCT CGA AGT TG-3，，序列号 18)禾口 50pmol 的引物 BP40pro_BamHI-R(5，-GGA TCC CTA TGT TGA GAA AAA GGG ACT-3，，序列号 19)、Ex-iTaqDNA 聚合酶，在 25 μ 1 的反应液中 98°C 保持5分钟后，重复进行25次98°C 20秒、68°C 15分钟的反应。将扩增DNA片段克隆到 PCR2. 1上。通过确认碱基序列，确定该序列上没有因PCR引起的错误。用HindIII和NheI 酶切该质粒，得到630bp的DNA片段。将该DNA片段作为片段B。回收用BamHI和HindIII酶切专利文献4中所记载的质粒pSPB567后产生的DNA 片段中大的片段，连接上述的片段A和片段B，作为pSFL620。用I^acI酶切PSFL620后，回收约3. 2kb的DNA片段。将该DNA片段插入pBin+的 PacI位点。将所得到的质粒作为PSPB3317。将用AscI和)(baI酶切上述pSPB3311而得到的片段导入PSPB3317的AscI和)(baI位点，将所得到的质粒作为pSPB3323。(5) m^PM^ 3-酉feS转本某因和三卢,革F3’5’H某因在菊花中的表达将上述中制备的PSPB3323导入土壤杆菌中，使用该土壤杆菌将菊花品种 94-765(精兴园，未发售)通过公知的方法转化。获得6系统的转化系统。将用以下方法提取的花色素进行分析。将舌状花瓣冷冻后粉碎，将粉碎后的花瓣 50 IOOmg用500 μ 1的1 %盐酸甲醇提取，在该提取液中加入500 μ 1的4Ν盐酸(HCl)并混合，100°C下进行1小时水解。将水解后的溶液冷却后，添加Iml的0. 05M三氟乙酸(TFA) 并混合。而后，将该溶液添加C18 (MILLIP0RE)中吸附水解产物。S印-Pak C18 预先用80%乙腈(MeCN)洗涤后，用0. 05M TFA平衡。将吸附在S印-Pak C18上的水解产物用 0. 05M TFA 洗涤后，进一步用 20% MeCN、0. 05M TFA 洗涤后，用 80% MeCN、0. 05M TFA 洗脱水解产物，作为分析样品。分析样品使用高效液相色谱法用以下条件分析。色谱柱使用hertsil 0DS_2 (粒径 5 μ m，4. 6 X 250mm, GL Sciences)，流速为 0. 8ml/min,流动相为从含有 1. 5 %磷酸、5 % 乙酸、6. 25%乙腈到20%乙酸、25%乙腈的直线浓度梯度20分钟后，用含有1.5%磷酸及20% 乙酸的25%乙腈进行5分钟的等度洗脱。检测使用AgilentllOO系列二极管阵列检测器 (GL Sciences)，检测从250nm到600nm的波长区域，通过530nm的吸光度的面积求出各花色素的存在比。分析的结果，在作为转化体的分析系统1300-3、1300-4、1300-5、及1300-6中，检测出花翠素分别占总花色素的0. 9%、0. 8%U. 4%及0. 6%。这表明三色堇的BP#40转录调控区域负责BP#40的转录，但未使花色产生变化。参考例5:利用Rosa ruRosa Thunb. ex MurrayDFR启动子的菊花中花翠素的产生
将Rosa rugosa Thunb. ex Murray 的染色体 DNA 文库使用 λ BlueSTAR Xho I Half-Site Arms Kit (Novagen,http://www. merckbiosciences. com/product/69242)如下制作。由 Rosa rugosa Thunb. ex Murray 的嫩叶中使用 Nucleon Phytopure[Registered] (TEPNEL Life Sciences)制备染色体DNA0将约100 μ g的染色体DNA用限制酶Sau3AI进行部分酶切。将该DNA 片段在 dGTP 和 dATP 的存在下用 DNA聚合酶 I Klenow fragment (TOYOBO) 进行部分Fill-In，通过蔗糖密度梯度离心进行分离。回收约131Λ大小的DNA，通过乙醇沉淀进行浓缩。将约 180ng 的 DNA 与 1 μ 1 的 λ BlueSTAR Xho I Half-Site Arms Kit 在 4°C下进行15小时连接后，进行体外包装(in vitro packaging)反应，得到染色体文库。将该文库用栽培月季的DFRcDNA(Plant and Cell Physiology, 36，1023-1031， 1995)进行筛选，得到表示信号的噬菌斑。从该噬菌斑中用制造者(Novagen)推荐的方法进行体内切割，得到质粒PSH(710。在该质粒中，含有与前述栽培月季的DFRcDNA非常一致的 DNA序列。为了由该质粒得到DFR翻译序列的5’-非翻译区域，并能容易地与异种基因连接， 通过进行PCR,使1个EcoRI识别序列突变为NheI识别序列，附加Hind III和BamHI识别序列。首先，以 PSFL710 为模板，使用各 25pmol 的引物 DFRproHindIIIF(5，-TAATAAGCTTAC AGTGTAATTATC-3，，序列号 20)和 DFIiproNheIR (5，-TTATGCTAGCGTGTCAAGACCAC-3，，序列号 21)和酶ExTaq DNA聚合酶(Τ0Υ0 B0)，在50 μ 1的反应液中进行PCR。PCR的反应条件为 94°C下反应5分钟后，重复进行30个94°C 30秒、50°C 30秒、72°C 30秒为1循环的反应，进而在72°C下保持7分钟。由此得到约350bp的DNA片段A。同样，以pSFL710为模板，使用各 25pmol 的引物 DFIiproNheIF (5，-ACACGCTAGCATAAGTCTGTTG-3，，序列号 2 和 DFRproBa mHI-R (5 ‘ -GCTTGGGGATCCATCTTAGG-3 ‘,序列号 2 、酶 ExTaqDNA 聚合酶(Τ0Υ0Β0)，在 50 μ 1 的反应液中进行PCR。PCR的反应条件为94°C下反应5分钟后，重复进行30个94°C 30秒、 500C 30秒、72°C 30秒为1循环的反应，进而在72°C下保持7分钟。由此得到600bp的DNA 片段B。用BamHI酶切专利文献4中所记载的pSPB567 (包含附加有E12增强子的CaMV35S 启动子、三色堇的F3，5，HB0#40、胭脂碱合成酶终止子的质粒pUC)，通过用HindIII部分酶切，使除去了附加有E12增强子的CaMV35S启动子的片段与用HindIII和NheI酶切片段A后的片段和用NheI和BamHI酶切片段B后的片段进行连接，得到质粒pSFL721 (包含 R. rugosa DFR 5，:BPF3，5，H#40 :nos 3，的表达盒)。通过将用I^acI酶切该质粒而得到的表达盒导入PBinPLUS 的 I^acI 位点，作为 pSFL724。将该质粒导入 Agrobacterium tumefaciens EHA105 株。使用该转化土壤杆菌由品种94-765得到重组菊花。出现了在花瓣中产生花色素总量中的0. 6%程度的花翠素的系统。此外，使用Rosa rugosa Thunb. ex MurrayDFR启动子的其他参考例有表1中上数第 2行(pSPB3316(Rosa rugosa Thunb. ex MurrayDFRpro 三色堇#40+月季ANSpro 蓝猪耳 5GT、无花翠素产生系统)和第 5 行(pSPB3325 (Rosa rugosa Thunb. ex MurrayDFRpro 三色堇#40+龙胆3，GTpro:蓝猪耳MT、花翠素最高0. 9% )。均未达到使花色发生变化。参考例6:利用Rosa ruRosa Thunb. ex MurrayF3H启动子的菊花中的花翠素的产生将参考例5中制作的Rosa rugosa Thunb. ex Murray染色体DNA文库通过蓝猪耳的黄烷酮3-羟化酶(F3H)cDNA(NCBI No.AB211958)进行筛选，得到表示信号的噬菌斑。其中，将1噬菌斑与参考例5同样换成质粒。将其用限制酶SpeI酶切，回收2. 6kb的DNA片段，通过亚克隆到pBluescript SKI I-(STRATA GENE)的SpeI位点，得到质粒pSPB804。该质粒具有与F;3H显示同源性的碱基序列。为扩增F3H的5，-非翻译区域，以Ing的pSPB804为模板，使用引物RrF3H_F(5，-AAGCTTCTAGTTAGACAAAAAGCTA-3，，序列号 24)、引物 RrF3H(5，-GGATCCTCTCTTGATATTTCCGTT C-3，，序列号2 及Ex-Taq DNA聚合酶(TOYOBA)，在50 μ 1的反应液中进行PCR。PCR的反应条件为94°C下反应5分钟后，重复进行30个94°C 30秒、50°C 30秒、72°C 30秒为1循环的反应，进而在72°C下保持7分钟。将所得到的DNA片段插入pCR-TOPO(INVITROGEN)中， 得到质粒PSPB811。从该质粒中，可使用HindIII和BamHI,回收约1. 2kb的F3H的5，-非翻译区域。如参考例5中所述，将pSPB567的启动子部分使用HindIII和BamHI置换为约 1.2kb 的 F3H 的 5，-非翻译区域，得到质粒 pSFL814(含有 R. rugosa F3H 5，:BPF3，5，H#40 nos 3，)。将该质粒导入 Agrobacterium tumefaciens EHA105 株。使用该转化土壤杆菌，从品种94-765中得到3系统重组菊花，但还没有可在花瓣中产生花翠素的系统(参照表1)。参考例 7 :pBINPLUS Rosa ruRosa Thunb. ex MurrayF3Hpro ADHNF-三饩堇 F3，5，H#40: NOSter 的制作将以pSFL814 (参考例 6)为模板、将 ADH-BP40_Fd (5，-CAAGAAAAATAAATGGCAATTCTA GTCACCGAC-3，，序列号 26)和 NcoI_BP40-Rv (5，_CTCGAGCGTACGTGAGCATC_3，，序列号 27)作为引物使用并用PCR扩增的DNA片段及以pBI221 ADH-221为模板、将BamHI-ADH-Fd(5，-C GCGGATCCGTCTATTTAACTCAGTATTC-3，，序列号 2 和 BP40_ADH-Rv (5，-TAGAATTGCCATTTATTT TTCTTGATTTCCTTCAC-3’，序列号29)作为引物使用并用PCR扩增的DNA片段进行混合，并将其用作模板，将 BamHI-ADH-Fd (5，-CGCGGATCCGTCTATTTAACTCAGTATTC-3，，序列号 30)和 Nc oI-BP40-Rv(5，-CTCGAGCGTACGTGAGCATC-3，，序列号 31)作为引物使用，通过 PCR，得到烟草 ADH-5，UTR 94bp与三色堇F3，5，H#40的起始密码子直接连接的DNA片段。将该DNA片段TA克隆到pCR2. 1上后，通过将用BamHI及NcoI酶切而得到的约 600bp的DNA片段与用BamHI及NcoI酶切pSFL814而得到的双元载体片段进行连接，得到 pBinPLUS Rosa rugosa Thunb. ex MurrayF3Hpro: ADHNF-三色堇F3'5'H#40: NOSter0 将该质粒导入 Agrobacterium tumefaciens EHA105 株。使用该转化土壤杆菌，在来自菊花品种94-765的所得到的转化体4系统中不存在可检测出花翠素的个体(参照表1)。参考例8 :pBIN19 月季 CHSpro ADH-三饩堇 F3，5，H#18: NOSter 的制作用KpnI 和 SmaI 酶切以 pBI221 ADH221 为模板、将 ADH KpnI Forward (5‘-CGGTACC GTCTATTTAACTCAGTATTC-3，，序列号 3 和 GUS19R(5，-TTTCTACAGGACGTAACATAAGGGA_3，，序列号33)作为引物使用并用PCR扩增的DNA片段，得到约IlObp的烟草ADH-5，UTR DNA片段。将该DNA片段与用KpnI和SmaI酶切pBRBP18(在pBIN19上加入月季CHSpro 三色堇F3，5，H#18::N(^ter的表达盒)而得到的双元载体的DNA片段进行连接，得到pBIN19月季CHSpro: ADH-三色堇F3，，5，Η#18::Ν0Μθγ。在该质粒中，在烟草ADH-5，UTR和三色堇 F3，5，H#18之间存在38b的间隔序列。将该质粒导入Agrobacterium tumefaciens EHA105 株。使用该转化土壤杆菌，得到来自菊花品种94-765的重组菊花30系统。在其中5 系统的花瓣中检测出花翠素，花翠素含有率达到1.9%。但是，未发现花色发生变化。参考例9 :pBI121-月季 CHSpro: ADHNF-三卢,茧 F3，5’ H#40: NOSter 的制作用HindIII 和 NheI 酶切以 pBRBP18 (参考例 3)为模板、将 HAPS-RhCHSpro3k-Fd(5， -CCAAGCTTGGCGCGCCTTAATTAAATTTAAATCAGCAAGAGTTGAAGAAATAG-3，，序列号 85)和 NS-RhCHSpro3k-Rv(5，-AAAGCTAGCACTAGTCATCTCGGAGAAGGGTCG-3，，序列号 86)作为引物使用并通过使用Pyrobest聚合酶(Takara)的PCR而得到的DNA片段，并与用HindIII 和^CbaI酶切PBI121ADHNF而得到的双元载体的片段进行连接，将所得到的双元载体作为 pBI121-RhCHSp-⑶S-NC^t。将用SpeI及EcoICRI酶切pBI121-RhCHSp-GUS_N0St而得到的双元载体的片段与用SpeI及EcoICRI酶切实施例10中得到的pCR-ADHBP40-SpeSac而得到的 ADHNF-三色堇F3，5，H#40DNA片段进行连接，得到pBI 121-月季CHSpro: ADHNF-三色堇 F3' 5’ H#40: NOSter，并转化至Ij Agrobacterium tumefaciens EHA105 株中。使用该转化土壤杆菌，得到来自菊花品种94-765的重组菊花19系统，但不存在可检测出花翠素的个体。^MM 13-因的启云力子Rfel的克降将通过筛选使用菊花的黄烷酮3-羟化酶基因(F3H)cDNA片段的基因组文库而得到的包含F3H的启动子区域的DNA片段进行亚克隆，以所得到的pBlues cript SK_gF3H9 (菅野等(2001)园学杂70 (别2) 193，序列号35)为模板，将以HANS-F3Hprolk-F d (5，-CCAAGCTTGGCGCGCCGCGGCCGCATTTAAATTTACAAAACCATGTGCAAGAATG-3，，序列号 36，下线部为包含F3H的启动子区域的DNA和退火的序列)和SNM-F3Hpro-Rv (5’-ACTAGTGCTAGCACG CGTTTTTTATTTTTTCTTCACACACTTG-3，，序列号37，下线部为包含F3H的启动子区域的DNA和退火的序列)作为引物使用并通过PCR扩增的DNA片段克隆到pCR2. I(Invitrogen)上，得到 pCR HANS-CmF3Hplk-NS0 此外，将以 HANS-F3Hprolk_Fd 和 NSM_F3Hpro-Rv (5，-GCTAGCAC TAGTACGCGTTTTTTATTTTTTCTTCACACACTTG-3 ’，序列号38，下线部为包含F3H的启动子区域的 DNA和退火的序列)作为引物使用并通过PCR扩增的DNA片段克隆到pCR2. 1上，得到pCR HANS-CmF3Hplk-SN0 将以 HANS_F3Hpro Ik-Fd 和 Bcl I_CmF3Hp-Rv (5，-TTTTGATCATTTTTTATTT TTTCTTCACACAGTG-3 ,序列号39，下线部为包含F3H的启动子区域的DNA和退火的序列)作为引物使用并通过PCR扩增的DNA片段克隆到pCR2. 1上，得到pCR HANS-CmF3HpIk-BclI。 进而，通过将用 HindIII 及 XbaI 酶切 pBI 121 ADHNF(Satoh J. et al.，(2004) J B iosci Bioengineer)而得到的双元载体片段与用HindIII及NheI酶切pCR HANS-CmF3Hplk_SN而得到的约1. Ikb的菊花F3H启动子DNA片段进行连接，得到pBI121 HANS-CmF3Hplk-S。将其他长度的启动子区域如下进行扩增。将以pBluescript SK_gF3H9 为模板、将 HANS-F3Hpro500-Fd(5‘-CCAAGCTTGGCGCG CCGCGGCCGCATTTAAATTACTGTTCGAACCTACAMGG-3，，序列号 83，下线部为包含F3H 的启动子区域的 DNA 和退火的序列)与 MX-F3Hpro~Rv (5，-TTTCTAGAACGCGTTTTTTATTTTTTCTTCACACACT巡-3’，序列号84，下线部为包含F3H的启动子区域的DNA和退火的序列)作为引物使用并通过PCR扩增的DNA片段克隆到pCR2. 1上，得到pCR HANS-CmF3Hpro500-X。此外，通过将用HindIII和XbaI酶切pBI121 ADHNF而得到的双元载体的片段与用HindIII及XbaI酶切pCR HANS-CmF3Hpro500-X而得到的约500bp的菊花F3H启动子DNA片段进行连接，得到 pBI121 HANS-CmF3Hp500-Xo实施例2 :pBI121 菊花 F3Hprolk: ADHNF-风铃草 F3’ 5’ H: NOSter 的制作根据DNA数据库GenBank 中登录的风铃草(Campanula medium)的F3’5’HcDNA(登录号D14590)的翻译序列合成2种引物CamFl (5，-GTGAAGCCACCATGTCTATAG-3，，序列号 49)和 CamRl (5，-GCATTTGCCTAGACAGTGTAAG-3，，序列号 50)。使用 RNeasy Mini Plant Kit(QIAGEN公司)，从市售的风铃草花蕾的花瓣中提取RNA，使用RT-PCR试剂盒合成1st strand DNA。以该1st strand DNA为模板，使用引物进行PCR。将所得到的DNA片段克隆到PCR-TOPO II上。其中，将克隆#4(作为pSPB2561)的碱基序列确定为序列号51。如以下所示，构建将烟草ADH_5’UTR 94bp与F3’ 5’ H基因进行了连接的载体(图 4)。且后述实施例也同样进行。将以pSPB2561 为模板、将 ADH-Campa-Fd (5，-CAAGAAAAATAAATGTCTATAGACATAAC CATTC-3，，序列号 5 和 HpaI-Campa-Rv (5，-GTTAACATCTCTGGCACCACC-3，，序列号 54)作为引物使用并用PCR扩增的DNA片段以及以pBI221 ADH-221为模板、将^CbaI-ADH-Fd(序列号 42)和 Campa-ADH-Rv (5，-GTCTATAGACATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3，，序列号 55) 作为引物使用并用PCR扩增的DNA片段的这两种片段进行混合，并将其用作模板，将 XbaI-ADH-FcK 序列号 4 和 HpaI-Campa-Rv (5，-GTTAACATCTCTGGCACCACC-3，，序列号 56) 作为引物使用，通过PCR，得到烟草ADH-5’ UTR 94bp与风铃草F3’ 5’ H的起始密码子直接连接的DNA片段。将该DNA片段TA克隆到pCR2. 1上后用)(baI和HpaI酶切，将所得到的约650b的片段与用)(bal和HpaI酶切pSPB2561而得到的载体片段进行连接，得到pCR ADHNF-Campanula FSH而后，用KpnI 酶切 pCR ADHNF-Campanula F3，5，H 后，用 Blunting High (TOYOBO) 进行末端平滑化，进而通过将用)CbaI酶切后所得到的约1. 7kb的DNA片段与用SpeI及 EcoICRI酶切pBI121 HANS-CmF3Hplk-S而得到的双元载体片段进行连接，得到pBI121菊花 F3HproIk ADHNF-风铃草 F3，5，H: :N(^ter。将该质粒导入 Agrobacterium tumefaciens EHA105 株。使用该转化土壤杆菌，得到来自菊花品种94-765的重组菊花48系统。在其中30 系统的花瓣中检测出花翠素，花翠素含有率达到80. 5%。由 pBI121 菊花 F3Hprolk: ADHNF-风铃草 F3，5，H: NOSter 构建 pSPB3738。将该质粒导入Agrobacterium tumefaciens AGLO株，使用该物质转化菊花品种ki Taitan (精兴园)。所得到的26系统重组菊花中的6系统中发现有花色的变化，可通过薄层色谱法检测花翠素。实施例3 :pIG121-Hm-菊花 F3Hprolk: ADHNF-洋桔梗 F3’ 5’ H: NOSter 的制作将克隆到pBluescript SIT 上的洋桔梗 F3，5，H 基因(EgF3，5，H, GenBank AB078957)用XhoI酶切后，用Blunting High(TOYOBO)进行末端平滑化，进而通过将用 XbaI酶切后所得到的约1. 9kb的EgF3，5，H DNA片段与用)(bal及EcoICRI酶切而得到的pIG121-Hm双元载体的片段进行连接，得到pIG121-Hm 35S: :EgF3' 5，H。而后，将以pBluescript SITEgF3，5，H 为模板、将 ADH_EgF3，5，H-Fd(5，-CAAGA AAAATAAATGGCTGTTGGAAATGGCGTT-3，，序列号 40)和 HpaI_EgF3，5，H-Rv (5，-GTTAACGCTGA GCCTAGTGCC-3，，序列号41)作为引物使用并通过PCR进行扩增DNA片段、以及以pBI221 ADH-22KSatoh J. et al.，(2004) J Biosci Bioe ngineer)为模板、将 Xbal-ADH-Fd (5，-A CGCGTTCTAGAGTCTATTTAACTCAGTATTC-3，，序列号 42)及 EgF3，5，H-ADH-Rv (5，-TCCAACAGCCA TTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3’，序列号43)作为引物使用并通过PCR进行扩增DNA片段的这两种片段进行混合，并将其用作模板，以XbaI-ADH-FcK序列号42)及HpaI-EgF3’5’H-RV( 5，-GTTAACGCTGAGCCTAGTGCC-3，，序列号44)作为引物使用，通过PCR，得到烟草ADH-5，UTR 94bp (Satoh J. et al.，(2004) J Biosci Bioengineer)与 EgF3，5，H 的起始密码子直接连接的DNA片段。将该DNA片段TA克隆到pCR2. 1上后用)(baI及HpaI酶切，将所得到的约 1. 3kb的DNA片段与用)(bal及HpaI酶切pIG121_Hm 35S: :EgF3，5，H而得到的双元载体的片段进行连接，得到pIG121-Hm 35S: :ADHNF_EgF3，5，H。将用HindIII及XbaI酶切该 pIG121-Hm 35S: :ADHNF_EgF3，5，H 而得到的约 1. 2kb 的 EgF3，5，H 的 DNA 片段和约 15kb 的双元载体的DNA片段、进而与用HindIII及SpeI酶切pCR HANS-CmF3HpIk-MNS而得到的 DNA 片段进行连接，得到 pIG121-Hm 菊花 F3Hprolk::ADHNF-洋桔梗 F3，5，H: NOSter0 将该质粒导入 Agrobacterium tumefaciens EHA105 株。使用该转化土壤杆菌，得到来自菊花品种94-765的重组菊花5系统。在其中1系统的花瓣中检测出花翠素，花翠素含有率达到4. 4%。实施例4 :pBI121 菊花 F3Hprolk: ADHNF-山梗菜 F3’ 5’ H: NOSter 的制作通过将克隆到pBluescript SK—上的来自山梗菜花瓣的F3，5，H基因(LeF3，5，Hl， GenBank AB221077 及 LeF3，5，H4, GenBank AB221078)用 KpnI 酶切后并用 Blunting High(TOYOBO)进行末端平滑化，进而用XbaI酶切而得到的约1. 9kb的EgF3，5，H DNA片段与用^CbaI及EcoICRI酶切而得到的pIG121-Hm双元载体的片段进行连接，得到pIG121_Hm 35S: :LeF3，5，Hl 及 pIG121_Hm 35S: :LeF3，5，H4。而后，将以pBluescript SITLeF3，5，Hl 或 pBluescript SITLeF3，5，H 4 为模板、 将 ADH-LeF3，5，H-Fd (5，-CAAGAAAAATAAATGGACGCGACAWACATTGC-3，，序列号 45)及 HpaI-L eF3’ 5’ H-Rv (5’ -GTTAACATCTCGGGCAGCACC-3’，序列号46)作为引物使用并通过PCR进行扩增 DNA 片段、以及以 pBI221 ADH-221 为模板、将 Xbal-ADH-Fd(序列号 42)和 LeF3，5，H_AD H-Rv (5，-TGTCGCGTCCATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3，，序列号 47)作为引物使用并通过 PCR 进行扩增的DNA片段的这两种片段进行混合，并将其用作模板，将^CbaI-ADH-Fd (序列号42) 及 HpaI-LeF3，5，H-Rv(5‘ -GTTAACATCTCGGGCAGCACC-3，，序列号 48)作为引物使用，通过 PCR，分别得到烟草ADH-5，UTR 94bp与LeF3，5，Hl或LeF3，5，H4的起始密码子直接连接的DNA片段。通过将这些DNA片段分别TA克隆到pCR2. 1上后用XbaI及HpaI酶切，将所得到的约800b的DNA片段分别与用)(bal及HpaI酶切pIG121_Hm 35S: :LeF3，5，Hl 或pIG121-Hm 35S::LeF3' 5，H4而得到的双元载体的片段进行连接，得到pIG121-Hm 35S: :ADHNF-LeF3，5，Hl 及 pIG121_Hm 35S: :ADHNF_LeF3，5，H4。通过将用 XbaI 及 EcoRV 酶切这些双元载体而得到的约2. 6kb的ADHNF-LeF3，5，Hl NOSter DNA片段与用SpeI及EcoICRI酶切pBI121 HANS-CmF3Hplk-S而得到的双元载体片段进行连接，得到pBI121菊花 F3Hprolk pro: ADHNF-山梗菜F3，5，H1 :N(^ter 及pBI121 菊花F3Hprolk pro: ADHNF-山梗菜 F3，5，H4: NC^ter。使用转化了pBI121-菊花 F3Hprolk: ADHNF-山梗菜 F3，5'Hl NOSter 的土壤杆菌，得到来自菊花品种’ 94-765’的重组菊花12系统，但未得到含有花翠素的个体。此外， 使用转化了 PBI121-菊花F3Hprolk: ADHNF-山梗菜F3，5，H4: NOSter的土壤杆菌，得到来自菊花品种’ 94-765’的重组菊花34系统，但未得到含有花翠素的个体。实施例5 :pBINPLUS 菊花 F3Hprolk: ADHNF-三饩茧 F3’ 5’ H#40: NOSter 的制作通过将用AscI 及 BclI 酶切 pCR HANS-CmF3HpIk-BcII 而得到的约 1. Ikb 的菊花 F3H 启动子 DNA 片段与用 AscI 和 BamHI 酶切 pBinPLUS Rosa rugosa Thu nb. ex MurrayF3Hpro ADHNF-三色堇F3，5，H#40 NOSTer而得到的双元载体的片段进行连接，得到pBinPLUS菊花F3Hprolk: :ADHNF-三色堇F3，5，Η#40::Ν0Μθγ。将该质粒导入 Agrobacterium tumefaciens EHA105 株。使用该转化土壤杆菌，得到来自菊花品种94-765的重组菊花6系统。在其中4系统的花瓣中检测出花翠素，花翠素含有率达到26.8%。实施例6 :pBI121 菊花 F3Hprolk: ADHNF-Cineraria F3，5，H: NOSter 的制作和向菊花中的导入将以参考例2 中得到的 CinerariaF3，5，H(pSPB2774)为模板、将 ADH_ScF3，5，H-Fd (5，-CAAGAAAAATAAATGAGCATTCTAACCCTAATC-3，，序列号 57)和 NdeHcF3，5，H-Rv (5，-C ATATGTTTAGCTCCAGAATTTGG-3’，序列号58)作为引物使用并用PCR扩增的DNA片段以及以 pBI221 ADH-221 为模板、以 Xbal-ADH-Fd (序列号 42)和 &F3，5，H-ADH-Rv (5，-TAGAATGCTCA TTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3’，序列号59)作为引物使用并用PCR扩增的DNA片段的这两种片段进行混合，并将其用作模板，将^CbaI-ADH-Fd(序列号42)和NdeI-ScF3，5，H-RV(5，-CATATGTTTAGCTCCAGAATTTGG-3，，序列号60)作为引物使用，通过PCR，得到烟草ADH-5，UTR 94bp与CinerariaF3，5，H的起始密码子直接连接的DNA片段。将该DNA片段TA克隆到 pCR2. 1上后用XbaI和NdeI酶切，将所得到的DNA片段与将pSPB2774用XbaI和NdeI酶切所得到的载体片段进行连接,得到pBluescript Sk-ADHNF-CinerariaF3，5，H。而后，将用Xl^aI 和 XhoI 酶切 pBluescript Sk-ADHNF_CinerariaF3，5，H 而得到的约1.71Λ的DNA片段与用^CbaI和B10I酶切pCR2. 1而得到的载体片段进行连接，得到 pCR2. 1 ADHNF-CinerariaF3' 5，H。将用 Xl^aI 和 EcoRV 酶切该 pCR2. 1 ADHNF-CinerariaF3，5，H 而得到的 DNA 片段与用 SpeI 及 EcoICRI 酶切 pBI121 HANS-CmF3Hplk-S而得到的双元载体片段进行连接，得到pBI121菊花F3Hprolk: ADHNF-Ci nerariaF3' 5’ H: NOSter。 Mfi^Mf立帛入 Agrobacterium tume faciens EHA105 _。使用该转化土壤杆菌，得到来自菊花品种94-765的重组菊花50系统。在其中37 系统的花瓣中检测出花翠素，花翠素含有率达到36. 2%。实施例7 :pBI121 菊花 F3Hprolk: ADHNF-龙胆 F3，5’ H: NOSter 的制作将以克隆到pBluescript SIT 上的龙胆 F3，5，H(质粒 pG48、W02004/020637 中所述)为模板、将 ADH-Gentian-Fd (5，-CAAGAAAAATAAATGTCACCCATTTACACCACCC-3，，序列号 61)和 SalI-GentianF3，5，H-Rv(5，-GTCGACGCTATTGCTAAGCC-3，，序列号 62)作为引物使用并用PCR扩增的DNA片段以及以pBI221 ADH-221为模板、将)(baI-ADH-Fd(序列号42)和G entian-ADH-Rv(5’-AATGGGTGACATTTATTTTTCTTGATTTCCTTCAC-3’，序列号63)作为引物使用并用PCR扩增的DNA片段的这两种片段进行混合，并将其用作模板，将^CbaI-ADH-Fd (序列号 42)和 SalI-GentianF3，5，H-Rv(5，-GTCGACGCTATTGCTAAGCC-3，，序列号 64)作为引物使用，通过PCR，得到烟草ADH-5，UTR 94bp与龙胆F3，5，H的起始密码子直接连接的DNA片段。 将该DNA片段TA克隆到pCR2. 1上后用)(baI和MlI酶切，将所得到的约400b的DNA片段与用^CbaI和Mil酶切pG48而得到的载体片段进行连接，得到pBluescript SK_ADHNF_龙胆 F3，5’ H。而后，将用XbaI 和 XhoI 酶切 pBluescript SK-ADHNF-龙胆 F3’ 5’ H 而得到的 1. 8kb的DNA片段与用)(bal和BioI酶切pCR2. 1而得到的载体片段进行连接，得到pCR2. 1 ADHNF-龙胆F3，5，H。通过将用XbaI和EcoRV酶切该pCR2. 1 ADHNF-龙胆F3，5，H而得到的DNA片段与用SpeI和EcoICRI酶切pBI121 HANS-CmF3Hplk-S而得到的双元载体片段进行连接，得到PBI121菊花F3Hprolk::ADHNF-龙胆F3，5，H: NOSter0将该质粒导入 Agrobacterium tumefaciens EHA105 株。使用该转化土壤杆菌，得到来自菊花品种94-765的重组菊花21系统，但未得到含有花翠素的个体。实施例8 :pBI121 菊花 F3Hprolk: ADHNF-马鞭草 F3’ 5’ H: NOSter 的制作将以克隆到pBluescriptSIT上的马鞭草F3，5，H(pHVF7、Plant Biotecho nology 23，5-11，2006, DNA 数据库登录号 ABA234898)为模板、将 ADH-Verbena-Fd (5，-CAAGAAAAATA AATGACGTTTTCAGAGCTTATAAAC-3，，序列号 6 和 NcoI_VerbenaF3，5，H-Rv (5，-CCATGGAGTAAA TCAGCATCTC-3，，序列号66)作为引物使用并用PCR扩增的DNA片段以及以pBI221 ADH-221 为模板、将)(baI-ADH-Fd(序列号 42)和 Verbena-ADH-Rv(5‘ -TGAAAACGTCATTTATTTTTCTTG ATTTCCTTCAC-3’，序列号67)作为引物使用并用PCR扩增的DNA片段的这两种片段进行混合，并将其用作模板，将 XbaI-ADH-FcK 序列号 42)和 NcoI-VerbenaF3‘5‘H-Rv(5‘-CCATGGA GTAAATCAGCATCTC-3，，序列号68)作为引物使用，通过PCR，得到烟草ADH_5，UTR 94bp与马鞭草F3’ 5’ H的起始密码子直接连接的DNA片段。将该DNA片段TA克隆到pCR2. 1上后用 XbaI和NcoI酶切，将所得到的约700b的DNA片段与用)(bal和NcoI酶切pHVF7而得到的载体片段进行连接，得到pBluescript SK_ADHNF_马鞭草F3’ 5’ H。而后，将用XbaI和XhoI酶切pBluescript SK-ADHNF-马鞭草F3’ 5’ H而得到的 1. 8kb的DNA片段与用)(bal和BioI酶切pCR2. 1而得到的载体片段进行连接，得到pCR2. 1 ADHNF-马鞭草F3，5，H。通过将用XbaI和EcoRV酶切该pCR2. 1 ADHNF-马鞭草F3，5，H 而得到的DNA片段与用SpeI和EcoICRI酶切pBI121 HANS-CmF3Hplk-S而得到的双元载体片段进行连接，得到PBI121菊花F3Hprolk: ADHNF-马鞭草F3，5，H: NC^ter。将该质粒导 A Agrobacterium tumefaciens EHA105 株。使用该转化土壤杆菌，得到来自菊花品种94-765的重组菊花17系统。在其中11 系统的花瓣中检测出花翠素，花翠素含有率达到最高28. 4%。实施例9 :pBI121 菊花 F3Hprolk: ADHNF-蓝金鱼草 F3’ 5’ H: NOSter 的制作使用Uni-ZAP XR Vector kit (STRATAGENE公司)，通过制造者推荐的方法，使用从作为金鱼草的一种的(Antirrhinum kelloggii，蓝金鱼草)的花蕾中得到的mRNA，制作cDNA文库。将该文库用参考例2中所述的方法进行筛选，得到分别含有F3’5’HcDNA#l (序列号 69)和 F3' 5，HcDNA#12 (序列号 71)的 2 种质粒 pSPB3145 和 pSPB3146。将以pSPB3145 或 pSPB3146 为模板、将 ADH_AkF3，5，H-Fd(5，-CAAGAAAAATAAATGC AGATAATAATTCCGGTCC-3，，序列号 7 和 NsiI_AkF3，5，H-Rv(5，-ATGCATGTCCTCTAACATGTAT C-3’，序列号74)作为引物使用并用PCR扩增的DNA片段以及以pBI221 ADH-221为模板、 将)ftaI-ADH-Fd(序列号 42)和 AkF3，5，H-ADH-Rv (5，-TATTATCTGCATTTATTTTTCTTGATTTCC TTCAC-3’，序列号75)作为引物使用并用PCR扩增的DNA片段的这两种片段进行混合，并将其用作模板，将 XbaI-ADH-FcK 序列号 42)和 NsiI_AkF3，5，H-Rv (5，-ATGCATGTCCTCTAAC ATGTATC-3，，序列号76)作为引物使用，通过PCR，分别得到烟草ADH-5，UTR 94bp与蓝金鱼草(Ak) F3，5，H#1或#12的起始密码子直接连接的DNA片段。将该DNA片段TA克隆到 pCR2. 1上后用^CbaI和NsiI酶切，将所得到的约700b的DNA片段与用)(bal和NsiI酶切 pSPB3145(pBluescript SITAkF3，5，H#l)和 pSPB3146 (pBlu escript SK_AkF3，5，H#12) 而得到的载体片段分别连接，得到pBluescript SK_ADHNF_AkF3，5，H#1及#12。而后，将用XbaI 和 XhoI 酶切 pBluescript SODHNF-AkF3‘ 5，H#1 及 #12 而得到的约700b的DNA片段与用^CbaI及BioI酶切pCR2. 1而得到的载体片段进行连接，得到 pCR2. 1 ADHNF-AkF3，5，H#l 及 #12。将用 XbaI 及 EcoRV 酶切该 pCR2. 1 ADHNF-Ak F3，5，H#1 及#12而得到的DNA片段分别与用SpeI及EcoICRI酶切pBI121 HANS-CmF3Hplk-S而得到的双元载体片段进行连接，得到pBI121菊花F3Hprolk: :ADHNF_AkF3，5，H#1 NOSter及 PBI121 菊花 F3Hprolk: :ADHNF_AkF3，5，H#12: :N(^ter。将这些质粒导入 Agrobacterium tumefaciens EHA105 株。使用该转化土壤杆菌，得到来自菊花品种94-765的重组菊花1系统。在该系统的花瓣中检测出了花翠素，花翠素含有率达到2. 9%。实施例10 :pBI121-菊花 F3Hpro500: ADHNF-CinerariaF3’ 5’ H: NOSter 的制作将用)(bal和 EcoICRI 酶切实施例 1 中所得到的 pBI121 HANS-CmF3Hp500-X 而得到的双元载体的DNA片段与用^CbaI和EcoRV酶切实施例6中所得到的pCR2. 1 ADHNF-CinerariaF3，5，H 而得到的 ADHNF-CinerariaF3，5，H 的 DNA 片段进行连接，得到 PBI121-菊花 F3Hpro500: ADHNF-CinerariaF3，5，H: NOSter,并转化到 Agrobacterium tumefaciens EHA105 株中。使用该转化土壤杆菌，得到来自菊花品种大平的重组菊花7系统。在其中5系统中检测出花翠素，花翠素含有率达到25. 5%。根据本发明，使用来自菊花的黄烷酮3-羟化酶(F3H)的转录调控区域，使类黄酮 3’，5’ -羟化酶(F3’ 5’ H)在菊花中表达，可使花翠素在花瓣中大量积累，使菊花的颜色向蓝色变化。菊花中虽存在白色 黄色 橙色·红色·粉色·紫红色等花色，但在已有品种、 近缘的野生种中没有紫色、蓝色这样的蓝色系的花色，所以，通过本发明所涉及的方法生产的蓝色系菊花可唤起人们新的需求。表 1
2权利要求
1.一种方法，其特征在于，将选自以下(1) 中的核酸作为转录调控区域使用，以使类黄酮3’，5’ -羟化酶即F3’ 5’ H在菊花植物中表达，从而生产在其花瓣中含有花翠素的菊花植物(1)核酸，其含有序列号34或序列号87中所示的碱基序列，(2)核酸，其可作为来自菊花的黄烷酮3-羟化酶基因即F3H基因的转录调控区域而发挥功能，且含有通过1个或数个碱基序列发生附加、缺失及/或取代而对序列号34或序列号87中所示的碱基序列进行修饰的碱基序列，(3)核酸，其可作为来自菊花的黄烷酮3-羟化酶基因即F3H基因的转录调控区域而发挥功能，且为可与由序列号34或序列号87中所示的碱基序列的互补碱基序列所组成的核酸在高严谨条件下杂交的核酸，及(4)核酸，其可作为来自菊花的黄烷酮3-羟化酶基因即F3H基因的转录调控区域而发挥功能，且为与序列号34或序列号87中所示的碱基序列有至少90%序列同一性的核酸。
2.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述类黄酮3’，5’-羟化酶即F3’ 5’ H 来自风铃草、瓜叶菊、马鞭草及三色堇#40。
3.根据权利要求1中所述的方法，其特征在于，不仅使用所述转录调控区域，还进一步使用来自烟草的乙醇脱氢酶的翻译增强子。
4.根据权利要求3中所述的方法，其特征在于，使用所述翻译增强子与所述F3’5’H基因的起始密码子直接连接的表达载体或表达盒。
5.根据权利要求1 4中任一项所述的方法，其特征在于，所述花瓣中花翠素的含有率为花色素合计量的％质量％以上。
6.一种菊花植物或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织，其特征在于，含有权利要求1中所述的核酸或通过权利要求1中所述的方法生产。
7.根据权利要求6中所述的菊花植物或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织，其特征在于，其为切花。
8.一种切花加工品，其特征在于，使用权利要求7中所述的切花。
全文摘要
本发明提供使用来自菊花的黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因的转录调控区域生产在花瓣中含有花翠素的菊花植物的方法、及导入了该调控区域的菊花植物或其后代或其营养繁殖体或其部分或组织、特别是花瓣、切花。本发明涉及将来自菊花的黄烷酮3-羟化酶(F3H)基因的转录调控区域作为转录调控区域使用，以使类黄酮3’，5’-羟化酶(F3’5’H)在菊花植物中表达，从而生产在其花瓣中含有花翠素的菊花植物的方法。
文档编号A01H5/00GK102421903SQ201080018268
公开日2012年4月18日 申请日期2010年3月9日 优先权日2009年4月24日
发明者佐藤早苗, 大宫明美, 田中良和, 野田尚信, 间竜太郎 申请人:三得利控股株式会社, 独立行政法人农业·食品产业技术综合研究机构