专利名称:新的血红蛋白及其用途的制作方法
技术领域:
本发明涉及可用作细胞培养物、器官保存溶液和血液代用品的新的分离的血红蛋白。
背景技术:
本发明涉及血红蛋白及其以简单氧分压固定、携带和释放氧的性质。这种血红蛋白的一种特别的优点是其用作工业和治疗学应用中的氧载体。目前存在两种可行的氧疗法基于血红蛋白的氧载体(HBOC)和全氟化碳(PFC)。直接从红血球中获得的血红蛋白不能用作血管内的氧载体。为了避免血红蛋白的自发破裂和从红血球提取的血红蛋白的毒性,基于血红蛋白的氧载体使用纯化的人血红蛋白(Riess等人Chem Rev 2001,101 2797)、动物(牛)血红蛋白(Lok 等人 Nature 2001,410 :855)或重组(Looker 等人 Nature 1992,356:258)血红蛋白作为原料。然后纯化的血红蛋白的各链与其他球蛋白链共价桥接或用微囊包封。全氟化碳是能溶解大量氧然后递送所述氧的液体氟化烃化合物。然而,在这种情况下氧分压必须高于空气氧分压。出于以下两种主要目的来开发氧疗i)它们可以作为输血的备选方案,从而避免、减少或延迟异体血的输送,和ii)改善供血差的器官的组织氧化。本发明人之前已经表明,多毛纲环节动物沙躅(Arenicola marina)的胞外聚合的血红蛋白可用作氧疗法 (Rousselot等人2006 Biotech Journal 1 :333)。所述血红蛋白可容易地获得并可纯化为避免昂贵合成步骤的均质产物。其也易于贮存且很少会引起免疫原性应答,因为如已经证实的,其不是糖基化的。Zal等人已经提出了来自沙躅的这种胞外血红蛋白的四级结构模型 (Zal等人Eur. J. Biochem 1997,243:85)。该研究表明存在十个亚基其中八个是球蛋白, 包括两个单体(M = 15kDa)和两个由五个二硫键结合的三聚体(T = 49kDa)。其余两条链对应于接头链(L),它们是二硫键结合的,以形成同种或异种二聚物( 50kDa)。这两个单体亚基中的每一个的三个和六个拷贝与三聚体的一个拷贝形成十二聚体亚基(D),其平均质量接近于200kDa。十二个球蛋白链的这种复合物通过42个接头链连接在一起,总质量达到 3648 士 MkDa。当研究另一科的多毛纲环节动物时,本发明人从沙蚕科(Nereididae family) 中分离出一种新的血红蛋白,其具有在若干介质中长期保持稳定性和功能性的优点。属于沙蚕科的蠕虫在从其系统发育开始的若干方面与属于沙躅科的蠕虫不同。从进化观点来看,这两科从几百万年前就彼此有差异(Halanych和Janosik,2006)。此外,这两种环节动物科不具有相同的形态、相同的特性、相同的基因、相同的生理机能,也不具有相同的有机体生物学。例如,沙蚕科是漂浮(errant)物种,而相比较,沙躅属蠕虫生活在潮间区 (intertidal area)上的沙廊道中。此外,沙躅科在其寿命期间再生若干次,而沙蚕科一年再生一次并在再生期后死亡。然后本发明人发现,来自沙蚕科的新的分离的血红蛋白可用作若干应用(特别是用于细胞培养基补充剂)的氧载体、用作器官保存溶液的添加剂或用作用于输送的人造氧载体。发明简述本发明的一个目的是来自属于沙蚕科的蠕虫的分离的血红蛋白或其部分,具有-6-7°C下的 P50 为 5 到 15、优选 9 到 12_ Hg, 16_17°C下的 P50 为 12 到 20、优选 15 到 18mm Hg,且 36_37°C下的 P50 为 20 到 50、优选 30 到 44mm Hg,-优选不含游离半胱氨酸,-优选未糖基化。在本发明的一个实施方式中,所述血红蛋白从沙蚕Nereis virens中分离,Nereis virens 也禾尔为 Nereis diversicola>Neanthes virens 或 Hediste diversicolor (虽然这些学名是不同的,它们指相同的种)或该种的其他同义术语。在另一个实施方式中,所述血红蛋白为水溶液、冷冻溶液、解冻溶液或冻干粉末形式。本发明的另一个目标是含有上述血红蛋白的小袋。本发明的血红蛋白可用作血液代用品。在这种情况下,所述血红蛋白存在于生理学可接受的介质中。“生理学可接受的介质”是指与进入活人血液的体内注射相容的介质。然后所述生理学可接受的介质与人血相容,其不引起任何有害事件并保持本发明血红蛋白的活性。所述血液代用品可存在于任何容器中,例如小袋、瓶子、烧瓶、袋中...所述血红蛋白可以是水溶液、冷冻溶液、解冻溶液或冻干粉末形式。本发明的另一个目的是含有上述血红蛋白的细胞培养基。在一个实施方式中,所述细胞培养基是适于生物生产的培养基。在另一个实施方式中,所述细胞培养基是适于细胞生长的培养基。在另一个实施方式中,所述细胞培养基中的血红蛋白的浓度为至少0. 050g/l。在另一个实施方式中,所述细胞培养基中的血红蛋白的浓度为至少lg/1。本发明的另一个目的是含有所述血红蛋白的保存溶液。在一个实施方式中,所述保存溶液是Viaspan 或Custodiol⑧。在另一个实施方式中,所述保存溶液中的血红蛋白的浓度为至少0. 150g/l。本发明的另一个目的是含有上述血红蛋白的用于输送的人造氧载体。发明详述本发明的一个目的是来自属于沙蚕科(环节动物,多毛纲)的蠕虫的分离的血红蛋白或其部分,具有-6-7°C下的 P5tl 为 5 到 15、优选 9 到 12mm Hg,16_17°C下的 P5tl 为 12 到 20、优选 15 到18讓Hg,且36-37°C下的P5tl为20到50、优选30到44mmHg,-优选不含游离半胱氨酸,-优选未糖基化。在本发明的一个实施方式中,所述血红蛋白是胞外血红蛋白,这是指不包含在细胞内的且溶于血液中的血红蛋白。在本发明的一个实施方式中,所述血红蛋白从属于沙蚕属的蠕虫中分离。在另一个实施方式中,所述血红蛋白从属于沙蚕种Nereis virens (也称为Nereis diversicola、Neanthes virens 或Hediste diversicolor)的蠕虫中分离。
沙蚕属蠕虫可以在潮间区或河口区中收集。尽管它们的俗名是蠕虫,但沙蚕在多种海底栖息地包括砂坪、泥滩、贝壳床和藻席中是常见的。发现一些种类也可在人造结构例如桩材的藤壶和成薄壳状的藻类(污损群落)中生存。沙蚕的分布无所不在,在沿着美国的西海岸、东海岸和海湾海岸以及大部分欧洲海岸的海水和河口水中常见。一些种类可在岩石中的潮间带或高盐度水的泥滩和沙坪中发现。它也是用于养殖鱼或虾的水产业中作为食物补充剂的主要的环节动物种类之一。在本发明的一个实施方式中,所述血红蛋白在6_7°C下的P5tl为5到15、优选9到 12mm Hg,在 16_17°C下的 P50 为 12 到 20、优选 15 到 18mm Hg,且在 36_37°C下的 P50 为 20 到 50、优选 30 到 44mm Hg。P5tl是用于测定呼吸色素与氧的亲合性的参数,其对应于呼吸色素结合位点的 50%氧饱和度。其对应于氧固定至血红素的效率。P5tl可使用hemox技术测定(Toulmond等人,1990 Biol. Bull. 179 :366)。在本发明的另一个实施方式中,所述血红蛋白在6. 65°C下的P50为约10. 98mm Hg,在16. 51°C下的P50为约16. 57mm Hg且在36. 56°C下的P50为37. Ilmm Hg,其中所述 P50的测定方法如下-根据如Paul R.等人,J. Comp. Physiol. 1997,167B,309-408 的题为 Circulation and respiratory control inmillimetre-sized animals(Daphni magna, Folsomia Candida) studied by optical methods所描述的扩散室进行操作;-在以下介质中2.5mMCaCl2、145mM NaCl、0. 2mM MgCl2、4mMKCl、IOmM H印es,用 NaOH将pH调节至7. 35 ;-且所述介质中所述血红蛋白的浓度为30到70mg/ml,优选40到60mg/ml。在本发明的一个实施方式中,所述血红蛋白的分子量为3000000到4000000道尔顿。本发明的另一个目的也是所述血红蛋白的一部分。“所述血红蛋白的一部分”是指所述血红蛋白的片段,其能实现整个血红蛋白的功能,特别是氧运载功能。这种部分优选自下组链、二聚体、三聚体、接头和十二聚体。优选地,对于链和二聚体而言,所述部分的分子量为14000到30000道尔顿;对于三聚体而言,所述部分的分子量为14000到60000道尔顿;对于十二聚体而言,所述部分的分子量为14000到250000道尔顿;对于双十二聚体而言,所述部分的分子量为14000到500000 ;以及从500000到4000000道尔顿。所述分子量可通过在若干角度下的光散射测定(MALLS-多角度激光光散射(Multi Angle Lazer Light Scattering))0在本发明的一个实施方式中,所述血红蛋白包含聚合球蛋白链至少一个单体亚基和至少一个三聚体亚基。优选地,本发明血红蛋白包含一个或两个每个为10到20kDa、更优选每个为15到16kDa的单体和一个40到55kDa、优选48到50kDa的三聚体。本发明血红蛋白也可以包含接头。在一个实施方式中,所述接头的分子量为10到IOOkDa,更优选40 到60kDa。根据一个实施方式,所述接头是二聚体且由两个约20到30kDa、优选22到^kDa 的单体链组成。优选地,根据本发明,所述血红蛋白不含半胱氨酸。优选地,根据本发明,所述血红蛋白也未糖基化。这降低了免疫原性应答的风险。
在本发明的另一个实施方式中,所述血红蛋白在6-7°C下的Ii5tl为1到2、优选1到
1.3,在16-17°C下的n50为1到2. 5、优选1到1. 3且在36_37°C下的n50为1到3、优选1到2。Ii5tl为血红蛋白协同性系数,并定义为用于评估位于位点后结合氧的氧结合能力的参数,n50可用使用hemox技术获得的呼吸色素的氧饱和曲线计算。在本发明的另一个实施方式中,所述血红蛋白在6. 65°C下的n5(1为约1. 19,在 16. 51°C下的n5Q为约1. 17且在36. 56°C下的n50为约1.47,其中所述n5Q根据如(Paul R., 等人,J. Comp. Physiol. 1997,167B,309-408)描写的扩散室操作测定。在本发明的一个实施方式中,上述血红蛋白存在于水溶液、冷冻溶液、解冻溶液或冻干粉末形式的组合物中。在一个实施方式中,本发明血红蛋白保存在贮存缓冲液中。所述贮存缓冲液是可接受的介质。它可以包括 0-2. 5mM CaCl2,0-300mM NaCl、O-ImMMgCl2、0_5mM KC1.0-1M Hepes和/或Tris或能将pH调节至所需值的任何其他缓冲液,并用NaOH将pH调节至 7. 0-7. 8。本发明也涉及含有本发明血红蛋白的水溶液。在一个优选实施方式中,所述溶液中血红蛋白的浓度为0. 050到200mg/ml,优选30到100mg/ml,更优选30到60mg/ml。在本发明的一个实施方式中,含有上述血红蛋白的溶液被配制成pH约为6-8,优选约 7. 0-7. 8。本发明的另一个目的也是含有上述血红蛋白的小袋。在一个实施方式中,本发明的血红蛋白被保存在贮存缓冲液中。所述贮存缓冲液是生理学可接受的介质。它可以包含0-2. 5mM CaCl2,0-300mMNaCl,O-ImM MgCl2、0_5mM KCl.O-lM Hepes和/或Tris或能将pH调节至所需值的任何其他缓冲液,并用NaOH将pH 调节至7. 0-7. 8。本发明人发现,本发明血红蛋白在介质中稳定,其特别适用于细胞培养基。此外, 本发明人意外发现,本发明的血红蛋白促进细胞生长、改善细胞存活率并极大改善重组蛋白的产生。优化细胞培养基从而获得最大量的蛋白和最有效的生产力手段是重组蛋白产生的一个目标,因为任何改善可具有巨大的经济效益。因此,本发明的另一个目的是含有上述血红蛋白的培养基。如本发明所使用,术语“培养基”、“细胞培养基”和“培养基制剂”是指用于在多细胞机体或组织以外的人造环境中维持、生长、繁殖和/或扩增细胞的营养溶液。可优化细胞培养基用于特定培养用途,例如包括,配制成细胞生长培养基以促进细胞的生长或配制成细胞产生培养基以促进重组蛋白的产生。如本发明所使用,适于生物产生的细胞培养基是指配制成促进重组蛋白产生的细胞培养基。所述重组蛋白可以是任何目标蛋白,例如抗体,如抗-TNFa抗体、抗-IL-12抗体、抗-IL-18抗体或抗-EPO受体抗体。培养基的实例包括但不限于Dulbecco改进的Eagle 培养基(DMEM)、DMEM/F12、最小必需培养基(MEM)、基础Eagle培养基(BME)、RPMI 1640、 F-10、F-12、α -最小必需培养基(α -MEM)、Glasgow 最小必需培养基(G-MEM)、PF CHO (SAFC Biosciences)、用于不含蛋白的CHO细胞的Ex-cell 325PF CHO无血清培养基(SAFC Bioscience)和 Iscove' s 改进的 Dulbecco 培养基、CD CHO 培养基。
细胞培养基的实例也包括优化的细胞培养基,例如WO 2008/033517中所描述的那些。这些细胞培养基是含部分A、部分B和部分C的不含血清的细胞培养基,其中a)部分A基本上由改进的基础培养基组成,其不含以下成分碳酸氢钠、缓冲液、 磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂、单糖葡萄糖;b)部分B基本上由无机铁源组成;和c)部分C包含重组生长因子;缓冲液;渗透压调节剂;能源;和至少两种不同的非动物水解产物。优选地,这种不含血清的细胞培养基包括a)改进的基础培养基,其不含以下成分碳酸氢钠、缓冲液、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、渗透压调节剂、表面活性剂和单糖葡萄糖;b)约 8 到 12ml/kg 或 122. 45mg/L 柠檬酸铁;和c)约4到8ml/kg或10到Hmg/kg重组人胰岛素;约5到9g/kg无水葡萄糖;约 0. 5到0. 7g/kg L-谷氨酰胺;约1到2g/kg碳酸氢钠;约1到2g/kg HEPES ;约2到3g/kg NaCl ;约 0. 5 到 2g/kg 表面活性剂(Pluronic F-68);约 0. 01 到 0. lg/kg NaH2PO4-H2O ;约 0. 4到0. 5g/kg Na2HPOffH2O ;约8到12g/kg酵母基水解产物;和约60到70g/kg植物基水解产物。在本发明的一个实施方式中,含有上述血红蛋白的所述细胞培养基用于培养任何种类的细胞、真核生物或原核生物和细胞系。待培养的细胞例如可以是哺乳动物细胞,包括人细胞、鱼细胞、昆虫细胞、软体动物细胞、细菌细胞、环节动物细胞...待培养的细胞种类的实例包括但不限于肾细胞、肝细胞、心脏细胞、肺细胞、肠细胞、胃细胞、结肠细胞、胰腺细胞。在一个实施方式中,优化本发明细胞培养基,以用于表达目标蛋白例如抗体的 CHO(中国仓鼠卵巢细胞)或Sp2/0或PTG2b细胞的生长和/或蛋白产生。在本发明的另一个实施方式中,所述细胞培养基所包含的本发明描述的血红蛋白的浓度为至少0. 05g/l。在本发明的另一个实施方式中,所述培养基所包含的本发明血红蛋白的浓度为至少 0.250g/l。在本发明的另一个实施方式中,所述培养基所包含的本发明血红蛋白的浓度为至少 lg/1。基于待培养的细胞的生理学种类,本领域技术人员能确定添加到特定培养基中的血红蛋白的浓度。所述细胞培养基可存在于任何容器,例如瓶子、烧瓶、袋子...中。本发明人也发现,保存溶液中的本发明血红蛋白能维持细胞存活率和细胞代谢活性,因此保护细胞不受由标准保存所导致的细胞损害。本发明的另一个目的是含有上述血红蛋白的保存溶液。所述保存溶液具有保护细胞不受由标准保存所导致的细胞损害的优点。根据本发明,术语“保存或维持溶液”是指可以保护器官、组织或细胞不受缺血再灌注的有害影响而维持所述器官、组织或细胞的代谢需要的任何溶液。常规保存溶液是水溶液,其包含电解质,例如钾、钠、镁、钙、氯化物、硫酸盐和任选的非渗透性物质,例如甘露醇、棉子糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖酸或葡糖酸,或任选的胶体,例如白蛋白、羟乙基淀粉、聚乙二醇或右旋糖酐40。在一个实施方式中,所述保存溶液包含至少阳离子和氨基酸。在一个实施方式中, 所述保存溶液包含至少二糖盐、三糖、核苷、三肽、黄嘌呤氧化酶抑制剂和淀粉衍生物。在一个实施方式中,所述保存溶液包含至少阳离子、氨基酸和多元醇。常规保存溶液包括但不限于 UW(Viaspan )、IGLl 、Celsior 、SCOTMaco、BMPS Belzer ⑧、 Custodiol ⑥或 Plegisol 。优选地,本发明的保存溶液包含上述血红蛋白Viaspan 。Viaspan 是商业溶液,又名威斯康星大学溶液(UW溶液)。它包含乳糖酸钾 (IOOmM)、KH2P04(25mM)、MgS04(5mM)、棉子糖(30mM)、腺苷(5mM)、谷胱甘肽(3mM)、别嘌呤醇 (ImM)和羟乙基淀粉(50g/L)。Custodiol 是商业溶液,含有钠(15mM)、钾(IOmM)、镁 ^nM)、钙(0. 015mM)、酮戊二酸/谷氨酸(ImM)、组氨酸(198mM)、甘露醇(30mM)和色氨酸QmM);其渗透压为310m0sm/ L0所述保存溶液可存在于任何容器,例如瓶子、烧瓶、袋子...中。在本发明的一个实施方式中,所述保存溶液所包含的上述血红蛋白的浓度为至少 0.005g/l。在本发明的另一个实施方式中,所述保存溶液所包含的上述血红蛋白的浓度为至少 0. 150g/l。在本发明的另一个实施方式中,所述保存溶液所包含的上述血红蛋白的浓度为 0.150g/l 到 5g/l。基于待保存的器官、组织或细胞,本领域技术人员能确定添加到保存溶液中的血红蛋白的浓度。在本发明的一个实施方式中,所述保存溶液的温度可以为2°C到40°C,优选4°C到 37 °C。本发明的保存或维持溶液能够保护,-活组织,例如皮肤;角膜;器官,例如心、肺、肾、肝或胰腺;-器官部分,例如肌肉、胰岛、心瓣膜等;和-组织或器官细胞。这种保护包括在移植到受试者之前的贮存期间免受由缺血和/或缺氧症所引起的损害。对于器官保存,从供体(活的,脑死亡或没有心跳)中移去器官(例如肾脏)而后立即用所述维持溶液浸渍。在死亡后移除的情况下,应该尽快移去器官以阻止缺血性损害, 通常在约30分钟到约90分钟内移去。所述器官在约2°C到约12°C (低体温灌注)优选 40C (冷缺血)的温度下贮存在过量维持溶液中,或贮存在常温灌注中直到随后移植到受试者。体外器官保存领域的发展在过去的四分之一世纪中进展到这样的程度,其中取决于器官的性质,移植器官可以在可变更时期内安全贮存。肾脏可以贮存一到二天04-35小时), 肝和胰腺可以贮存小于一天(10-16/18小时),但是对于心脏的临床接受界限仅为约6小时或更少。现有的维持溶液在各器官的至少最大允许贮存时间内为各种器官提供保护。器官可以以静止或脉动方式保存。在静止方式中,所述器官浸渍在保存溶液中,在脉动方式中, 使用包括泵系统的机器灌注所述器官。除个体组织或器官的保存之外,本发明保存溶液也可用于活供体、尸体包括脑死亡个体的全身保存。在这种方式中,可以实现个体器官及其他组织保存高达8小时或更长。 尸体可以以和本发明所述的用于不流血低体温外科手术的基本上相同的方法处理,除了在低体温温度下引入维持溶液后,所述个体维持在低体温温度下直到一种或多种器官被需要的时间,然后采集以便使用。然后,如果需要,贮存移除的器官,以转移到其他新鲜的维持溶液中。本发明的保存溶液也可用于保存和保护组织例如皮肤免受贮存损害,且可能避免毒素和化学毒性物质的有害影响。因此,所述保存溶液也适用于组织例如皮肤和角膜的贮存,例如,用于随后移植在例如烧伤患者上,以及适用于保护人类皮肤抵抗例如可能存在于被污染的环境中的毒素和毒性物质的有害影响,抵抗化学或细菌战争等。对于保存随后用于移植的皮肤和角膜组织而言,所述组织从供体移去并在4°C下在维持溶液中贮存至少一周和高达约2到4周,直到移植。本发明也提供保存器官或组织或来自所述器官或组织的细胞的方法,包括-在约4°C到37°C,优选约4°C到25 °C,更优选约4°C到15 °C下用本发明的保存溶液洗涤收集后的所述器官或组织或来自所述器官或组织的所述细胞,-在本发明的保存溶液中在约4°C到37°C,优选约4°C到25°C,更优选约4°C到 15°C下以静止方式或动力灌注来保存所述器官或组织或来自所述器官或组织的所述细胞。 保存的时间将取决于如上文所述的器官或组织或细胞的类型。在本发明的一个实施方式中,其中所述器官或组织或细胞从活的或脑死亡的受试者中收集,所述器官或组织或细胞优选在4°C下洗涤和保存。在本发明的另一个实施方式中,其中所述器官或组织或细胞从死于心脏骤停的受试者中收集,所述器官或组织或细胞优选在室温下洗涤和保存。本发明人也发现,本发明血红蛋白在血浆中是稳定的且特别耐受自氧化。红血球代用品的普遍问题之一是其寿命短,因为与红血球的120天的平均滞留时间相比,基于血红蛋白的氧载体的血浆滞留时间对于交联血红蛋白而言为约12h到对于 PEG-血红蛋白而言为约2天。非细胞血红蛋白对氧化和变性特别敏感。氧化的非细胞血红蛋白还可以通过高铁血色原的形成而降解,导致血红素铁的释放和球蛋白链的沉淀,其可能引起内皮和周围组织损伤。已经普遍接受的是,基于血红蛋白的氧载体应具有类似于人血氧载体的性质。与该想法相关,目前阶段III基于血红蛋白的氧载体-血红蛋白glutamer-250(牛)(基于血衾工胃白白勺fii^i本-201 [HB0C-201],Hemopure ; Biopure Corporation, Cambridge, ΜΑ)为用戊二醛聚合的、在平衡的电解质溶液中的牛血红蛋白,其具有36到38mm Hg的P5tl,类似于本发明血红蛋白的P5(l。因此本发明的另一个目的是用于输送的、含有上述血红蛋白的人造氧载体。 如本发明所使用,术语“人造氧载体”是指能替代存在于红血球中的血红蛋白并能进行其作为气体(氧和二氧化碳)转运体的功能的生物产品。所述用于输送的人造氧载体还必须为组织供氧,其中它变得装载有CO2,以在交换表面(肺)释放该气体。所述用于输送的人造氧载体也可以称为血液代用品。本发明的用于输送的人造氧载体具有以下优点它是无毒的,它不含病原体,它在 4°C下至少6周内保持不被氧化,它可输送入所有血型中,它具有足够长的滞留时间以确保其输入的有机体再生天然血红蛋白,且它被其输入的有机体消除。表达“无毒”是指用于输送的人造氧载体不引起免疫反应、过敏性或肾中毒类型的任何病理性紊乱。表达“不含病原体”是指不存在鉴定到的微生物或病毒。不存在病理性紊乱间接暗指不存在病原体。表达“在4°C下至少6周内保持不被氧化”是指涉及氧结合的活性位点和特别是存在于血红素中的铁保持狗2+形式(功能状态)。活性位点的氧化归因于 Fe2+到狗3+的转化,结果后者不再能够结合氧。表达“可输送入所有血型”是指不存在血型分型(ΑΒ0或恒河猴系统)。所述血红蛋白可以被认为是通用的血红蛋白,因为它不是糖基化分子。表达“具有足够长的滞留时间以确保其输入的有机体再生天然血红蛋白”是指在输送之前至少48小时后血系统中存在该血红蛋白。所述时间是足够久的,以使得有机体合成出其自己的红血球。通过图示,在人输送的情况内,有利地,所述时间必须为约48小时。 表达“在无副作用的情况下被其输入的有机体消除”是指所述胞外血红蛋白似乎通过不引起任何特定病理性紊乱的天然手段消除。在脊椎动物中,红血球的寿命持续约120天。然后红血球被细胞吞噬(生理学红血球溶解)。然后血红蛋白被转化为胆绿素和胆红素,其通过胆汁消除。现有技术的产物可能遇到任何一种副作用,尤其是水肿,致免疫性和肾中毒性问题在本发明范围内均不存在。根据一个实施方式,本发明的用于输送的人造氧载体还包含药用可接受的水溶液。优选地,本发明的用于输送的人造氧载体包括上述血红蛋白和人造血浆。如本发明所使用,人造血浆是指可注射的生理性液体,例如血浆容量扩张剂或血浆代用品。人造血菜的实例包括但不限于 Hextend (BioTime,Inc.,Berkeley, CA)。有利地,本发明的用于输送的人造氧载体是不含热源和不含微生物的。本发明也涉及含有本发明的用于输送的人造氧载体的血小袋。优选地,所述血小袋是在约25°C下和外部相对湿度约50%下的氧阻挡膜初级包装(或约0. 155cc/100平方厘米)/ 小时/大气压,在其中密封用于输送的人造氧载体,因此使用于输送的人造氧载体保存在基本上不含氧的环境中。
图1沙蚕血红蛋白的结构分析。
图2大鼠血浆中沙蚕血红蛋白的稳定性。
图3:LDH释放百分比作为沙蚕血红蛋白浓度的函数。
图4代谢活性百分比作为沙蚕血红蛋白浓度的函数。
图5在37°C下细胞培养基中沙蚕血红蛋白的稳定性。
图6在37°C下细胞培养基中沙蚕血红蛋白的稳定性。
图7沙蚕血红蛋白对CHO细胞存活率、生长和蛋白产生的影响。
图8沙蚕血红蛋白对Sp2/0细胞存活率、生长和蛋白产生的影响。
图9沙蚕血红蛋白对PTG2b细胞存活率、生长和蛋白产生的影响。实施例沙蚕血红蛋白样品的提取和纯化从为虾和鱼水产业养殖这些蠕虫的海产畜产业者获得沙蚕种类。将活的沙蚕放血。在冰上收集血样。冷离心(在4°C下15 OOOg离心15min)以去除任何组织残骸, 在-20°C或在液氮中冷冻上清液,或立即纯化。血红蛋白的纯化纯化前,在4°C下以5000g离心解冻样品5min。离心后,通常存在少量残余物; 其被去除。通过使用2. 5*100cm Sephacryl S-400HR柱(GE Healthcare,分离范围为 2xl04-8xl06kDa)低压过滤来纯化上清液。用上述贮存缓冲液(150mM NaCl、2mM CaCl2, 1. 5mM CaCl2、5mM KCl、50mMH印es、pH 7. 2)洗脱样品。所使用速率通常为 0. 4到0. 5ml/min。 在两个波长处监控洗脱物的吸收率280nm(蛋白吸收峰)和414nm(血红蛋白吸收峰)。使用CentriCOn-100(15ml)管或使用分子量保持大于或等于IOOOODa的搅拌细胞来浓缩包含血红素的级份。使用相同方案进行两个纯化过程对于获得纯的级份而言可能是必须的。纯化的样品在0. 2 μ m滤膜上过滤,然后贮存在-80°C。获得的血红蛋白浓度为约50mg/ml且血红蛋白的纯度为95%。样品保持冷冻或保存在液氮下直到使用。凝胶过滤LC分析使用高压HPLC 系统(Waters,milford, MA, USA)在 1x30cm Superose6_C(分级范围为5到5000kDa,GE Healthcare)对5到200 μ 1的注入样品进行分析性凝胶过滤。洗脱缓冲液是PH为7. 2的0. IN的Tris-HCl缓冲液。用光电二极管阵列检测器(Waters 2996) 在250-700nm范围监控洗脱(流速0. 5ml/min)。通过Empower软件(Waters)收集并处理色谱分析数据。通过用Empower软件在414nm(亚铁血红素特有的)和280nm(蛋白特有的)处整合色谱图来确定各亚基的百分比。多-角度-激光-光-散射用 MALLS 检测器(DAWN EOS system, Wyatt Technology Corp.,Santa Barbara, CA, USA)直接在线用HPLC系统和Superose 6柱测定天然血红蛋白的分子量和回转半径。 通过Astra软件(Wyatt Technology Corp.)收集并处理色谱分析数据。Zimm拟合法用于分子量的测定。该方法中,折射率的浓度相关性设置在0. 19ml g—H通常用于人血红蛋白)。 样品保持在4°C下直到在室温下进行洗脱。质谱分析在以IOs/扫描在600-2500的质荷比(m/z)范围内扫描的ESI-Q-TOF(Q-T0F II ; Micromass, Altrincham, UK)质谱仪上获得电喷射数据。在^iin累积数据以生成最终光谱。 将锥电压(反电极到锥孔电压(skimmer voltage))设置在60V。用截留分子量为IOOkDa 的离心过滤器(Amicon Ultra-4,Millipore)用4ml MilliQ水(4°C )使纯化的、天然Hb的 200- μ 1溶液脱盐四次。在非还原Hb、还原Hb和还原且脲基甲基化Hb上进行ESI-MS分析以确定亚基结合成为二硫化物桥接结构。将1 l(v/v)乙腈/水(包含0.2% (ν/ν)甲酸)中的蛋白浓度为0.5yg μΓ1的样品以5μ1 rniiT1引入电喷射源。在室温下在碱性条件下在IOOmM碳酸氢铵的存在下用IOmM DTT还原Hb (0. 9mg ι Γ1)。培养IOmin后,将10-μ 1等分试样与40 μ 1 MilliQ和50 μ 1包含0. 2%甲酸的乙腈混合并通过ESI-MS分析。在还原条件下培养20min后,在室温下用4mM碘乙酰胺分别脲基甲基化Hb(0. 7mg πιΓ1) IOmin和10小时,之后12. 75-μ 1等分试样与37. 75 μ 1 MilliQ和 50 μ 1包含0. 2%甲酸的乙腈混合并通过ESI-MS分析。进行脲基甲基化用于总半胱氨酸的测定。质量标度校准使用来自马心脏肌红蛋白的多电荷系列(multiply charged series) (16951. 7Da;Sigma, St Louis, MO) 0使用装置所提供的基于最大熵的分析来解析原始多电荷ESI-MS谱。分子量是基于由IUPAC给出的元素的原子量。氧结合性使用与阶式\V0Sthoff气体混合泵(Bochum,德国)连接的恒温扩散室 (Colmorgen等人.1997 J Comp. Physiol. 167B :309)在3 μ 1样品上测定氧平衡曲线。所述扩散室置于436nm处的分光计(Hitachi Ul 100)光路上。将基于0. 2到0. 8部分饱和(Y) 的至少三个平衡步骤的氧化数据转化为Hill图(log[Y/l_Y)]对log PO2,其中PO2是氧分压),从而评估半-饱和度氧分压(P5tl)和半-饱和度的Hill协同性系数(Ii5tl)。细胞培养基细胞系和细胞培养条件使用CHO DXBlK 一种二氢叶酸还原酶(dhfr_)和中国仓鼠卵巢细胞系)、SP2/0 和PTG2b。将CHO和SP2/0以0. 5*105个细胞/ml接种在不含血清培养基的摇瓶中,所述培养基为特别设计用于最佳的悬浮生长和蛋白产生,其补充有8mM的L-谷氨酰胺和不同浓度的血红蛋白。细胞在37°C下在摇动的培养器中在不再补给情况下分批生长至少1天,优选至少4天,更优选至少8天。取样和研究参数在接种的第0、1、4、6和8天后移去样品以确定细胞计数、细胞存活率和蛋白的产生。通过台盼蓝排斥技术使用Vi-CELL 分析仪(Beckman Coulter)测定细胞计数和细胞存活率。根据制造商的说明书(ELISA kit, Bethyl Laboratories),使用特别用于要表达 IgG的ELISA试验来测定总的抗体产生。细胞保存细胞系和细胞培养条件使用最初来源于猪肾脏的上皮细胞系-LLC-PKl进行实验。将LLC-PKl细胞在补充有3% SVF、100U/ml青霉素、100μ g/ml链霉素和2mM L-谷氨酰胺的M199介质中进行培养。将LLC-PKl细胞以1. 6. IO5个细胞ml的浓度接种在6孔板中。培养4 后,细胞在PBS中洗涤并在4°C下在1. 2ml的UW溶液(Viaspan )或Custodiol 溶液(单独或在不同浓度的血红蛋白存在下)中保持Mh。细胞存活率检测LDH 测试通过检测乳酸脱氢酶(LDH)测定细胞存活率,因为该酶在细胞中的存在反映质膜的渗透作用及其由此引起的细胞死亡。在保存溶液中保存24h后,去除上清液,细胞在PBS中洗涤3次然后溶解在含有0. 1%的 Triton X-100 的 1. 2ml PBS 中。根据制造商说明书(T0X7,Sigma-Aldrich),使用比色剂量来测定存在于细胞中的 LDH量。490nm和630nm处测得的吸收率Δ与存在于样品中的酶量成正比。MTT 测试MTT测试是用于测定细胞存活率降低的另一种体外细胞存活率测试。在保存溶液中保存24h后,去除上清液且细胞在PBS中洗涤2次。将四唑化合物MTT (3-W,5- 二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基溴化四氮唑)以在PBS中的0. 5mg/ml的浓度添加到孔中,且细胞在37°C下培养30min。MTT被代谢活性细胞还原为不溶的紫色甲暨染料晶体。通过添加 2ml DMSO使该晶体溶解,用分光光度计检测吸光度。在535nm和690nm处测得的吸收率Δ 与细胞的代谢活性成正比。结果结构分析通过MALLS测定分子量和回转半径(图1)。通过ESI-MS测定亚基和多肽链组成(表1)。表权利要求
1.来自属于沙蚕科的环节蠕虫的分离的血红蛋白或其部分,具有-6-7°C下的P50为5到15、优选9到12_ Hg, 16_17°C下的P50为12到20、优选15到 18mm Hg,且 36-37°C 下的 P50 为 20 到 50、优选 30 到 44mm Hg,-优选不含游离半胱氨酸,-优选未糖基化。
2.根据权利要求1所述的血红蛋白或其部分,其来自沙蚕Nereisvirens、沙蚕Nereis diversicola、沙香 Neanthes virens 或沙香 Hediste diversicolor。
3.根据权利要求1或2所述的血红蛋白,其是胞外的且其分子量为3000000到4000000 道尔顿。
4.根据权利要求1到2任一所述的血红蛋白部分,其分子量为14000到30000道尔顿, 优选为14000到60000道尔顿,优选为14000到250000道尔顿,优选为14000到500000道尔顿,优选为500000到4000000道尔顿。
5.根据权利要求1到4任一所述的血红蛋白或其部分,其中它包含-一个或两个每个10到20kDa、更优选每个15到16kDa的单体,-一个40到55kDa、优选48到50kDa的三聚体,和-由两个每个约20到30kDa、优选每个22到^kDa的单体链组成的二聚接头。
6.组合物,其含有根据权利要求1到5任一所述的血红蛋白或其部分,所述组合物为水溶液、解冻溶液或冻干粉末形式。
7.小袋,其含有根据权利要求1到5任一所述的血红蛋白或其部分或权利要求6所述的组合物。
8.细胞培养基,其含有根据权利要求1到5任一所述的血红蛋白或其部分或权利要求 6所述的组合物。
9.根据权利要求8所述的细胞培养基,其中所述细胞培养基是被配制成促进重组蛋白的产生的培养基。
10.根据权利要求8所述的细胞培养基,其中所述细胞培养基是适于细胞生长的培养基。
11.根据权利要求8到10任一所述的细胞培养基,其中所述血红蛋白或其部分的浓度为至少0. 050g/l,优选为至少lg/1。
12.保存溶液,其含有根据权利要求1到5任一所述的血红蛋白或其部分或权利要求6 所述的组合物。
13.根据权利要求12所述的保存溶液,其中所述保存溶液是含有以下成分的水溶液电解质,选自钾、钠、镁、钙、氯化物、硫酸盐;任选的非渗透性物质,选自甘露醇、棉子糖、蔗糖、葡萄糖、果糖、乳糖酸和葡糖酸,和任选的胶体,选自白蛋白、羟乙基淀粉、聚乙二醇或右旋糖酐40。
14.根据权利要求12或13所述的保存溶液,其中所述血红蛋白或其部分的浓度为至少 0.150g/l。
15.用于输送的人造氧载体,其含有根据权利要求1到5任一所述的血红蛋白或其部分或权利要求6所述的组合物。
全文摘要
本发明涉及来自属于沙蚕科的蠕虫的分离的血红蛋白和其在细胞培养基、保存溶液中的用途以及作为用于输送的人造氧载体的用途。
文档编号A01N1/02GK102574901SQ201080030729
公开日2012年7月11日 申请日期2010年5月7日 优先权日2009年5月7日
发明者D·杜戴尔, F·察尔, M·鲁斯洛 申请人:埃玛里纳