耐除草剂大豆植物及鉴定其的方法

专利名称：耐除草剂大豆植物及鉴定其的方法
耐除草剂大豆植物及鉴定其的方法
交叉参考相关申请
本申请要求2010年7月23日提交的美国临时专利申请No. 61/367，251 ;2009年 11月23目提交的美国临时专利申请No. 61/263，707 ;和2009年11月23日提交的欧洲专利申请No. EP09014565. 7的优先权，将所述每一个美国临时专利申请和欧洲专利申请的公开内容通过弓I用整体并入本文。发明领域
本发明涉及转基因大豆植物、植物材料和种子，其特征在于包含至少两个特定的转化事件，具体地在于至少两组编码赋予除草剂抗性的蛋白质的基因的存在，所述基因的组各自位于大豆基因组的特定位置。本发明的大豆植物将耐除草剂表型与在除草剂不存在的情况下等同于非转化大豆品系的不同遗传背景中的农艺性状、遗传稳定性和功能性组合。本发明还提供了用于鉴定包含特定转化事件EE-GM和EE-GM2或EE-GMl的植物材料在生物样品中存在的方法和试剂盒。发明背景
植物中转基因的表型表达可通过基因本身的结构和通 过其在植物基因组中的位置来确定。同时转基因或“外源DNA”在基因组的不同位置上的存在可以以不同方式影响植物的总体表型。通过基因操作将具有商业吸引力的性状在农业或工业上成功能地引入植物视不同的因素而定可以是冗长的过程。遗传转化的植物的实际转化和再生只是一系列选择步骤的第一步，所述一系列选择步骤包括广泛的遗传表征、繁育以及田间试验的评估，最终导致原种事件(elite event)的选择。
基于关于新型食品/饲料、GMO和非-GMO产物的分离以及专利材料(proprietary material)的鉴定的讨论，原种事件的明确鉴定变得日益重要。理想地，这样的鉴定方法快速且简单，无需大量实验室装置。此外，所述方法应当提供使得能够明确鉴定原种事件而无需专家解释，但必要时经历得起专家的细查的结果。本文中描述了用于鉴定生物样品中的原种事件EE-GM3和EE-GMl或EE-GM2的特殊工具。
在本发明中，EE-GM3已在耐除草剂大豆(大豆(Glycine max))的开发中被鉴定为来自转基因大豆植物群体的良种事件，所述耐除草剂大豆包含与赋予对4-羟基苯丙酮酸二氧合酶(HPPD)抑制剂的抗性的基因组合的编码草甘膦抗性的基因，所述基因各自于植物可表达启动子的控制之下。
EE-GMl和EE-GM2先前已被鉴定为在耐除草剂大豆(大豆)的开发中被鉴定为来自转基因大豆植物群体的原种事件，所述转基因大豆包含处于植物可表达启动子的控制之下的编码草胺膦抗性的基因，并且描述于W02006/108674和W02006/108675 (将两个公布通过引用并入本文)中。
本领域已公开了包含耐除草剂基因的大豆植物。然而，现有技术公开内容没有一个教导或提出本发明。
在本领域中已知在大豆植物中获得具有可接受的农艺性状、无产量抑制现象 (yield drag)以及提供足够的除草剂抗性(当然针对3个不同种类的除草剂)的商业耐除草剂原种转化事件绝不简单容易。事实上，已报导市场上发布的具有耐除草剂的第一大豆植物(事件40-3-2)与(近_)等基因系(isogenic line)相比较具有显著的产量抑制现象(Elmore等(2001)Agron. J. 93:408-412)。同样地，Optimum GAT 大豆(事件356043)经开发将对草甘膦的抗性与对ALS除草剂的抗性组合，但已报导此类大豆本身不满足草甘膦抗性的标准(无与另一种草甘膦抗性大豆事件(例如事件40-3-2)的组合(参见例如，www. bloomberg. corri/apps/news p i d=newsarch i ve&s i d=ad4L0hH9MKWE))。本发明的优选实施方案的概述本发明涉及转基因大豆植物、其种子、细胞或组织，所述转基因大豆植物、其种子、细胞或组织包含稳定地整合入其基因组的表达盒(所述表达盒包含含有2mEPSPS基因的编码序列的耐除草剂基因和含有HPH)-PF W336的编码序列的另一种耐除草剂基因(如本文实施例1.1中描述和SEQ ID No I中所示的两个基因))以及第二表达盒(所述第二表达盒包含含有草丁膦乙酰转移酶的编码序列的耐除草剂基因(如实施例1中描述的和SEQ IDNo 11中所示的))。所述转基因大豆植物或其种子、细胞或组织耐受基于草甘膦、基于草铵膦的除草剂以及HPro抑制剂除草剂例如异噁唑草酮，并且在除草剂不存在的情况下，具有大体上与非转基因等基因系相当的农艺性状。在施用一种或多种提供了针对其的抗性的除草剂后，植物将具有与非转基因植物相比较更优的农艺表型。根据本发明，大豆植物或其种子、细胞或组织包括原种事件EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3 和 EE-GM2。更具体地，本发明涉及转基因大豆、其种子、细胞或组织，其基因组DNA的特征在于这样的事实当在本文中描述的PCR鉴定方案中进行分析时，使用分别针对EE-GM3的和EE-GM-3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的两个引物，产生对于EE-GM3有特异性的片段，以及此外当在本文中描述的PCR鉴定方案中分析时，使用分别针对EE-GMl或EE-GM2的和包含草胺膦抗性基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的两个引物，产生对于EE-GMl或EE-GM2有特异性的片段。用于检测EE-GM3的引物可分别针对SEQ IDNO 2内的5’侧翼区域和包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼区域。用于检测EE-GM3的引物还可分别针对SEQ ID N0:3内的3’侧翼区域和包含耐除草剂基因的外源DNA的3’侧翼区域，例如分别包含SEQ ID NO :5和SEQ ID NO :4或SEQ ID No. :7的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列组成的引物，并且产生100至800bp的DNA片段，例如约263bp或706bp的片段。用于检测EE-GMl的引物可分别针对SEQ ID NO : 12和包含耐除草剂基因的外源DNA内的5’侧翼区域。用于检测EE-GMl的引物还可分别针对SEQ IDNO 13和包含耐除草剂基因的外源DNA内的3’侧翼区域，例如分别包含SEQ ID N0:16和SEQ ID NO 17的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列组成的引物，并且产生100至500bp的DNA片段，例如约183bp的片段。用于检测EE-GM2的引物可分别针对SEQ ID NO :14和包含耐除草剂基因的外源DNA内的5’侧翼区域。用于EE-GM2的检测的引物还可分别针对SEQ IDNO: 15和包含耐除草剂基因的外源DNA内的3’侧翼区域，例如，分别包含SEQ ID NO: 18和SEQ ID NO: 19的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列组成的引物，并且产生100至500bp的DNA片段，例如约151bp的片段。
包含本发明的原种事件的EE-GM3的参照种子已在登录号NCMB 41659下保藏在NCMB。包含本发明的原种事件EE-GMl的参照种子已在登录号NCMB 41658下保藏在NCMB。包含本发明的原种事件EE-GM2的参照种子已在登录号NCMB 41660下保藏在NCIMB0包含原种事件EE-GM3和EE-GMl的参照种子已在登录号PTA-11041下保藏在ATCC。包含原种事件EE-GM3和EE-GM2的参照种子已在登录号PTA-11042下保藏在ATCC。本发明的一个实施方案是包含原种事件EE-GM3(以NCMB登录号NCMB 41659保藏的包含所述事件的参照种子)并且还包含原种事件EE-GMl (以NCMB登录号NCMB41658保藏的包含所述事件的参照种子)的种子，或包含事件EE-GM3和EE-GMl的种子(在登录号PTA-11041下保藏在ATCC的包含所述事件的参照种子)，所述种子将生长成耐受至少3种除草剂，特别地耐草甘膦和/或HPH)抑制剂例如异噁唑草酮和/或谷氨酰胺合成酶抑制剂例如草铵膦的大豆植物。本发明的另一个实施方案是包含原种事件EE-GM3(以NCMB登录号NCMB 41659 保藏的包含所述事件的参照种子)并且还包含原种事件EE-GM2(以NCMB登录号NCMB41660保藏的包含所述事件的参照种子)的种子或包含事件EE-GM3和EE-GM2 (在登录号PTA-11042下保藏在ATCC的包含所述事件的参照种子)的种子，所述种子生长成耐受至少3种除草剂，特别地耐受草甘膦和/或HPH)抑制剂例如异噁唑草酮和/或谷氨酰胺合成酶抑制剂例如草铵膦的大豆植物。NCIMB保藏号NCMB 41659的种子是由至少约95%的包含原种事件EE-GM3的转基因种子组成的种子批，所述转基因种子将生长成耐除草剂植物，其中所述植物为耐受草甘膦和/或异噁唑草酮的植物。可播种可获自保藏的种子或从所述种子获得的种子或后代种子(例如，在与其它具有不同遗传背景的大豆植物杂交后)，可用本文中描述的草甘膦或HPro抑制剂例如异噁唑草酮处理正在生长的植物以获得耐受草甘膦或异噁唑草酮的植物，所述植物包含原种事件EE-GM3。NCMB保藏号NCMB 41658和NCMB 41660的种子是分别由至少约95%的包含原种事件EE-GMl或EE-GM2的转基因种子组成的种子批，所述种子可生长成耐除草剂植物，其中所述植物是抗草铵膦植物。可播种种子，用本文中描述的草胺膦处理正在生长的植物以获得耐草胺膦植物，所述植物包含原种事件EE-GMl或EE-GM2。ATCC保藏号PTA-11041的种子是由至少约95%的以纯合子形式包含原种事件EE-GM3和原种事件EE-GMl的转基因种子组成的种子批，所述种子可生长成耐除草剂植物，其中所述植物是耐草甘膦、草胺膦和/或异噁唑草酮(isoxaflutole)植物。可播种可从保藏的种子获得或从所述种子获得(例如，在与具有不同遗传背景的其它大豆植物杂交后)的植物或后代种子，可用本文中描述的草甘膦、草胺膦和/或HPH)抑制剂例如异噁唑草酮处理正在生长的植物以获得耐草甘膦、草胺膦和/或异噁唑草酮植物，所述植物包含原种事件EE-GM3和EE-GM1。ATCC保藏号PTA-11042的种子是由至少约95%的以纯合子形式包含原种事件EE-GM3和原种事件EE-GM2的转基因种子组成的种子批，所述种子将生长成耐除草剂植物，其中所述植物是耐草甘膦、草胺膦和/或异噁唑草酮植物。可播种可从保藏的种子获得或从所述种子获得(例如，在与具有不同遗传背景的其它大豆植物杂交后)的种子或后代种子，可用本文中描述的草甘膦、草胺膦和/或HPH)抑制剂例如异噁唑草酮处理正在生长的植物以获得耐草甘膦、草胺膦和/或异噁唑草酮植物，所述植物包含原种事件EE-GM3 和 EE-GM2。
本发明还涉及来自包含原种事件EE-GM3并且还包括原种事件EE-GMl的植物的细胞、组织、子代和后代，所述植物可通过生长为PTA-11041保藏在ATCC的包含原种事件EE-GM3和EE-GMl的植物获得，或通过生长来自保藏在NCMB的具有登录号NCMB 41659的种子的包含原种事件EE-GM3的植物，然后将所述植物与从保藏在NCMB的具有登录号NCIMB 41658的种子生长而来的包含良种事件EE-GMl的植物杂交来获得。本发明还涉及来自包含原种事件EE-GM3并且还包含原种事件EE-GM2的植物的细胞、组织、后代和后代，所述植物可通过生长以PTA-11042保藏在ATCC的原种事件EE-GM3和EE-GM2的植物来获得，或通过生长来自保藏在NCMB的具有登录号NCMB 41659的种子的包含原种事件EE-GM3的植物，然后将所述植物与从保藏在NCMB的具有登录号NCMB 41660的种子生长而来的包含原种事件EE-GM2的植物杂交来获得。本发明还涉及可从上文中刚刚描述的大豆植物或种子获得的植物(例如通过大豆植物或种子的繁殖和/或与其繁育)。本发明还涉及包含原种事件EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2的大豆植物。 本发明还涉及用于鉴定包含原种事件EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2的转基因、其细胞或组织的方法，所述方法基于鉴定表征DNA序列或由这样的DNA序列编码的氨基酸序列在转基因植物、细胞或组织中的存在。根据本发明的优选实施方案中，这样的表征DNA序列为包含事件的插入位点的至少15bp、15bp、至少20bp、20bp或30bp或更多碱基对的序列，即包含耐除草剂基因的插入的外源DNA的一部分和与其邻接的大豆基因组的一部分(5’或3’侧翼序区域)，从而允许特异性鉴定原种事件。本发明还涉及用于鉴定生物样品中的原种事件EE-GM3和EE-GMl或原种事件EE-GM3和EE-GM2的方法，所述方法基于特异性识别EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’和/或3’侧翼序列的引物或探针。更具体地，本发明涉及这样的方法，所述方法包括使用两个各自利用至少两个引物的聚合酶链式反应或一个利用至少4个引物的聚合酶链式反应扩增存在于生物样品中的两个核酸的序列，优选以获得两个100至SOObp的DNA片段，所述第一引物识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域，所述第二引物识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA内的序列，所述第三引物识别EE-GMl或EE-GM2的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域，所述第四引物识别EE-GMl或EE-GM2的包含耐除草剂基因的外源DNA内的序列。用于鉴定EE-GM3的引物可分别识别EE-GM3的5’侧翼区域内的序列(SEQ ID No. 2，从位置I至位置1451)或EE-GM3的3’侧翼区域内的序列(SEQ IDNo 3的位置241至位置1408的互补序列)和包含耐除草剂基因的外源DNA内的序列(SEQIDNo 2的位置1452至1843或SEQ ID No 3的位置I至位置240的互补序列或SEQ ID No20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638或其互补序列)。识别3’侧翼区域的引物可包含SEQ ID No. 5的核苷酸序列，识别包含耐除草剂基因的外源DNA内的序列的引物可包含本文中描述的SEQ ID No. 4或SEQ ID No. :7的核苷酸序列。用于鉴定EE-GMl的引物可分别识别EE-GMl的5’侧翼区域(SEQ ID No. 12，从位置I至位置209)或EE-GMl的3’侧翼区域内的序列(SEQ ID No 13的位置569至位置1000的互补序列)和EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA内的序列(SEQ ID No 12的位置210至720或SEQ ID No 13的位置I至位置568的互补序列)。识别EE-GMl的5’侧翼区域的引物包含SEQ ID No. 16的核苷酸序列，识别EE-GMl的外源DNA内的序列的引物可包含本文中公开的SEQ ID No. 17的核苷酸序列。用于鉴定EE-GM2的引物可分别识别EE-GM2的5’侧翼区域内的序列(SEQ IDNo. 14，从位置I至位置311)或EE-GM2的3’侧翼区域内的序列(SEQ ID No 15的位置508至位置1880的互补序列)和EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA内的序列(SEQ ID No14的位置312至810的互补序列或SEQ ID No 15的位置I至位置507)。识别EE-GM2的3’侧翼区域的引物可包含SEQ ID No. 18的核苷酸序列，识别EE-GM2的外源DNA内的序列的引物可包含本文中描述的SEQID No. 19的核苷酸序列。可同时或相继进行PCR扩增。本发明更具体地涉及用于鉴定生物样品中的原种事件EE-GM3和EE-GMl的方法，所述方法包括使用聚合酶链式反应，利用至少两个分别包含SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列组成的引物(以获得约263bp的DNA片段)或利用两个分别包含SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 7的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列组成的引物(以获得约706bp的DNA片段)以及使用聚合酶链式反应，利用两个分别包含SEQ ID No. 16和SEQ ID No. 17的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列组成 的引物(以获得约183bp的DNA片段)扩增存在于生物样品中的核酸的至少两个序列。可同时或相继进行两个聚合酶链式反应。本发明更具体地涉及用于鉴定生物样品中的原种事件EE-GM3和EE-GM2的方法，所述方法包括使用聚合酶链式反应，利用两个分别包含SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列组成的引物(以获得约263bp的DNA片段)，或利用两个分别包含SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 7的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列组成的引物(以获得约706bp的DNA片段)，以及使用聚合酶链式反应，利用两个分别包含SEQ ID No. 18和SEQ ID No. 19的核苷酸序列或(基本上)由核苷酸所述序列组成的引物(以获得约151bp的DNA片段)扩增存在于生物样品中的核酸的至少两个序列。可同时或相继进行两个聚合酶链式反应。本发明还涉及与EE-GMl的特异性侧翼序列组合的本文中描述的EE-GM3的特异性侧翼序列，所述序列可用于开发鉴定EE-GM3和EE-GMl在生物样品中的同时存在的特异性鉴定方法。此类组合的特异性侧翼序列还可在鉴定测定中用作参照对照材料。更具体地，本发明涉及与EE-GMl的5’和/或3’侧翼区域组合的EE-GM3的5’和/或3’侧翼序列，所述序列可用于开发本文中进一步描述的特异性引物和探针。还适合用作参照材料的是与核酸分子(所述核酸分子包含可利用包含SEQ ID No. 16和SEQ ID No. 17的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列组成的引物扩增的序列)组合的优选约150-850bp的核酸分子，所述核酸分子可利用包含SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 5的核苷酸序列或SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列组成的引物扩增的序列，特别地使用此类引物在包含EE-GM3和EE-GMl的材料中获得此类核酸分子。本发明还涉及与EE-GM2的特异性侧翼序列组合的本文中描述的EE-GM3的特异性侧翼序列，所述序列可用于开发用于鉴定EE-GM3和EE-GM2在生物样品中的同时存在的特异性鉴定方法。这样的组合的特异性侧翼序列还可在鉴定测定中用作参照对照材料。更具体地，本发明涉及与EE-GM2的5’和/或3’的侧翼区域组合的EE-GM3的5’和/或3’侦^翼区域，所述侧翼区域可用于开发本文中进一步描述的特异性引物和探针。还适合用作参照材料的是与核酸分子(所述核酸分子包含可利用包含EQ ID No. 18和SEQ ID No. 19的核苷酸或(基本上)由所述核苷酸序列组成的引物扩增的序列)组合的优选约150-850bp的核酸分子，所述核酸分子包含可利用包含SEQ ID No. 7和SEQ ID No. 5的核苷酸序列或SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列组成的引物扩增的序列，特别地使用此类引物在包含EE-GM3和EE-GM2的材料中获得此类核酸分子。本发明还涉及基于此类特异性引物或探针的使用鉴定EE-GM3和EE-GMl在生物样品中的同时存在的鉴定方法。用于EE-GM3检测的引物可包含与引物(所述引物包含选自SEQ ID No I的核苷酸序列的17至约200个连续核苷酸的核苷酸序列，例如选自SEQ ID No2的核苷酸1452至核苷酸1843的核苷酸序列的互补序列或SEQ ID No3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列的17至约200个连续核苷酸的核苷酸序列或由或基本上由所述核苷酸序列组成)组合的选自SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列或SEQ ID3的核苷酸241至核苷酸1408的核苷酸序列的互补序列的17至约200个连续核苷酸的核苷酸序列或由或基本由所述核苷酸序列组成。用于EE-GMl检测的引物可包含与引物(所述引物包含选自SEQ ID No 11的核苷酸序列的17至约200个连续核苷酸的核苷酸序列，例如选自SEQ ID No 12的核苷酸219至核苷酸720的核苷酸序列的互补序列或SEQ ID No13的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列的17至约200个连续核苷酸的核苷酸序列或由 或基本上由所述核苷酸序列组成)组合的选自SEQ ID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列或SEQ ID 13的核苷酸569至核苷酸1000的互补序列的17至约200个连续核苷酸的核苷酸序列、由或基本上由所述核苷酸序列组成。引物还可包含位于在它们的最3’末端的这些核苷酸序列，并且还包含无关序列或来源于提及的核苷酸序列但包含错配的序列。本发明还涉及基于此类特异性引物或探针的使用鉴定EE-GM3和EE-GM2在生物样品中的同时存在的方法。用于EE-GM3检测的引物可包含先前段落中描述的17至约200个连续核苷酸的核苷酸序列、由或基本上由所述核苷酸序列组成。用于EE-GM2检测的引物可包含与引物(包含选自SEQ ID No 11的核苷酸序列的17至约200个连续核苷酸的核苷酸序列，例如SEQ ID No 14的核苷酸312至核苷酸810的核苷酸序列的互补序列或SEQ IDNo 15的核苷酸I至核苷酸507的核苷酸序列的17至约200个连续核苷酸的核苷酸序列、由或基本上由所述核苷酸序列组成)组合的选自SEQ ID No 14的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列或SEQ ID 15的核苷酸508至核苷酸1880的核苷酸序列的互补序列的17至约200个连续核苷酸的核苷酸序列、由或基本上由所述核苷酸序列组成。引物还可包含位于它们最3’末端的这些核苷酸序列，并且还包含无关序列或来源于提及的核苷酸序列但包含错配的序列。本发明还涉及用于鉴定生物样品中的原种事件EE-GM3和EE-GMl的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种特异性识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的引物或探针和至少一种特异性识别EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的引物或探针。本发明还涉及用于鉴定生物样品中的原种事件EE-GM3和EE-GM2的试剂盒，所述试剂盒包括至少一种特异性识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的引物或探针和至少一种特异性识别EE-GM2的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的引物或探针。本发明的试剂盒，除了特异性识别EE-GM3的5’或3’侧翼区域或EE-GMl的5’或3’侧翼区域的引物外，还可包括特异性识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA内的序列的其它引物和特异性识别EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA内的序列的其它引物，以用于PCR鉴定方案。本发明的试剂盒，除了特异性识别EE-GM3的5’或3’侧翼区域和EE-GM2的5’或3’侧翼区域的引物外，还可包括特异性识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA内的序列的其它引物和特异性识别EE-GM2的包含耐除草剂基因的外源DNA内的序列的其它引物，以用于PCR鉴定方案。识别EE-GM3的3’侧翼区域的引物可包含SEQ ID No. 5的核苷酸序列并且识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的转基因或外源DNA的引物可包含SEQ ID No. 4或7的核苷酸序列，或与可包含SEQ ID No. 16的核苷酸序列的识别EE-GMl的5’侧翼区域的引物和识别EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA的转基因的引物组合的本文中描述的用于EE-GM3检测的任何其它引物或引物组合可包含SEQ ID No 17的核苷酸序列。
识别EE-GM3的3’侧翼区域的引物可包含SEQ ID No. 5的核苷酸序列，并且识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的转基因或外源DNA的引物可包含SEQ ID No. 4或7的核苷酸序列，或与可包含SEQID No. 18的核苷酸序列的识别EE-GM2的5’侧翼区域的引物和识别EE-GM2的包含耐除草剂基因的外源DNA的转基因的引物组合的本文中描述的用于EE-GM3检测的任何其它引物或引物组合可包含SEQ ID No 19的核苷酸序列。本发明还涉及用于鉴定生物样品中的原种事件EE-GM3和EE-GMl的试剂盒，所述试剂盒包括包含SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 4的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列组成的PCR引物和包含SEQ ID 16和SEQ ID 17的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列组成的PCR引物，以用于基于EE-GM3/EE-GM IPCR的鉴定。本发明还涉及用于鉴定生物样品中的原种事件EE-GM3和EE-GM2的试剂盒，所述试剂盒包括包含SEQ ID No. 5和SEQ ID No. 4的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列组成的PCR引物和包含SEQ ID 18和SEQ ID 19的核苷酸序列或(基本上)由所述核苷酸序列组成的PCR引物，以用于基于EE-GM3/EE-GM2PCR的鉴定。本发明还涉及用于鉴定生物样品中的原种事件EE-GM3和EE-GMl的试剂盒，所述试剂盒包括两种特异性探针，第一探针包含对应于与EE-GM3特异性区域具有80%至100%的序列同一性的序列(或与所述序列互补)的序列或(基本上)由所述序列组成，并且第二探针包含对应于与EE-GMl特异性区域具有80%至100%的序列同一性的序列(或与所述序列互补)的序列或(基本上)由所述序列组成。优选地，第一探针的序列对应于包含EE-GM3的5’或3’侧翼区域的部分的特异性区域并且所述第二探针对应于包含EE-GMl的5’或3’侧翼区域的部分的特异性区域。最优选地，EE-GM3特异性探针包含与SEQ ID No2的核苷酸1441至1462之间的序列具有80%至100%的序列同一性的序列或与ID No. 3的核苷酸220至260之间的序列具有80%至100%的序列同一性的序列或(基本上)由所述序列组成(或与所述序列互补)，并且EE-GMl特异性探针包含与SEQ ID No 12的核苷酸199至220之间的序列具有80%至100%的序列同一性的序列或与SEQ ID No. 13的核苷酸558至579之间的序列具有80%至100%的序列同一性的序列或(基本上)由所述序列组成(或与所述序列互补)。本发明还涉及用于鉴定生物样品中的原种事件EE-GM3和EE-GM2的试剂盒，所述试剂盒包括两种特异性探针，第一探针包含对应于与EE-GM3特异性区域具有80%至100%的序列同一性的序列(或与所述序列互补)的序列或(基本上)由所述序列组成，并且第二探针包含对应于与EE-GM2特异性区域具有80%至100%的序列同一性的序列(或与所述序列互补)的序列或(基本上)由所述序列组成。优选地，第一探针的序列对应于包含EE-GM3的5’或3’侧翼区域的部分的特异性区域并且所述第二探针对应于包含EE-GM2的5’或3’侧翼区域的部分的特异性区域。最优选地，EE-GM3特异性探针包含与SEQ ID No 2的核苷酸1441至1462之间的序列具有80%至100%的序列同一性的序列或与SEQ ID No. 3的核苷酸220至260之间的序列具有80%至100%的序列同一性的序列或(基本上)由所述序列组成(或与所述序列互补)，并且EE-GM2特异性探针包含与SEQ ID No 14的核苷酸301至322之间的序列具有80%至100%的序列同一性的序列或与SEQ ID No. 15的核苷酸497至518之间的序列具有80%至100%的序列同一性的序列或(基本上)由所述序列组成(或与所述序列互补)。 根据本发明的另一个方面，公开了 DNA序列，所述DNA序列包含事件的连接位点和足够长度的大豆基因组DNA和每一个事件的包含耐除草剂基因(转基因)的外源DNA的多 核苷酸以用作用于检测EE-GM3和EE-GMl的引物或探针。此类序列可分别在连接位点的每一侧包含大豆基因组DNA的至少9个核苷酸和EE-GM3或EE-GMl的包含耐除草剂基因(转基因)的外源DNA的相似数目的核苷酸。最优选地，此类DNA序列包含大豆基因组DNA的至少9个核苷酸和与SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3中的连接位点邻接的包含耐除草剂基因的外源DNA的相似数目的核苷酸以及大豆基因组DNA的至少9个核苷酸和与SEQ ID NO 12或SEQ ID NO 13中的连接位点邻接的包含耐除草剂基因的外源DNA的相似数目的核苷酸。根据本发明的另一个方面，公开了 DNA序列，所述DNA序列包含事件的连接位点和足够长度的大豆基因组DNA和每一个事件的包含耐除草剂基因(转基因)的外源DNA的多核苷酸以用作用于检测EE-GM3和EE-GM2的引物或探针。此类序列可分别在插入位点的每一侧包含大豆基因组DNA的至少9个核苷酸和EE-GM3或EE-GM2的包含耐除草剂基因(转基因)的外源DNA的相似数目的核苷酸。最优选地，此类DNA序列包含大豆基因组DNA的至少9个核苷酸和与SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3中的连接位点邻接的包含耐除草剂基因的外源DNA的相似数目的核苷酸以及大豆基因组DNA的至少9个核苷酸和与SEQ ID NO 14或SEQ ID NO 15中的连接位点邻接的包含耐除草剂基因的外源DNA的相似数目的核苷酸。本发明包括的方法和试剂盒可用于不同目的例如但不限于下列目的鉴定EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2在植物、植物材料或产物例如但不限于包含植物材料或来源于植物材料的食品或饲料产品(新鲜的或加工的)中的存在或测定其(下限)阈值；此外或可选择地，为了分离转基因与非转基因材料，可将本发明的方法和试剂盒用于鉴定转基因植物材料；此外或可选择地，可将本发明的方法和试剂盒用于测定包含EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GMl的植物材料的质量(即，纯材料百分比)。本发明还涉及与从EE-GMl或EE-GM2的5’和/或3’侧翼序列开发的特异性引物和探针组合的EE-GM3GM3的5’和/或3’侧翼区域，以及涉及与从EE-GMl或EE-GM2的5’和/或3’侧翼序列开发的特异性引物和探针组合的从EE-GM3的5’和/或3’侧翼序列开发的特异性引物和探针。本发明还涉及从包含原种事件EE-GM3和EE-GMl的植物或包含原种事件EE-GM3和EE-GM2的植物获得的基因组DNA。此类基因组DNA可在本文中描述的鉴定测定中用作参照对照材料。本文中还提供了转基因耐除草剂大豆植物或其细胞、部分、种子或后代，其各自包含至少两个原种事件，所述第一原种事件包含外源DNA，所述外源DNA包含i)包含来自玉蜀黍的在植物可表达启动子的控制下编码耐草甘膦的EPSPS酶的修饰epsps基因的第一嵌合基因，和ii)包含来自突光假单胞菌(Pseudomonas fIuorescen)的编码耐HPF1D抑制剂除草剂的酶的修饰hppd基因的第二嵌合基因，并且所述第二原种事件包含含有源自产绿色
链霉菌(Streptomyces viridochromogene)的在植物可表达的启动子控制下编码草胺膦(或草胺膦)乙酰转移酶的修饰耐草胺膦基因的(第三)嵌合基因。在一个实施方案中，所述第一原种事件包含紧邻所述外源DNA的上游和与其邻接的SEQ ID No 2的核苷酸I至1451以及紧邻所述外源DNA的下游和与其邻接的SEQ ID No3的核苷酸241至1408，并且所述第二事件包含紧邻所述外源DNA的上游和与其邻接的SEQID No 12的核苷酸I至209以及紧邻所述外源DNA的下游和与其邻接的SEQ ID No 13的核苷酸569至1000，或所述第二事件包含紧邻所述外源DNA的上游和与其邻接的SEQ ID No14的核苷酸I至311以及紧邻所述外源DNA的下游和与其邻接的SEQ ID No 15的核苷酸508 至 1880。在其它实施方案中，所述原种事件可通过与从已在保藏号PTA-11041或PTA-11042下保藏在ATCC的包含所述事件的参照种子生长而来的大豆植物繁育获得，或可从已在登录号NCMB 41659下保藏在NCMB的包含所述第一事件的参照种子获得，和可从已在登录号NCMB 41658或NCMB登录号NCMB 41660下保藏在NCMB的包含所述第二事件的参照种子获得。在另一个实施方案中，所述大豆植物、其细胞、部分、种子或后代的基因组DNA，当使用原种事件鉴定方案，利用两个分别包含SEQID No 4和SEQ ID No 5的核苷酸序列分析其所述第一原种事件时，产生约263bp或263bp的DNA片段，当使用原种事件鉴定方案，利用两个分别包含SEQ ID No 16和SEQ ID No 17的核苷酸序列分析其所述第二原种事件时，产生约183bp或183bp的DNA片段，或利用两个分别包含SEQ ID No 18和SEQ ID No 19的核苷酸序列的引物分析时，产生约151bp或151bp的DNA片段。本文中还提供了用于鉴定生物样品中的包含2个原种事件的转基因大豆植物或其细胞、部分、种子或后代的方法，其中所述植物、细胞、种子或后代耐草甘膦、草胺膦和HPPD抑制剂除草剂(例如异噁唑草酮)，所述方法包括使用聚合酶链式反应，利用至少两个引物从存在于生物样品中的所述第一事件的核酸扩增100至500bp的DNA片段，所述引物之一识别上面指定的第一原种事件的5’侧翼区域，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，或识别所述第一原种事件的3’侧翼区域，所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列，所述引物的另一个引物识别所述第一事件的外源DNA内的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列，以及包括使用聚合酶链式反应，利用至少两个引物从存在于生物样品中的所述第二事件的核酸扩增50至IOOObp或100至500bp的DNA片段，所述引物之一识别上面指定的第二原种事件的5’侧翼区域，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No 12的核苷酸I至209的核苷酸序列，或识别所述第二原种事件的3’侧翼区域，所述3’侧翼区域包含SEQID No 13的核苷酸569至1000的互补序列的核苷酸序列，所述引物的另一个引物识别所述第二事件的外源DNA内的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No 12的核苷酸210至核苷酸720的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 13的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列。本文中还提供了用于鉴定生物样品中的包含2个原种事件的转基因大豆植物或其细胞、部分、种子或后代的方法，其中所述植物、细胞、种子或后代耐草甘膦、草胺膦和/或HPro抑制剂除草剂(例如异噁唑草酮)，所述方法包括使用聚合酶链式反应，利用至少两个引物从存在于生物样品中的所述第一事件的核酸扩增50至1000或100至500bp的DNA片段，所述引物之一识别上文中指定的第一原种事件的5’侧翼区域，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，或识别所述第一原种事件的3’侧翼 区域，所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列，所述引物的另一个引物识别所述第一事件的外源DNA内的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列，以及包括使用聚合酶链式反应，利用至少两个引物从存在于生物样品中的所述第二事件的核酸扩增50至IOOObp或100至500bp的DNA片段，所述引物之一识别上文中指定的第二原种事件的5’侧翼区域，所述5’侧翼区域包含SEQ IDNo 14的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列，或识别所述第二原种事件的3’侧翼区域，所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 15的核苷酸508至核苷酸1880的互补序列的核苷酸序列，所述引物的另一个引物识别所述第二事件的外源DNA内的序列，所述外源DNA包含SEQID No 14的核苷酸312至核苷酸810的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 15的核苷酸I至核苷酸507的核苷酸序列。本文中还提供了用于鉴定生物样品中的包含2个原种事件并且耐草甘膦、草胺膦和HPro抑制剂除草剂(例如异噁唑草酮)的转基因大豆植物或其细胞、部分、种子或后代的试剂盒，所述试剂盒包括一种识别上文中指定的第一原种事件的5’侧翼区域的引物，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，或一种识别所述第一原种事件的3’侧翼区域的引物，所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列，一种识别所述第一事件的外源DNA内的序列的引物，所述外源DNA包含SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列，并且所述试剂盒包括一种识别上文中指定的第二原种事件的5’侧翼区域的引物，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列，或一种识别所述第二原种事件的3’侧翼区域的引物，所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互补序列的核苷酸序列，所述引物的另一个引物识别所述第二事件的外源DNA内的序列，所述外源DNA包含SEQID No. 12的核苷酸210至核苷酸720的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列。本文中还提供的用于鉴定生物样品中的包含2个原种事件并且耐草甘膦、草胺膦和HPro抑制剂除草剂(例如异噁唑草酮)的转基因大豆植物或其细胞、部分、种子或后代的试剂盒，所述试剂盒包括一种识别上文中指定的第一原种事件的5’侧翼区域的引物，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，或一种识别所述第一原种事件的3’侧翼区域，所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列，一种识别所述第一事件的外源DNA内的序列的引物，所述外源DNA包含SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列，并且所述试剂盒包括一种识别上文中指定的第二原种事件的5’侧翼区域(所述5’侧翼区域包含SEQ ID No 14的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列)或识别所述第二原种事件的3’侧翼区域(所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 15的核苷酸508至核苷酸1880的互补序列的核苷酸序列)的引物，所述引物的另一种引物识别所述第二事件的外源DNA内的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No. 14的核苷酸312至核苷酸810的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 15的核苷酸I至核苷酸507的核苷酸序列。 本文中还提供了在它们的基因组中包含核酸分子的大豆植物、植物细胞、组织或种子(所述核酸分子包含与SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列、SEQ ID No. 20的核苷酸位置2257至核苷酸位置16601的核苷酸序列或它们的互补序列具有至少97%、98%或至少99%或99. 5%的序列同一性的核苷酸序列或与SEQ ID No. 20或其互补序列具有至少97%、98%或至少99%或99. 5%的序列同一性的核苷酸序列)，以及在它们的基因组中包含核酸分子的大豆植物、植物细胞、组织或种子(所述核酸分子包含与EE-GMl或EE-GM2的核苷酸序列或其互补序列具有至少97%、98%或至少99%或99. 5%的序列同一性的核苷酸序列)，已在保藏号NCMB 41658下保藏的包含EE-GMl的参照种子和已在保藏号NCMB 41660下保藏的包含EE-GM2的参照种子。在本发明的一个实施方案中，所述植物、植物细胞、组织或种子中的EE-GMl或EE-GM2的核苷酸序列是SEQ ID No 12或13中的DNA序列(例如外源DNA序列)，或SEQ ID No 14或15中的DNA序列(例如外源DNA序列)，或包含SEQID No 12的序列的第一核苷酸与SEQ ID No 13的序列的最后一个核苷酸之间的SEQ ID No 12和13的植物基因组(例如在包含本发明的EE-GMl或EE-GM2的保藏的种子中)的DNA序列，或包含SEQ ID No 14的序列的第一核苷酸与SEQ ID No 15的序列的最后一个核苷酸之间的SEQ ID No 14和15的植物基因组的DNA序列。本发明的一个实施方案提供在它们的基因组中包含核酸分子的大豆植物、植物细胞、组织或种子(所述核酸分子与SEQ ID No I的核苷酸序列或其互补序列杂交，或与SEQID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互补序列杂交，或SEQID No. 20的核苷酸序列或其互补序列杂交)，以及在它们的基因组中包含核酸分子的大豆植物、植物细胞、组织或种子(所述核酸分子与EE-GMl或EE-GM2的核苷酸序列或其互补序列杂交)，已在保藏号NCMB 41658下保藏的包含EE-GMl的参照种子和已在保藏号NCMB41660下保藏的包含EE-GM2的参照种子。在本发明的一个实施方案中，所述植物、植物细胞、组织或种子中的EE-GMl或EE-GM2的核苷酸序列是SEQ ID No 12或13中的外源DNA，或SEQID No 14或15中的外源DNA，或包含SEQ ID No 12的序列的第一核苷酸与SEQ IDNo 13的序列的最后一个核苷酸之间的SEQ ID Nol2和13的植物基因组(例如在包含本发明的EE-GMl或EE-GM2的保藏的种子中)的外源DNA序列，或包含SEQ ID No 14的序列的第一核苷酸与SEQ ID No 15的序列的最后一个核苷酸之间的SEQ ID No 14和15的植物基因组的外源DNA序列。附图简述可结合附图(通过引用并入本文)理解无意将本发明限定于描述的特定实施方案的下列实施例，其中


图1 :引用的核苷酸序列与原种事件EE-GM3的引物之间的关系的示意图。黑色条外源DNA ;阴影条植物来源的DNA ;格纹箭头(a):嵌合HPTO PF W366编码基因(关于嵌合基因的组成参见表I);阴影箭头(b):嵌合2mEPSPS编码基因(关于嵌合基因的组成参见表I);黑色箭头寡核苷酸引物，条下的数字表示核苷酸位置；(c)是指显示的核苷酸序列的互补序列；注意示意图未按规定比例绘制。图2 :通过针对EE-GM3开发的PCR鉴定方案获得的结果。凝胶的上样序列泳道1:分子量标准(IOObp梯带);泳道2和3 :来自包含转基因事件EE-GM3的大豆植物的DNA 样品；泳道4-7 :来自未包含原种事件EE-GM3但包含相同的耐除草剂基因(其它转化事件)的转基因大豆植物的DNA样品；泳道8 :来自wt大豆的DNA样品；泳道9 :无模板DNA对照；泳道10 :分子量标准。图3 :引用的核苷酸序列与原种事件EE-GMl的引物之间的关系的示意图。黑色条外源DNA ;阴影条植物来源的DNA ;水平条纹箭头(d):嵌合草胺膦乙酰转移酶编码基因(关于嵌合基因的组成参见SEQ ID No. 11);黑色箭头寡核苷酸引物，条下的数字表示核苷酸位置；(c)是指显示的核苷酸序列的互补序列。注意示意图未按规定比例绘制。图4 :引用的核苷酸序列与原种事件EE-GM2的引物之间的关系的示意图。黑色条外源DNA ;阴影条植物来源的DNA ;水平条纹箭头(d):嵌合草胺膦乙酰转移酶编码基因(关于嵌合基因的组成参见SEQ ID No. 11);黑色箭头寡核苷酸引物，条下的数字表示核苷酸位置；(c)是指显示的核苷酸序列的互补序列。NA :不适用的；注意示意图未按规定比例绘制。图5 :针对EE-GMl开发的PCR鉴定方案。凝胶的上样序列泳道1:来自包含转基因事件EE-GMl的大豆植物的DNA样品；泳道2 :来自未包含原种事件EE-GMl的转基因大豆植物的DNA样品；泳道3 :来自野生型大豆植物的对照DNA样品；泳道4 :无模板DNA对照；泳道5 :分子量标准。图6 :针对EE-GM2开发的PCR鉴定方案。凝胶的上样序列泳道1:来自包含转基因事件EE-GM2的大豆植物的DNA样品；泳道2 :来自未包含原种事件EE-GM2的转基因大豆植物的DNA样品；泳道3 :来自野生型大豆植物的对照DNA样品；泳道4 :无模板DNA对照；泳道5 :分子量标准。本发明的优选实施方案的详细描述重组DNA分子在植物基因组中的组合通常由细胞或组织的转化产生。整合的具体位点通常归因于随机整合。作为用重组DNA或“转化DNA”转化植物细胞或组织的结果而被引入植物基因组的和源自这样的转化DNA的DNA在下文中称为包含一个或多个“转基因”的“外源DNA”。EE-GM3的转基因是草甘膦和HPH)抑制剂耐除草剂基因。在本发明的说明书中“植物DNA”将指源自已被转化的植物的DNA。植物DNA通常见于对应的野生型植物的相同基因座中。外源DNA的特征可在于重组DNA分子在植物基因组中整合的位点上的定位和构型。其中已插入了重组DNA的植物基因组中的位置也称为“插入位点”或“靶位点”。可将重组DNA至称为“插入前植物DNA”的植物基因组的区域中的插入与植物DNA的缺失(称为“靶位点缺失”)结合。如本文中所用，“侧翼区域”或“侧翼序列”是指与引入的DNA不同的至少20bp，优选至少50bp和达到5000bp的DNA的序列，优选来自植物基因组的恰好位于外源DNA的上游并且与其邻接或恰好位于外源DNA的下游并且与其邻接的DNA。导致外源DNA的随机整合的转化方法将导致具有不同侧翼区域的转化体，所述侧翼区域对于每一个转化体是特征性的和独特的。当通过常规杂交将重组DNA引入植物时，其在植物基因组中的插入位点或其侧翼区域将通常不被改变。如本文中所用，“分离的核酸(序列)”或“分离的DNA (序列)”是指不再存在于其所分离自的天然环境中的核酸或DNA(序列)，例如，在另一种细菌宿主或植物基因组中的核酸序列，或融合至来自另一种来源的DNA或核酸的核酸或DNA，例如当包含在处于植物可表达启动子的控制之下的嵌合基因中时。
事件定义为(人工)基因座，所述基因座，作为基因工程的结果，携带包含至少一个拷贝的目标基因的外源DNA或转基因。事件的常见等位基因状态为外源DNA的存在或不存在。事件的表型特征在于转基因的表达。在基因水平上，事件是植物的基因组成的部分。在分子水平上，事件的特征在于限制性图谱(例如，通过Southern印迹确定的)，在于转基因的上游和/或下游侧翼序列、分子标志的定位和/转基因的分子构型。通常地，用包含至少一个目标基因的DNA转化植物产生包含许多分离事件的转化体群体，所述每一个转化体是独特的。事件的特征在于外源DNA和侧翼序列的至少一个序列。如本文中所用，原种事件是基于转基因的表达和稳定性以及其与包含其的植物的最佳农艺特征的相容性，从通过利用相同转化DNA的转化获得的一组事件选择的事件。因此用于原种事件选择的标准是如下的一项或多项，优选两项或更多项，有利地所有项a)外源DNA的存在不削弱植物的其它期望的特征，例如与农艺性状或商业价值相关的特征；b)事件的特征在于明确确定的分子构型，所述分子构型可稳定地遗传并且可针对其开发用于身份控制(identity control)的适当工具；c)目标基因在携有所述事件的植物可能在正常农艺应用中所暴露的许多环境条件下，以商业可接受的水平在事件的杂合子(或半合子)和纯合子条件中都显示正确的、适当的和稳定的空间和时间表型表达。优选地，将外源DNA与植物基因组中的位置连接，所述位置使得能够容易地进行至期望的商业遗传背景中的基因渗入。通过在不同的相关遗传背景中进行原种事件的基因渗入，然后观察对1、2个或所有标准例如上述a)、b)和c)的顺应性来将事件的状态确认作为原种事件。因此“原种事件”是指满足上述标准的包含外源DNA的基因座。植物、植物材料或后代例如种子可在其基因组中包含一个或多个原种事件。开发用于鉴定原种事件或包含原种事件的植物或植物材料或包含含有原种事件的植物材料的产物的工具基于原种事件的特定基因组特征，例如包含外源DNA的基因组区域的特定限制性图谱、分子标志或外源DNA的侧翼区域的序列。
一旦已对外源DNA的一个或两个侧翼区域进行了测序，则可利用分子生物学技术开发特异性识别样品的核酸(DNA或RNA)中的该(这些)序列的引物和探针。例如，可开发PCR法来鉴定生物样品(例如植物、植物材料或包含植物材料的产物的样品)中的原种事件。这样的PCR基于至少两个特异性“引物”，一个识别原种事件的5’或3’侧翼区域内的序列并且另一个识别外源DNA内的序列。引物优选具有15至35个核苷酸的序列，所述序列在最优化的PCR条件下分别“特异性识别”原种事件的5’或3’侧翼区域和原种事件的外源DNA内的序列，以便从包含原种事件的核酸样品扩增特异性片段(“整合片段”或鉴别扩增子(discriminating amp I icon)) 0这意味着在最优化的PCR条件下只有祀向整合片段而无植物基因组或外源DNA中的其它序列被扩增。适用于EE-GM3的鉴定的PCR引物可以是下列序列-长度范围为17nt至约200nt的寡核苷酸，其在它们的3’末端上包含选自5’侧翼序列(SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451)中的植物DNA的至少17个连续核苷酸，优选20个连续核苷酸的核苷酸序列(识别5’侧翼序列的引物)；或-长度范围为17nt至约200nt的寡核苷酸，其在它们的3’末端上包含选自3’侧翼序列(SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列)中的植物DNA的至少17个连续核苷酸，优选20个连续核苷酸的核苷酸序列(识别3’侧翼序列的引物)；或-长度范围为17nt至约200nt的寡核苷酸，其在它们的3’末端上包含选自插入的DNA序列(SEQ ID No 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列)的至少17个连续核苷酸，优选20个连续核苷酸的核苷酸序列(识别外源DNA的引物)；或-长度范围为17nt至约200nt的寡核苷酸，其包含选自插入的DNA序列(SEQIDNo 3的核苷酸I至核苷酸240)的至少17个连续核苷酸，优选20个连续核苷酸的核苷酸序列；或-长度范围为17nt至约200nt的寡核苷酸，其包含选自插入的DNA片段或其互补序列(SEQ ID No I或SEQ ID No 20的核苷酸位置1452至16638)的核苷酸序列的至少17 个连续核苷酸，优选20个连续核苷酸的核苷酸序列。所述引物当然可以比提及的17个连续核苷酸长，可以例如为20、21、30、35、50、75、100、150、200nt长或甚至更长。引物可完全由选自提及的侧翼序列和外源DNA序列的核苷酸序列的核苷酸序列组成。然而，引物在它们的5’末端(即定位在3’的17个连续核苷酸之外的)上的核苷酸序列不太重要。因此，引物的5’序列可视情况而定包含选自侧翼序列或外源DNA的核苷酸序列或由所述序列组成，但可包含几个(例如，1、2、5或10)错配。引物的5’序列甚至可完全为与侧翼序列或外源DNA无关的核苷酸序列，例如代表一个或多个限制性内切酶识别位点的核苷酸序列。此类无关序列或具有错配的侧翼DNA序列应当优选不长于100，更优选不长于50或甚至25个核苷酸。此外，适当的引物可在它们的3’末端包含横跨植物DNA源性序列与外源DNA序列之间的连接区(位于EE-GM3的SEQ ID No 2的核苷酸1451-1452和SEQ ID No 3的核苷酸240-241上)的核苷酸序列或由或基本上由所述核苷酸序列组成，只要提及的定位在3’的17个连续核苷酸不仅仅来源于SEQ ID No 2或3中的外源DNA或植物源性序列。对于本领域技术人员也立即明白的是恰当选择的PCR引物不应当包含彼此互补的序列。
为了本发明的目的，“SEQ ID No X中所示的核苷酸序列的互补序列”是可通过按照沙加夫法则(AeT; GeQ)用它们的互补核苷酸替代核苷酸并且以5’至3’方向，即以
所示的核苷酸序列的相反方向读取序列从所示核苷酸序列衍生的核苷酸序列。适用于EE-GM3的引物的实例是SEQ ID No 5(3’侧翼序列识别引物)、SEQ ID No4(与3’侧翼序列识别引物一起使用的外源DNA识别引物)或SEQ ID No 7(与3’侧翼序列识别引物一起使用的外源DNA识别引物)的寡核苷酸序列。适用于EE-GM3的寡核苷酸引物的其它实例在它们的3’末端包含下列序列或(基本上)由此类序列组成a. 5’侧翼序列识别引物-SEQ ID No 2的核苷酸264至核苷酸283的核苷酸序列 -SEQ ID No 2的核苷酸266至核苷酸285的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1240至核苷酸1259的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸265至核苷酸285的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸265至核苷酸283的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1239至核苷酸1259的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1241至核苷酸1259的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1244至核苷酸1263的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1248至核苷酸1267的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1250至核苷酸1269的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸262至核苷酸279的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸263至核苷酸279的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸264至核苷酸285的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸266至核苷酸283的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1238至核苷酸1259的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1242至核苷酸1259的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1243至核苷酸1263的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1245至核苷酸1263的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1247至核苷酸1267的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1249至核苷酸1269的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1249至核苷酸1267的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸263至核苷酸285的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸267至核苷酸283的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1242至核苷酸1263的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1243至核苷酸1259的核苷酸序列--SEQ ID No 2的核苷酸1246至核苷酸1267的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1246至核苷酸1263的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1248至核苷酸1269的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1250至核苷酸1271的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1250至核苷酸1267的核苷酸序列
-SEQ ID No 2的核苷酸1241至核苷酸1263的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1245至核苷酸1267的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1247至核苷酸1269的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1247至核苷酸1263的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1249至核苷酸1271的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1242至核苷酸1261的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1241至核苷酸1261的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1243至核苷酸1261的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1240至核苷酸1261的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1244至核苷酸1261的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1239至核苷酸1261的核苷酸序列-SEQ ID No 2的核苷酸1245至核苷酸1261的核苷酸序列b.与5’侧翼序列识别引物一起使用的外源DNA序列识别引物-SEQ ID No 2的核苷酸1732至核苷酸1751的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1735至核苷酸1754的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1731至核苷酸1750的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1732至核苷酸1750的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1732至核苷酸1752的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1731至核苷酸1749的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1732至核苷酸1749的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1731至核苷酸1751的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1732至核苷酸1753的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1731至核苷酸1748的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1732至核苷酸1748的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1735至核苷酸1751的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1731至核苷酸1752的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1732至核苷酸1754的核苷酸序列的互补序列SEQ ID No 2的核苷酸1731至核苷酸1747的核苷酸序列的互补序列SEQ ID No 2的核苷酸1731至核苷酸1753的核苷酸序列的互补序列SEQ ID No 2的核苷酸1727至核苷酸1746的核苷酸序列的互补序列SEQ ID No 2的核苷酸1727至核苷酸1745的核苷酸序列的互补序列SEQ ID No 2的核苷酸1727至核苷酸1747的核苷酸序列的互补序列SEQ ID No 2的核苷酸1727至核苷酸1744的核苷酸序列的互补序列SEQ ID No 2的核苷酸1727至核苷酸1748的核苷酸序列的互补序列SEQ ID No 2的核苷酸1727至核苷酸1749的核苷酸序列的互补序列SEQ ID No 2的核苷酸1726至核苷酸1745的核苷酸序列的互补序列SEQ ID No 2的核苷酸1726至核苷酸1744的核苷酸序列的互补序列SEQ ID No 2的核苷酸1726至核苷酸1746的核苷酸序列的互补序列SEQ ID No 2的核苷酸1726至核苷酸1747的核苷酸序列的互补序列
SEQ ID No 2的核苷酸1726至核苷酸1748的核苷酸序列的互补序列SEQ ID No 2的核苷酸1724至核苷酸1744的核苷酸序列的互补序列SEQ ID No 2的核苷酸1724至核苷酸1745的核苷酸序列的互补序列SEQ ID No 2的核苷酸1724至核苷酸1746的核苷酸序列的互补序列SEQ ID No 2的核苷酸1461至核苷酸1478的核苷酸序列的互补序列SEQ ID No 2的核苷酸1670至核苷酸1686的核苷酸序列的互补序列SEQ ID No 2的核苷酸1469至核苷酸1486的核苷酸序列的互补序列 -SEQ ID No 2的核苷酸1508至核苷酸1527的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1667至核苷酸1686的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1670至核苷酸1687的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1673至核苷酸1689的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1688至核苷酸1704的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1688至核苷酸1705的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1692至核苷酸1709的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1467至核苷酸1486的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1481至核苷酸1497的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1481至核苷酸1498的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1491至核苷酸1507的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1491至核苷酸1508的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1672至核苷酸1688的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1673至核苷酸1690的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1673至核苷酸1691的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1688至核苷酸1706的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1691至核苷酸1707的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1691至核苷酸1708的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1469至核苷酸1487的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1481至核苷酸1499的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1489至核苷酸1505的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1489至核苷酸1506的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1489至核苷酸1507的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1489至核苷酸1508的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1666至核苷酸1686的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1667至核苷酸1687的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1670至核苷酸1688的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1672至核苷酸1689的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1688至核苷酸1707的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1691至核苷酸1709的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1692至核苷酸1710的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No 2的核苷酸1481至核苷酸1500的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No2的核苷酸1491至核苷酸1509的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1670至核苷酸1689的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1672至核苷酸1690的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1672至核苷酸1691的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1687至核苷酸1705的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1687至核苷酸1706的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1691至核苷酸1710的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1472至核苷酸1488的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No2的核苷酸1488至核苷酸1507的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1491至核苷酸1510的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1495至核苷酸1512的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1495至核苷酸1513的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1495至核苷酸1514的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1673至核苷酸1692的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1678至核苷酸1694的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1678至核苷酸1695的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1678至核苷酸1696的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1687至核苷酸1703的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1687至核苷酸1704的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1692至核苷酸1711的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1469至核苷酸1488的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1488至核苷酸1506的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1491至核苷酸1511的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1670至核苷酸1690的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1678至核苷酸1697的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1688至核苷酸1709的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1467至核苷酸1487的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1488至核苷酸1508的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1495至核苷酸1511的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1491至核苷酸1512的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1666至核苷酸1687的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1667至核苷酸1688的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1672至核苷酸1692的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1673至核苷酸1693的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1687至核苷酸1707的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1472至核苷酸1490的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1472至核苷酸1491的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1481至核苷酸1501的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1489至核苷酸1509的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No2的核苷酸1495至核苷酸1515的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1670至核苷酸1691的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1673至核苷酸1694的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1678至核苷酸1698的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1469至核苷酸1489的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1667至核苷酸1689的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1687至核苷酸1708的核苷酸序列的互补序列·-SEQ ID No2的核苷酸1688至核苷酸1710的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1691至核苷酸1711的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1472至核苷酸1492的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1489至核苷酸1510的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1666至核苷酸1688的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1687至核苷酸1709的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1692至核苷酸1712的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1467至核苷酸1488的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1469至核苷酸1490的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1488至核苷酸1509的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1489至核苷酸1511的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1678至核苷酸1699的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1472至核苷酸1493的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1472至核苷酸1494的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1481至核苷酸1502的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1670至核苷酸1692的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1469至核苷酸1491的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1488至核苷酸1510的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1691至核苷酸1712的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1692至核苷酸1713的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1692至核苷酸1714的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1467至核苷酸1489的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1678至核苷酸1700的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1481至核苷酸1503的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No2的核苷酸1691至核苷酸1713的核苷酸序列的互补序列c.3’侧翼序列识别引物-SEQ ID No3的核苷酸828至核苷酸847的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸830至核苷酸849的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸828至核苷酸846的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸828至核苷酸848的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸830至核苷酸848的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸830至核苷酸850的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No3的核苷酸828至核苷酸845的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸830至核苷酸847的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸828至核苷酸849的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸830至核苷酸851的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸828至核苷酸844的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸830至核苷酸846的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸828至核苷酸850的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸830至核苷酸852的核苷酸序列的互补序列
-SEQ ID No3的核苷酸992至核苷酸1009的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸731至核苷酸752的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸776至核苷酸795的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸731至核苷酸753的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸776至核苷酸794的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸776至核苷酸796的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸776至核苷酸793的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸776至核苷酸797的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸776至核苷酸792的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸776至核苷酸798的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸733至核苷酸752的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸733至核苷酸753的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸733至核苷酸754的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸733至核苷酸755的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸838至核苷酸854的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸246至核苷酸263的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸838至核苷酸855的核苷酸序列的互补序列-SEQ ID No3的核苷酸245至核苷酸264的核苷酸序列的互补序列d.与3’侧翼序列识别引物一起使用的外源DNA序列识别引物-SEQ ID No3的核苷酸173至核苷酸192的核苷酸序列-SEQ ID No3的核苷酸22至核苷酸41的核苷酸序列-SEQ ID No3的核苷酸172至核苷酸192的核苷酸序列-SEQ ID No3的核苷酸174至核苷酸192的核苷酸序列-SEQ ID No3的核苷酸191至核苷酸210的核苷酸序列-SEQ ID No3的核苷酸171至核苷酸192的核苷酸序列-SEQ ID No3的核苷酸175至核苷酸192的核苷酸序列-SEQ ID No3的核苷酸190至核苷酸210的核苷酸序列-SEQ ID No3的核苷酸192至核苷酸210的核苷酸序列-SEQ ID No3的核苷酸176至核苷酸192的核苷酸序列-SEQ ID No3的核苷酸189至核苷酸210的核苷酸序列-SEQ ID No3的核苷酸193至核苷酸210的核苷酸序列
-SEQ ID No 3的核苷酸188至核苷酸210的核苷酸序列-SEQ ID No 3的核苷酸194至核苷酸210的核苷酸序列-SEQ ID No 3的核苷酸199至核苷酸218的核苷酸序列-SEQ ID No 3的核苷酸200至核苷酸218的核苷酸序列-SEQ ID No 3的核苷酸197至核苷酸218的核苷酸序列-SEQ ID No 3的核苷酸201至核苷酸218的核苷酸序列
-SEQ ID No 3的核苷酸201至核苷酸220的核苷酸序列-SEQ ID No 3的核苷酸200至核苷酸220的核苷酸序列-SEQ ID No 3的核苷酸199至核苷酸220的核苷酸序列-SEQ ID No 3的核苷酸200至核苷酸221的核苷酸序列-SEQ ID No 3的核苷酸199至核苷酸221的核苷酸序列-SEQ ID No 3的核苷酸150至核苷酸172的核苷酸序列适用于鉴定EE-GMl的PCR引物已描述于W02006/108674中，特别是在第8页第4行至第26页第7行(通过引用并入本文)。适用于鉴定EE-GM2的PCR引物已描述于W02006/108675中，特别是在第8页第4行至第33页第4行(通过引用并入本文)。如本文中所用，“SEQ ID No. Z的位置X至位置Y的核苷酸序列”表示包含两个核苷酸终点的核苷酸序列。优选地，扩增片段具有50至500个核苷酸的长度，例如，100至350个核苷酸的长度。特异性引物可具有分别与原种事件以及原种事件的外源DNA的5’或3’侧翼区域内的序列具有80至100%的同一性的序列，只要错配仍然允许在最优化的PCR条件下利用这些引物特异性鉴定所述原种事件。然而可允许的错配的范围可由本领域技术人员凭经验容易地确定或对于本领域技术人员来说是已知的。整合片段的检测可以以各种方式进行，例如通过凝胶分析后进行大小评估。还可对整合片段进行直接测序。用于检测扩增的DNA片段的其它序列特异性方法在本领域也是已知的。由于引物的序列及其在基因组中的相对位置对于原种事件是独特的，因此整合片段的扩增将只在包含原种事件(的核酸)的生物样品中发生。优选地，当进行PCR以鉴定原种事件EE-GM3和EE-GMl或原种事件EE-GM3和EE-GM2在未知样品中的存在时，将对照包括在一组引物中，可利用所述引物扩增所述事件的植物物种的“管家基因”内的片段。管家基因是在大多数细胞类型中表达并且与对于所有细胞是共同的基础代谢活性有关的基因。优选地，从管家基因扩增的片段大于扩增的整合片段。取决于待分析的样品，可包括其它对照。标准PCR方案描述于本领域中，例如描述于’ PCR扩增手册〃 (Roche MolecularBiochemicals,第2版，1999)和其它参考资料中。在针对每一个原种事件的“PCR(或聚合酶链式反应)鉴定方案”中指定了用于PCR的最佳条件，包括特异性引物的序列。然而应理解，针对具体的实验条件可能需要调整PCR鉴定方案的许多参数，或略微改变所述参数以获得相似的结果。例如，使用不同的方法制备DNA可能需要调整例如所使用的引物、聚合酶的量和退火条件。类似地，其它引物的选择可确定用于PCR鉴定方案的其它最佳条件。然而这些调整对于本领域技术人员来说是显然的，并且在现有PCR应用手册例如上文中引用的手册中进行进一步详细说明。或者，特异性引物可用于扩增可用作用于鉴定生物样品中的EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2的“特异性探针”的整合片段。在允许探针与样品核酸中的它们的对应片段杂交的条件下将生物样品的核酸与探针接触，导致核酸/探针杂交体的形成。可检测(例如通过核酸或探针的标记)这类杂交体的形成，其中这类杂交体的形成表示存在EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2。基于与特异性探针(在固相载体上或在溶液中)杂交的此类鉴定方法已在本领域中进行了描述。特异性探针优选是在最优化条件下与原种事件的5’或3’侧翼区域内的区域(优选还包含与其邻接的外源DNA的部分(在下文中称为“特异性区域”))特异性杂交的序列。优选， 特异性探针包含与特异性区域的核苷酸序列具有至少80%、优选80至85%、更优选85至90%、特别优选90至95%、最优选95%至100%的同一性(或互补)的50至500bp，优选100至350bp的序列。优选地，所述特异性探针将包含与原种事件特异性区域具有同一性(或互补)的约15至约100个连续核苷酸的序列。此外，还可使用本文中提供的原种事件特异性序列信息来开发对于原种事件EE-GM3和EE-GMl或对于原种事件EE-GM3和EE-GM2是特异的检测方法，所述方法与基于PCR的扩增法不同。此类替代检测方法包括基于特定核酸结构的侵入切割(invasive cleavage)的线性信号放大检测法,也称为InvaderTM技术(如例如美国专利5，985，557 “Invasive Cleavage of Nucleic Acids”，6，001，567 “Detection of NucleicAcid sequences by Invader Directed Cleavage”中所描述的，通过引用并入本文)。为了利用该方法进行EE-GM3检测，靶序列可与包含SEQ ID No 2的核苷酸1452至核苷酸1469的核苷酸序列或其互补序列的标记的第一核酸寡核苷酸或包含SEQ ID No 3的核苷酸223至核苷酸240的核苷酸序列或其互补序列的所述标记核酸探针杂交，并且还可与包含SEQID No 2的核苷酸1434至核苷酸1451的核苷酸序列或其互补序列的第二核酸寡核苷酸或包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸258的核苷酸序列或其互补序列的所述标记核酸探针杂交，其中所述第一寡核苷酸与第二寡核苷酸重叠至少一个寡核苷酸。通过该杂交产生的双链体或三链体结构允许利用酶<Cleavase )进行选择性探针切割，从而使靶序列保持完整。随后可能地通过导致进一步信号放大的中间步骤检测切割的标记探针。为了利用该方法进行EE-GMl检测，靶序列可与包含SEQ ID No 12的核苷酸210至核苷酸227的核苷酸序列或其互补序列的标记的第一核酸寡核苷酸或包含SEQ ID No 13的核苷酸561至核苷酸568的核苷酸序列或其互补序列的所述标记核酸探针杂交，并且还可与包含SEQ IDNo 12的核苷酸192至核苷酸209的核苷酸序列或其互补序列的第二核酸寡核苷酸或包含SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸586的核苷酸序列或其互补序列的所述标记核酸探针杂交，其中所述第一寡核苷酸与第二寡核苷酸重叠至少一个寡核苷酸。通过该杂交产生的双链体或三链体结构允许利用酶(Clt'avase )进行选择性探针切割，从而使靶序列保持完整。随后可能地通过导致进一步信号放大的中间步骤检测切割的标记探针。为了利用该方法进行EE-GM2检测，靶序列可与包含SEQ ID No 14的核苷酸312至核苷酸329的核苷酸序列或其互补序列的标记的第一核酸寡核苷酸或包含SEQ ID No 15的核苷酸490至核苷酸507的核苷酸序列或其互补序列的所述标记核酸探针杂交，并且还可与包含SEQ IDNo 14的核苷酸294至核苷酸311的核苷酸序列或其互补序列的第二核酸寡核苷酸或包含SEQ ID No 15的核苷酸508至核苷酸525的核苷酸序列或其互补序列的所述标记核酸探针杂交，其中所述第一寡核苷酸与第二寡核苷酸重叠至少一个寡核苷酸。通过该杂交产生的双链体或三链体结构允许利用酶(Cleavase )进行选择性探针切割，从而使靶序列保持完整。随后可能地通过导致进一步信号放大的中间步骤检测切割的标记探针。如本文中所用，“试剂盒”是指为了进行本发明的方法，更具体地，鉴定生物样品中的原种事件EE-GM3或确定包含EE-GM3的植物材料的接合性状态而使用的一组试剂。更具体地，本发明的试剂盒的优选实施方案包括至少一个或两个如上所述用于鉴定原种事件的特异性引物，或用于确定接合性状态的三个特异性引物。任选地，试剂盒还可包括本文中描述的用于PCR鉴定方案的任何其它试剂。或者，根据本发明的另一个实施方案，试剂盒可包括上述特异性探针，其与生物样品的核酸特异性杂交以鉴定EE-GM3存在于其中。任选地，试剂盒还可包括用于使用特异性探针鉴定生物样品中的EE-GM3的任何其它试剂(例如但不限于杂交缓冲液、标记物)。为了进行质量控制(例如，种子批的纯度)、检测原种事件在植物材料或包含或来源于植物材料的材料(例如但不限于食品或饲料产品)中的存在或不存在，可使用本发明 的试剂盒，并且特别地可调整其组分。如本文中所用，关于核苷酸序列(DNA或RNA)的“序列同一性”是指具有相同核苷酸的位置的数目除以两个序列的较短者中的核苷酸序列的数目。利用Wilbur和Lipmann算法(Wilbur 和 Lipmann, 1983, Proc. Nat. Acad. Sc1. USA 80:726)，使用 20 个核苷酸的窗口大小、4个核苷酸的字长以及为4的空位罚分进行两个核苷酸序列的比对。可以例如使用 Genetics Computer Group 的序列分析软件包(GCG, University of WisconsinBiotechnology Center)方便地进行序列数据的计算机辅助分析和解释,包括上文中描述的序列比对。当此类序列具有至少约75%、特别地至少约80%、更特别地至少约85%、更特别地至少约90%、特别地至少约95%、更特别地至少约98%或至少约99%的序列同一性时,序列被标示为“基本上相似”。很清楚，当RNA序列被认为与DNA基本上相似或与DNA序列具有一定程度的序列同一性时，DNA序列中的胸苷(T)被认为等同于RNA序列中的尿嘧啶(U)。同样地，很清楚小的差异或突变可随着时间过去在DNA序列中出现并且对于本发明的事件特异性引物或探针可允许一些错配，这样在本文中在本发明的任何实施方案中对于本发明的任何3’或5’侧翼DNA或任何插入物或外源DNA或任何引物或探针指定的任何DNA序列，也包括基本上与本文中提供的序列相似的序列，例如与本发明的任何3’或5’侧翼DNA、任何引物或探针或任何插入物或外源DNA的给定的序列杂交或与所述序列具有至少90%、95%、96%、97%、98%或至少99%的序列同一性的序列。如本文中所用，术语“引物”包括能够以模板依赖性方法例如PCR引发新生核酸的合成的任何核酸。通常地，引物是10至30个核苷酸的寡核苷酸，但可使用更长的序列。可以以双链形式提供引物，尽管单链形式是优选的。探针可用作引物，但被设计用以结合靶DNA或RNA并且无需用于扩增过程中。如本文中所用，当指特异性引物时，术语“识别”是指特异性引物在方法中所示的条件(例如PCR鉴定方案的条件)下与原始事件的核酸序列特异性杂交的事实，其中通过阳性对照和阴性对照的存在确定特异性。如本文中所用，术语“杂交”当指特异性探针时，是指探针在标准严格条件下结合原种事件的核酸序列特异性区域的事实。如本文中所用，标准严格条件是指本文中描述的用于杂交的条件或指如由 Sambrook 等，1989 (Molecular Cloning A Laboratory Manual,第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY)描述的常规杂交条件,所述杂交条件例如可包括下列步骤1)将植物基因组DNA片段固定在滤膜上，2)将滤膜在42°C下于50%甲酰胺、5X SSPE、2X Denhardt's试剂和0. 1%SDS中预杂交I或2小时，或在68°C下于6XSSC、2XDenhardt’ s试剂和0. 1%SDS中预杂交I至2小时，3)添加已被标记的杂交探针，4)温育16至24小时，5)在室温下于IX SSC、0. 1%SDS中洗涤滤膜20分钟，6)在68°C下于0. 2X SSC, 0. 1%SDS中洗涤滤膜3次，每次20分钟，和7)使用增感屏，将滤膜在_70°C下暴露于X-射线胶片24至48小时。如本文中所用，生物样品是植物、植物材料或包含植物材料的产物的样品。术语“植物”意欲包括处于任何成熟阶段的大豆(大豆)植物组织以及获自或来源于任何这样的植物的任何细胞、组织或器官，包括但不限于任何种子、叶、茎、花、根、单细胞、配子、细胞培养物、组织培养物或原生质体。如本文中所用，“植物材料”是指获自或来源于植物的材料。包含植物材料的产物涉及食品、饲料或使用植物材料产生的或可被植物材料污染的其它产
物。应理解，在本发明的说明书中，测试此类生物样品的对于EE-GM3、EE-GMl和EE-GM2有特异性的核酸的存在，所述核酸的存在暗示着核酸在样品中的存在。因此本文中提及的用于鉴定生物样品中的原种事件EE-GM3和EE-GM2或EE-GM3和EE-GMl的方法涉及鉴定生物样品中的包含原种事件的核酸。如本文中所用，“包含”将解释为指定提及的所述特征、整数、步骤、试剂或组分的存在，但不排除一个或多个特征、整数、步骤或组合分或其组群的存在或添加。因此，例如，包含核苷酸或氨基酸的序列的核酸或蛋白质可包含比实际上引述的核苷酸或氨基酸更多的核苷酸或氨基酸，即包括在更大的核酸或蛋白质中。包含功能或结构上确定的DNA序列的嵌合基因可包含额外的DNA序列，例如启动子和转录终止序列。本发明还涉及在大豆中进行的一堆原种事件EE-GM3和原种事件EE-GMl或一堆原种事件EE-GM3和原种事件EE-GM2的开发，包含一堆此类事件的植物，从这些植物获得的后代以及来源于包含这些堆的植物的植物细胞或植物材料。可如实施例1中所述获得包含原种事件EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2的植物。可使用常规繁育法将包含单个事件的植物杂交，然后鉴定其包含两个不同事件的后代来获得堆。可按照实施例2中针对EE-GM3和EE-GMl所描述的PCR鉴定方案鉴定包含EE-GM3和EE-GMl的大豆植物或植物材料。简而言之，使用特异性识别EE-GM3的5’或3’侧翼序列内的序列的引物例如具有SEQ ID NO :5的序列的引物和识别外源DNA内的序列的引物例如具有SEQ ID NO 4的序列的引物，以及还使用特异性识别EE-GMl的5’或3’侧翼序列内的序列的引物例如具有SEQ ID NO 16的序列的引物和识别外源DNA内的序列的引物例如具有SEQ ID NO :17的序列的引物通过PCR扩增存在于生物样品中的大豆基因组DNA。可按照实施例2中针对EE-GM3和EE-GM2所描述的PCR鉴定方案鉴定包含EE-GM3和EE-GM2的大豆植物或植物材料。简而言之，使用特异性识别EE-GM3的5’或3’侧翼序列内的序列的引物例如具有SEQ ID NO :5的序列的引物和识别外源DNA内的序列的引物例如具有SEQ ID NO 4的序列的引物，以及还使用特异性识别EE-GM2的5’或3’侧翼序列内的序列的引物例如具有SEQ ID NO 18的序列的引物和识别外源DNA内的序列的引物例如具有SEQ IDNO 19的序列的引物通过PCR扩增存在于生物样品中的大豆基因组DNA。扩增内源大豆序列的部分的DNA引物用作PCR扩增的阳性对照。当进行PCR扩增时，材料产生预期大小的片段，材料包含来自具有原种事件EE-GM3和EE-GMl的大豆植物或来自具有原种事件EE-GM3和EE-GM2的大豆植物的植物材料。具有EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2的植物的特征在于它们的草甘膦抗性，以及在于它们对HPro抑制剂例如异噁唑草酮的抗性以及还在于它们对草铵膦的抗性。具有事件堆的植物的特征也在于在除草剂应用不存在的情况下具有可与商购获得的大豆品种相比较的农艺特征。已观察到，外源DNA在本文中描述的大豆植物基因组的插入区域中的存在赋予了包含该事件的植物特别令人感兴趣的表型和分子特征。本发明的一个实施方案在大豆植物中提供了可通过在大豆基因组的特定位置插入转基因获得的原种事件EE-GM3和EE-GMl和/或EE-GM2的组合，所述原种事件赋予此类大豆植物对草甘膦、草胺膦和HPH)抑制剂除草剂例如异噁唑草酮的抗性，其中与等基因系相比较(如本文中所用，“等基因系”或“近等基因系”是具有相同遗传背景但不存在转基因的大豆品系，例如具有与用于转化的植物相同的遗传背景的植物，或已失去转基因的分离姊妹系)，此类原种事件对此类大豆的农艺性状不产生负面影响此类大豆植物的产量的任何影响。具体地，本发明在大豆植物中提供了原种事件EE-GM3和EE-GMl和/或EE-GM2的组合，其中与等基因系相比较，所述原种事件在此类大豆植物的基因组中的插入或存在在此类大豆植物中不引起增加对疾病的易感性，不引起产量抑制现象，或不引起增强的倒伏。因此，本发明在大豆植物中提供了称为EE-GM3和EE-GMl和/或EE-GM2的原种事件的组合，所述组合产生可耐受草甘膦、草胺膦和HPH)抑制剂除草剂(同时或单独地)的施用而与等基因系相比较不负面影响所述大豆植物的产量的大豆植物，所述大豆植物在它们的疾病易感性或倒伏方面与等基因大豆植物相比较不具有统计上显著的差异。这些特征使得原种事件的现有组合对控制大豆田中的耐草甘膦的杂草极具吸引力，并且还可用于在大豆田中防止或延迟其它耐草甘膦的发展(例如，通过施用草甘膦和异噁唑草酮和/或草铵膦，或通过施用异噁唑草酮和草甘膦和/或草铵膦，或通过施用草胺膦和草甘膦和/或异噁唑草酮，确保至少2个或甚至3个不同作用模式的除草剂施用于大豆田)。本文中还提供了包含事件EE-GM3和原种事件EE-GMl或EE-GM2的大豆植物或其部分，其中包含事件EE-GM3的代表性大豆种子已于NCMB登录号41659下保藏，包含原种事件EE-GMl的代表性大豆种子已于登录号NCI MB 41658下保藏在NCMB，包含原种事件EE-GM2的代表性种子已于登录号NCMB 41660下保藏在NCMB，包含事件EE-GM3和EE-GMl的代表性大豆种子已于登录号PTA-11041下保藏在ATCC，包含事件EE-GM3和EE-GM2的代表性大豆种子已于登录号PTA-11042下保藏在ATCC。可通过本领域可获得的任何方法，包括通过将来自保藏的种子的植物杂交，收集其后代，然后鉴定包含原种事件的适当组合的后代植物将各个原种事件(如可见于各自保藏的种子中的)组合来获得包含EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2的大豆植物或其部分。本文中还提供了包含此类事件的此类植物的种子以及从此类种子产生的大豆产物，其中所述大豆产物包含事件EE-GM3和EE-GMl或EE-GM2。此类大豆产物可以是膳食、磨碎的种子、粉末、薄片等或可包括所述形式。特别地，这样的大豆产物包含产生诊断事件EE-GM3和原种事件EE-GMl或EE-GM2的扩增 子，例如包含SEQ IDNo. 2或3、SEQ ID No. 14或15和/或SEQ ID No. 12或13的扩增子的核酸。本文中还提供了用于产生大豆产物的方法，包括获得包含事件EE-GM3和原种事件EE-GMl或EE-GM2的大豆种子，和从其产生这样的大豆产物。本文中还提供了大豆植物，其为任何上述大豆植物的后代，并且包含事件EE-GM3和 EE-GMl 或 EE-GM2。本文中还提供了用于产生耐草甘膦和/或草胺膦和/或异噁唑草酮除草剂的大豆植物的方法，其包括具体地通过将包含事件EE-GM3的第一大豆植物与包含EE-GMl和/或EE-GM2的大豆植物杂交，然后选择耐草甘膦和/或草胺膦和/或异噁唑草酮的后代植物来将事件EE-GM3和事件EE-GMl或EE-GM2引入这样的植物的基因组。本文中还提供了耐草甘膦和草胺膦和/或异噁唑草酮植物，所述植物明确地不具 有产量抑制现象，具有可接受的农艺特征，包含2mEPSPS、HPro和PAT蛋白，并且能够产生诊断事件EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2的扩增子。本文中还提供了用于控制包含事件EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2的大豆植物的田中或待种植此类大豆植物的田中的杂草的方法，包括用有效量的基于异噁唑草酮、基于草甘膦和/或草铵膦的除草剂处理田，其中此类植物抗此类除草剂。本文中还提供了包含EE-GM3和EE-GMl的大豆植物、细胞、组织或种子，其特征在于在其细胞的基因组中包含与SEQ ID No. 2的核苷酸1431至1472具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列和与SEQ ID No. 3的核苷酸220至261具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列或所述序列的互补序列，以及还包含与SEQ ID No. 12的核苷酸199至220具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列和与SEQ IDNo. 13的核苷酸558至579具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列或所述序列的互补序列。本文中还提供了包含EE-GM3和EE-GM2的大豆植物、细胞、组织或种子，其特征在于在其细胞的基因组中包含与SEQ ID No. 2的核苷酸1431至1472具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列和与SEQ ID No. 3的核苷酸220至261具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列或所述序列的互补序列，以及还有与SEQ ID No. 14的核苷酸301至322具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列和与SEQ IDNo. 15的核苷酸497至518具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列或所述序列的互补序列。如本文中所用，术语“异噁唑草酮”是指除草剂异噁唑草酮[即(5-环丙基-4-异噁唑基)[2-(甲磺酰基)-4-(三氟甲基)苯基]甲酮]，其活性代谢物二酮腈以及包含所述化合物的任何混合物或溶液。对于对包含本发明的事件的植物的应用是有用的HPro抑制性除草剂为二酮腈，例如2-氰基-3-环丙基-1- (2-甲磺酰-4-三氟甲基苯基)-丙烷-1，3-二酮和2-氰基-1-[4-(甲磺酰基)-2-三氟甲基苯基]-3-(1-甲基环丙基)丙烷-1，3-二酮；其它异噁唑类；和吡唑啉盐类，例如苯吡唑草酮[即[3-(4，5-二氢-3-异噁唑基)-2-甲基-4-(甲磺酰基)苯基](5-羟基-1-甲基-1H-吡唑-4-基)甲酮]，和磺酰草卩比唑(pyrasulfotole) [ (5-轻基-1，3-二甲基卩比唑-4-基(2-甲磺酰_4_三氟甲基苯基)甲酮];或盐酸苯偶氮吡胺[2-[4-(2，4_ 二氯苯甲酰基)-1，3_ 二甲基吡唑-5-基氧基]乙酰苯]。
在本发明的一个实施方案中，在种植大豆植物或播种之前，可用HPH)抑制剂除草剂例如异噁唑草酮(’ IFT’)处理待种植包含EE-GM3事件的大豆植物的田，所述除草剂可清除田中可被HPH)抑制剂杀死的杂草，从而使得能够实施免耕，然后，随后在该相同的预处理的田上种植或播种大豆(使用HPH)抑制剂除草剂的烧毁应用)。IFT的残余活性还将保护正在出芽和生长的大豆植物在早期生长阶段免受杂草的竞争。一旦大豆植物具有一定的大小，并且杂草有趋势重现，则可将草甘膦或HPH)抑制剂-草甘膦混合物作为芽后除草剂在植物的顶部上方施用。在本发明的另一个实施方案中，可在大豆植物出芽前但在种子播种后(可在播种前使用其它方法，通常地常规耕地实践例如耕犁、凿式耕犁(chissel ploughing)或苗床准备使田间无杂草)，用HPH)抑制剂除草剂例如IFT处理其中播种了包含EE-GM3事件的种子的田，其中残余活性将使田间保持无被除草剂杀死的杂草，以便正在出芽和生长的大豆植物没有杂草竞争(HPPD抑制剂除草剂的芽后施用)。一旦大豆植物具有一定的大小，并且杂草有趋势重现，则可将草甘膦一或HPH)抑制剂-草甘膦混合物一作为芽后除草剂在植物的顶部上方施用。 在本发明的另一个实施方案中，可在大豆植物(已从播种的种子出芽)的顶部上方用HPH)抑制剂除草剂例如IFT处理包含EE-GM3事件的植物，这可清除田中可被HPTO抑制剂杀死的杂草，可将该应用与利用作为芽后除草剂的草甘膦的处理一起(例如，在喷雾罐混合物中)，在其之前或之后于植物的顶部上方施用(HPH)抑制剂除草剂(具有或不具有草甘膦)的芽后施用)。同样地，根据本发明，可用下列杀虫剂、除草剂或杀真菌剂处理具有EE-GM3和EE-GMl或EE-GM2的大豆植物，或可用包含下列杀虫剂、除草剂或杀真菌剂的种子包衣包被具有EE-GM3和EE-GMl或EE-GM2的大豆种子大豆除草剂甲草胺(Alachlor)、苯达松(Bentazone)、氟乐灵(Trifluralin)、氯卩密磺隆(Chlorimuron-Ethyl)、氯酯横草胺(Cloransulam-Methyl)、卩惡唑禾草灵(Fenoxaprop)、氟磺胺草醚(Fomesafen)、批氟禾草灵(Fluazifop)、草甘膦、甲氧咪草烟(Imazamox)、灭草喹(Imazaquin)、咪草烟(Imazethapyr) > (S-)丙草胺(Metolachlor)、嗪草酮(Metribuzin)、二甲戍灵(Pendimethalin)、得杀草(Tepraloxydim)、异卩惡唑草酮、草铵膦。大豆杀虫剂入-三氟氯氰菊酯(cyhalothrin)、灭多威(Methomyl)、对硫磷(Parathion)、硫双威(Thiocarb)、卩比虫啉(Imidacloprid)、氯虫酰肼(Clothianidin)、噻虫嗪(Thiamethoxam)、噻虫啉(Thiacloprid)、卩定虫脉(Acetamiprid)、呋虫胺(Dinetofuran,)、氟虫酰胺(Flubendiamide)、Rynaxypyr> Cyazypyr> 多杀菌素(Spinosad)、乙基多杀菌素(Spinotoram)、埃玛菌素(Emamectin-Benzoate)、氟虫臆(Fipronil)、乙虫月青(Ethiprole)、溴氰菊酯(Deltamethrin)、3 -氟氯氰菊酉旨(-Cyfluthrin)、Y 和入三氟氯氰菊酯、4- [ [ (6-氯卩比卩定-3-基)甲基](2，2- 二氟乙基)氨基]呋喃-2 (5H)-酮、螺虫乙酯(Spirotetramat)、螺螨酯(Spinodiclofen)、杀铃脲(Trif Iumuron)、氟唳虫酰胺(Flonicamid)、硫双威(Thiodicarb)、P _ 氟氯氰菊酯。大豆杀真菌剂
臆卩密菌酯(Azoxystrobin)、环丙唑醇(Cyproconazole)、氟环唑(Epoxiconazole)、粉唑醇(Flutriafol)、卩比唑醚菌酯(Pyraclostrobin)、戍唑醇(Tebuconazole)、布洛芬、丙硫菌唑(Prothioconazole)、氟醚唑(Tetraconazole)。下列实施例描述了原种事件EE-GM3、EE-GMl和EE-GM2以及包含事件EE-GM3和EE-GMl或EE-GM3和EE-GM2的堆的植物的鉴定以及用于特异性鉴定生物样品中的原种事件EE-GM3、EE-GMl或EE-GM2及其堆的工具的开发。除非在实施例中另外指出，否则按照“Sambrook J和Russell DW(编著)(2001)Molecular Cloning A Laboratory Manual,第 3 版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, New York”和“Ausubel FA, Brent R, Kingston RE, Moore DD, Seidman JG, SmithJA 和 Struhl K(编著)(2006) Current Protocols in Molecular Biology. John Wiley &Sons, New York”中描述的标准方案进行所有重组技术。标准材料和参考资料描述于“CroyRDD(编)(1993)Plant Molecular BiologyLabFax,BIOS Scientific Publishers Ltd. , Oxford and Blackwell Scientific Publications, Oxford”和“Brown TA, (1998)Molecular Biology LabFax,第2版，AcademicPress, San Diego”中。用于聚合酶链式反应(PCR)的标准材料和方法可见于“McPhersonMJ and MO Iler SG(2000)PCR(The Basics), BIOS Scientific Publishers Ltd.，Oxford”和“PCR Applications Manual,第 3版(2006)，Roche Diagnostics GmbH, Mannheim或www.roche-applied-science. com，，中。应当理解，下列实施例中的任何实验室方案例如PCR方案中的许多参数可能需要针对具体实验室条件进行调整，并且可略作改进以获得相似结果。例如，使用不同方法制备DNA或在PCR法中选择其它引物可决定用于PCR方案的其它最佳条件。然而这些调整对于本领域技术人员来说是显然的，并且在现有PCR应用手册中进行进一步说明。在说明书和实施例中，参考下列序列SEQ ID No.1 :载体pSFlO的SalI片段核苷酸序列。SEQ ID No. 2 :包含侧翼连接EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5'区域的核苷酸序列。SEQ ID No. 3 :包含侧翼连接EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的3'区域的核苷酸序列。SEQ ID No. 4 :引物 S0Y028SEQ ID No. 5 :引物 S0Y029SEQ ID No. 6 :引物 SMP187SEQ ID No. 7 :引物 STVO19SEQ ID No. 8 :扩增子的核苷酸序列SEQ ID No. 9 :用于扩增对照片段的引物I (SOYOl)SEQ ID No. 10 :用于扩增对照片段的引物的2 (S0Y02)SEQ ID No. 11 pB2/P35SAcK 的核苷酸序列SEQ ID No. 12 :包含侧翼连接EE-GMl中的外源DNA的5'区域的核苷酸序列SEQ ID No. 13 :包含侧翼连接EE-GMl中的外源DNA的3'区域的核苷酸序列SEQ ID No. 14 :包含侧翼连接EE-GM2中的外源DNA的5'区域的核苷酸序列
SEQID No. 15 :包含侧翼连接EE-GM2中的外源DNA的3'区域的核苷酸序列SEQID No. 16 :引物 S0Y06SEQID No. 17 :引物 S0Y07SEQID No. 18 :引物 S0Y09SEQID No. 19 :引物 S0Y010SEQID No. 20 :EE_G M3中的外源DNA和植物侧翼序列的核苷酸序列SEQID No. 21 :引物 SHA 130SEQID No. 22 :引物 SHA 178
实施例1.利用耐除草剂基因转化大豆1.1.包含2mEPSPS和HPPD_Pf_W336嵌合基因的外源DNA的描述质粒pSFlO为pUC 19衍生的克隆载体，其包含位于约7. 3kb的SalI片段上的嵌
合2m印sps基因和嵌合hppd-Pf-W336。两个SalI限制性位点之间包含的DNA的完全说明
不于下表I中。核苷酸序列不于SEQ ID No.1中。表1. pSFlO的SalI限制性位点之间包含的DNA的核苷酸位置(SEQ ID No I)
核苷酸位置取向说明和参考资料
188-479互补3ios:色括来自根癌土壤杆菌(Agrobacterium
tumefacien)的pTiT37的T-DNA的胭脂碱合酶基 因的3’非翻译区的序列(Depicker等，1982，Journal of Molecular and Applied Genetics, 1, 561-573)
480-1556互补hppdPf W336;通过用色氨酸替代氨基酸甘氨酸
336修飾的荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)株A32的4-樂基苯丙酮酸二氧合酶的编码序列，如由Boudec等(2001)美国专利6245968B1
互补
1557-1928TPotp Y:最优化的转运肽衍生物的编码序列(位
置55被改变成酪氨酸)，包含玉蜀黍(玉米)和葵 花(Helianlhus amiuus)(向日葵)的 RiiBisCO 小亚
权利要求
1.一种用于鉴定原种事件EE-GM3和EE-GMl在生物样品中的同时存在的方法，所述方法包括利用特异性识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GM3特异性区域，和利用特异性识别EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GMl特异性区域。
2.权利要求1所述的方法，所述方法包括使用利用至少两个引物的第一聚合酶链式反应，和使用利用至少两个引物的第二聚合酶链式反应，从存在于所述生物样品中的核酸扩增两个50至IOOObp的DNA片段，在所述第一聚合酶链式反应中，所述引物之一识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼区域或EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的3’侧翼区域，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列，所述引物的另一个引物识别EE-GM3的外源DNA内的序列，所述外源DNA包含SEQ IDNo. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列，或所述引物的另一个引物识别EE-GM3的外源DNA内的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No.1的核苷酸序列或其互补序列，或包含SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互补序列，并且在所述第二聚合酶链式反应中，所述引物之一识别EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼区域或EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA的3’侧翼区域，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列，所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互补序列的核苷酸序列，所述引物的另一个引物识别EE-GMl的外源DNA内的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No. 12的核苷酸210至核苷酸720的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 13的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列，或所述引物的另一个引物识别EE-GMl的外源DNA内的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No. 11的核苷酸序列或其互补序列，其中所述第一聚合酶和第二聚合酶反应可以是相继的或同时的。
3.权利要求2所述的方法，其中识别EE-GM3的5’侧翼区域的所述引物包含选自SEQID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列或识别EE-GM3的3’侧翼区域的所述引物包含选自SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GM3的外源DNA内的序列的所述引物包含选自SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID No.1的核苷酸序列或其互补序列、或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互补序列的17至200个连续核苷酸，并且其中识别EE-GMl的5’侧翼区域的所述引物包含选自SEQ IDNo 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，或识别EE-GM3的3’侧翼区域的所述引物包含选自SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互补序列的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GMl的外源DNA内的序列的所述引物包含选自SEQ ID No. 12的核苷酸210至核苷酸720的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 13的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列或SEQ ID No. 11的核苷酸序列或其互补序列的17至200个连续核苷酸。
4.权利要求2所述的方法，其中识别EE-GM3的5’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列或识别EE-GM3的3’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQ ID No3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GM3的外源DNA内的序列的所述引物在其3’末端包含选自SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID No I的核苷酸序列或其互补序列、或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互补序列的至少17个连续核苷酸，并且其中识别EE-GMl的5’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQ ID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列或识别EE-GMl的3’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互补序列的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GMl的外源DNA内的序列的所述引物在其3’末端包含选自SEQ ID No. 12的核苷酸210至核苷酸720的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 13的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列或SEQID No 11的核苷酸序列或其互补序列的至少17个连续核苷酸。
5.权利要求4所述的方法，其中所述EE-GM3特异性引物分别包含SEQID No. 5和SEQID No. 4的序列，或分别包含SEQ ID No 5和SEQ ID No. 7的序列，以及所述EE-GMl特异性引物分别包含SEQID No. 16和SEQ ID No. 17的序列。
6.权利要求5所述的方法，所述方法包括使用EE-GM3PCR鉴定方案扩增约263或约706bp的EE-GM3特异性片段和扩增约183bp的EE-GMl特异性片段。
7.一种用于鉴定原种事件EE-GM3和原种事件EE-GMl在生物样品中的同时存在的试剂盒，所述试剂盒包括一种识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼区域的引物，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，或一种识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的3’侧翼区域的引物，所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列，和一种识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA内的序列的引物，所述外源DNA包含SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID No I的核苷酸序列或其互补序列、或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互补序列，并且其中所述试剂盒还包括一种识别EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼区域的引物，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列，或一种识别EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA的3’侧翼区域的引物，所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互补序列的核苷酸序列，和一种识别EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA内的序列的引物，所述外源DNA包含SEQ ID No. 12的核苷酸210至核苷酸720的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 13的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列或SEQID No 11的核苷酸序列或其互补序列。
8.权利要求7所述的试剂盒，其中识别EE-GM3的所述5’侧翼区域的所述引物包含选自SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，或识别EE-GM3的3’侧翼区域的所述引物包含选自SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GM3的外源DNA内的序列的所述引物包含选自SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID Nol的核苷酸序列或其互补序列或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互补序列的17至200个连续核苷酸，并且其中识别EE-GMl的所述5’侧翼区域的所述引物包含选自SEQ ID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，或识别EE-GMl的3’侧翼区域的所述引物包含选自SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互补序列的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GMl的外源DNA内的序列的所述引物包含选自SEQID No. 12的核苷酸210至核苷酸720的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 13的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列或SEQ ID No 11的核苷酸序列或其互补序列的17至200个连续核苷酸。
9.权利要求7所述的试剂盒，其中识别EE-GM3的所述5’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列或识别EE-GM3的所述3’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GM3的所述外源DNA内的序列的所述引物在其3’末端包含选自SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID No I的核苷酸序列或其互补序列、或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互补序列的至少17个连续核苷酸，并且其中，识别EE-GMl的所述5’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，或识别EE-GMl的所述3’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQ IDNo 13的核苷酸569至核苷酸1000的互补序列的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GMl的所述外源DNA内的序列的所述引物在其3’末端包含选自SEQID No. 12的核苷酸210至核苷酸720的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 13的核苷酸I至核苷酸568的核苷酸序列或SEQ ID No 11的核苷酸序列或其互补序列的至少17个连续核苷酸。
10.权利要求7所述的试剂盒，其包括包含SEQID No. 4的序列的引物和包含SEQ IDNo. 5的序列的引物或包括包含SEQ ID No. 5的序列的引物和包含SEQ ID No. 7的序列的引物以及还包括包含SEQ ID No. 16的序列的引物和包含SEQ ID No. 17的序列的引物。
11.一对引物，所述第一引物包含在最优化的检测条件下特异性识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域内的序列的序列，所述5’侧翼区域包含SEQ IDNo 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，并且所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸的1408的互补序列的核苷酸序列，并且所述第二引物包含在最优化的检测条件下特异性识别EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域内的序列的序列，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列，并且所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互补序列的核苷酸序列。
12.权利要求11所述的引物对，其中所述第一引物包含选自SEQIDNo 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列或选自SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述第二引物包含选自SEQ ID No 12的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列或选自SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互补序列的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列。
13.权利要求11所述的引物对，其中所述第一引物在其最3’末端包含选自SEQID No2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列或选自SEQID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述第二引物在其最3’末端包含选自SEQ ID Nol2的核苷酸I至核苷酸209的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列或选自SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的互补序列的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列。
14.一对引物，其中所述第一引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 5的序列并且其中所述第二引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 16的序列。
15.一种包含4种引物的装置， 第一引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 5的序列； 第二引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 4的序列； 第三引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 16的序列；和 第四引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 17的序列。
16.权利要求1所述的方法，所述方法包括将生物样品的核酸与针对EE-GM3的第一特异性探针和与针对EE-GMl的第二特异性探针杂交。
17.权利要求16所述的方法，其中所述第一特异性探针的序列与包含EE-GM3的5’侧翼序列或3’侧翼序列的部分和与其邻接的外源DNA的序列的序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述第二特异性探针的序列与包含EE-GMl的5’侧翼序列或3’侧翼序列的部分和与其邻接的外源DNA的序列的序列具有至少80%的序列同一性。
18.权利要求17所述的方法，其中所述第一特异性探针的序列与SEQID No. 2的核苷酸1431至1472或SEQ ID No. 3的核苷酸220至261或所述序列的互补序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述第二特异性探针的序列与SEQ ID No. 12的核苷酸199至220或SEQ ID No. 13的核苷酸558至579或所述序列的互补序列具有至少80%的序列同一性。
19.一种用于鉴定原种事件EE-GM3和原种事件EE-GMl在生物样品中的同时存在的试剂盒，所述试剂盒包括能够与EE-GM3的特异性区域特异性杂交的第一特异性探针和能够与EE-GMl的特异性区域特异性杂交的第二特异性探针。
20.权利要求19所述的试剂盒，其中所述第一特异性探针的序列与包含EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼序列或3’侧翼序列的部分和与其邻接的外源DNA的序列的序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述第二特异性探针的序列与包含EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼序列或3’侧翼序列的部分和与其邻接的外源DNA的序列的序列具有至少80%的序列同一性。
21.权利要求20所述的试剂盒，其中所述第一特异性探针的序列包含与SEQID No. 2的核苷酸1441至1462或SEQ ID No. 3的核苷酸230至251或所述序列的互补序列具有至少80%的序列同一性的序列，并且其中所述第二特异性探针的序列与SEQ ID No. 12的核苷酸199至220或SEQ ID No. 13的核苷酸558至579或所述序列的互补序列具有至少80%的序列同一性。
22.—对用于鉴定原种事件EE-GM3和原种事件EE-GMl在生物样品中的同时存在的特异性探针。
23.权利要求22所述的探针对，其包括第一探针和第二探针，所述第一探针包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与包含EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼序列或3’侧翼序列的部分和与其邻接的外源DNA的序列的序列或其互补序列具有至少80%的序列同一性，所述第二探针包含核苷酸序列，所述核苷酸与包含EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼序列或3’侧翼序列的部分和与其邻接的外源DNA的序列的序列或其互补序列具有至少80%的序列同一性。
24.权利要求23所述的引物对，其中所述第一探针与SEQID No. 2的核苷酸1441至1462或SEQ ID No. 3的核苷酸230至251或所述序列的互补序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述第二探针与SEQ ID No. 12的核苷酸199至220或SEQ ID No. 13的核苷酸558至579或所述序列的互补序列具有至少80%的序列同一性。
25.一组用于鉴定原种事件EE-GM3和EE-GMl在生物样品中的同时存在的特异性探针，包括第一探针和第二探针，所述第一探针具有包含与SEQ ID No. 2的核苷酸1441至1462或SEQ ID No. 3的核苷酸230至251或所述序列的互补序列基本上相似的核苷酸序列的序列，所述第二探针具有与SEQ ID No. 12的核苷酸199至220或SEQ ID No. 13的核苷酸558至579或所述序列的互补序列基本上相似的核苷酸序列。
26.一种用于确认种子样品中的种子纯度的方法，所述方法包括用特异性识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GM3特异性区域，和用特异性识别EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GMl特异性区域。
27.一种用于在种子批的样品中筛选种子的原种事件EE-GM3和EE-GMl的存在的方法，所述方法包括用特异性识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GM3特异性区域，和用特异性识别EE-GMl的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GMl特异性区域。
28.—种通过与大体上互补的标记核酸探针杂交来检测原种事件EE-GM3和EE-GMl在生物样品中的存在的方法，其中通过再循环靶核酸序列来放大探针靶核酸比率，所述方法包括 a)将所述祀核酸序列与包含SEQID No 2的核苷酸1452至核苷酸1469的核苷酸序列或其互补序列的第一核酸寡核苷酸或包含SEQID No 3的核苷酸223至核苷酸240的核苷酸序列或其互补序列的所述第一核酸核苷酸杂交； b)将所述靶核酸序列与包含SEQID No 2的核苷酸1434至核苷酸1451的核苷酸序列或其互补序列的第二核酸寡核苷酸或包含SEQID No 3的核苷酸241至核苷酸258的核苷酸序列或其互补序列的所述标记核酸探针杂交，其中所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸重叠至少一个核苷酸，并且其中将所述第一寡核苷酸或所述第二寡核苷酸标记为所述标记核酸探针； c)用产生选择性探针切割从而导致双链体离解的酶仅切割探针靶核酸序列双链体内的标记探针，从而使所述靶序列保持完整；d)通过重复步骤(a)至(c)再循环所述靶核酸序列；和 e)检测切割的标记探针，从而确定所述靶核酸序列的存在；和 f)将所述靶核酸序列与包含SEQID No 12的核苷酸210至核苷酸227的核苷酸序列或其互补序列的第三核酸寡核苷酸或包含SEQ ID No 13的核苷酸561至核苷酸568的核苷酸序列或其互补序列的所述第三核酸寡核苷酸杂交； g)将所述靶核酸序列与包含SEQID No 12的核苷酸192至核苷酸209的核苷酸序列或其互补序列的第四核酸寡核苷酸或包含SEQID No 13的核苷酸569至核苷酸586的核苷酸序列或其互补序列的所述标记核酸探针杂交，其中所述第三寡核苷酸和第四寡核苷酸重叠至少一个核苷酸，并且其中将所述第三寡核苷酸或所述第四寡核苷酸标记为所述标记核酸探针； h)用产生选择性探针切割从而导致双链体离解的酶仅切割探针靶核酸序列双链体内的标记探针，从而使所述靶序列保持完整； i)通过重复步骤(f)至(h)再循环所述靶核酸序列；和 j)检测切割的标记探针，从而确定所述靶核酸序列的存在。
29.—种各自在其基因组中包含原种事件EE-GM3和原种事件EE-GMl的转基因大豆植物或其细胞、部分、组织、种子或后代，已于保藏号NCMB 41659下保藏在NCMB的包含所述事件EE-GM3的参照种子和已于保藏号NCMB 41658下保藏在NCMB的包含所述事件EE-GMl的参照种子，或已于保藏号PTA-11041下保藏在ATCC的在其基因组中包含原种事件EE-GM3和原种事件EE-GMl的参照种子。
30.权利要求29所述的转基因大豆植物、种子、细胞、组织、部分或后代，其基因组DNA，当使用针对EE-GM3的原种事件鉴定方案，利用两个分别包含SEQ ID 4和SEQ ID 5的核苷酸序列的引物进行分析时，产生约263bp的DNA片段，并且其基因组DNA，当使用针对EE-GMl的原种事件鉴定方案，利用两个分别包含SEQ ID16和SEQ ID 17的核苷酸序列进行分析时，产生约183bp的DNA片段。
31.一种各自在其基因组中包含原种事件EE-GM3和原种事件EE-GMl的大豆植物、其植物部分或种子、细胞或组织，所述大豆植物可通过将包含原种事件EE-GM3的大豆植物与在其基因组中包含原种事件EE-GMl的大豆植物杂交来获得，所述包含原种事件EE-GM3的大豆植物可通过从已于保藏号NCMB 41659下保藏在NCMB的种子生长而来的大豆植物的繁殖和/或与其繁育来获得，所述包含原种事件EE-GMl的大豆植物可通过从于保藏号NCIMB41658下保藏在NCMB的种子生长而来的大豆植物的繁殖和/或与其繁育来获得，或所述大豆植物可通过从已于登录号PTA-11041下保藏在ATCC的种子生长而来的大豆植物的繁殖和/或与其繁育来获得。
32.一种包含原种事件EE-GM3和EE-GMl的大豆种子、已于保藏号NCMB 41659下保藏在NCMB的包含事件EE-GM3的参照种子、已于保藏号NCMB 41658下保藏在NCMB的包含事件EE-GMl的参照种子和已于保藏号PTA-11041下保藏在ATCC的包含事件EE-GM3和EE-GMl的参照种子。
33.一种可从权利要求32所述的种子获得的包含原种事件EE-GM3和EE-GMl的转基因大豆植物、植物部分、细胞或组织。
34.—种用于产生包含原种事件EE-GM3和EE-GMl的大丑植物或种子的方法,包括将根据权利要求29至33中任一项所述的植物与另一种大豆植物杂交，和种植获自所述杂交的种子。
35.一种包含原种事件EE-GM3和EE-GMl的大豆基因组DNA。
36.一对分离的核酸分子,所述第一核酸分子包含与SEQ ID No. 2的核苷酸1441至核苷酸1452或SEQ ID No. 3的核苷酸230至251或所述序列的互补序列基本上相似的核苷酸序列，并且所述第二核酸分子包含与SEQ ID No. 12的核苷酸199至核苷酸220或SEQ IDNo. 13的核苷酸558至579或所述序列的互补序列基本上相似的核苷酸序列。
37.权利要求36所述的分尚的核酸分子对,所述第一核酸分子包含与SEQID No. 2的核苷酸1431至核苷酸1462或SEQ ID No. 3的核苷酸220至261或所述序列的互补序列基本上相似的核苷酸序列，并且所述第二核酸分子包含与SEQ ID No. 12的核苷酸189至核苷酸230或SEQ ID No. 13的核苷酸548至589或所述序列的互补序列基本上相似的核苷酸序列。
38.一种大豆植物，其在其基因组中按顺序包含下列核苷酸序列 a)SEQ ID No 2的核苷酸I至1451的核苷酸序列； b)SEQID I的核苷酸6760至核苷酸6958的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列； c)SEQ ID I的核苷酸6874至核苷酸7298的核苷酸序列； d)SEQ ID I的核苷酸7至核苷酸7291的核苷酸序列； e)SEQID I的核苷酸12至核苷酸7265的核苷酸序列； f)SEQ ID 3的核苷酸217至核苷酸240的核苷酸序列；和 g)SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的核苷酸序列并且还按顺序包含下列序列 h)SEQ ID No 12的核苷酸I至209的核苷酸序列； i)SEQID 11的核苷酸340至核苷酸3461的核苷酸序列； j) SEQ ID 11的核苷酸I至核苷酸336的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列； k) SEQ ID 11的核苷酸3462至核苷酸4076的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列； 1)SEQ ID 11的核苷酸337至核苷酸3043的核苷酸序列； m) SEQ ID 13的核苷酸559至核苷酸568的核苷酸序列；和 n) SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的核苷酸序列。
39.一种按顺序包含下列核苷酸序列的DNA分子 a)SEQ ID No 2的核苷酸I至1451的核苷酸序列； b)SEQID I的核苷酸6760至核苷酸6958的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列； c)SEQ ID I的核苷酸6874至核苷酸7298的核苷酸序列； d)SEQ ID I的核苷酸7至核苷酸7291的核苷酸序列； e)SEQID I的核苷酸12至核苷酸7265的核苷酸序列； f)SEQ ID 3的核苷酸217至核苷酸240的核苷酸序列； g)SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的核苷酸序列；以及还按顺序包含下列序列 h)SEQ ID No 12的核苷酸I至209的核苷酸序列； i)SEQID 11的核苷酸340至核苷酸3461的核苷酸序列；j) SEQ ID 11的核苷酸I至核苷酸336的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列； k) SEQ ID 11的核苷酸3462至核苷酸4076的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列； 1)SEQ ID 11的核苷酸337至核苷酸3043的核苷酸序列； m) SEQ ID 13的核苷酸559至核苷酸568的核苷酸序列；和 n) SEQ ID No 13的核苷酸569至核苷酸1000的核苷酸序列。
40.一种用于鉴定原种事件EE-GM3和EE-GM2在生物样品中的同时存在的方法，所述方法包括用特异性识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GM3特异性区域，和用特异性识别EE-GM2的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GM2特异性区域。
41.权利要求40所述的方法，所述方法包括使用利用至少两个引物的第一聚合酶链式反应，和使用利用至少两个引物的第二聚合酶链式反应，从存在于所述生物样品中的核酸扩增两个50至IOOObp的DNA片段，在所述第一聚合酶链式反应中，所述引物之一识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼区域或EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的3’侧翼区域，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列，所述引物的另一个引物识别EE-GM3的外源DNA内的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列，或所述引物的另一个引物识别EE-GM3的外源DNA内的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No.1的核苷酸序列或其互补序列，或包含SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互补序列，并且在所述第二聚合酶链式反应中，所述引物之一识别EE-GM2的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼区域或EE-GM2的包含耐除草剂基因的外源DNA的3’侧翼区域，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No14的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列，所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 15的核苷酸508至核苷酸1880的互补序列的核苷酸序列，所述引物的另一个引物识别EE-GM2的外源DNA内的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No. 14的核苷酸312至核苷酸810的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 15的核苷酸I至核苷酸507的核苷酸序列，或所述引物的另一个引物识别EE-GM2的外源DNA内的序列，所述外源DNA包含SEQ ID No. 11的核苷酸序列或其互补序列，其中所述第一聚合酶和第二聚合酶反应可以是相继的或同时的。
42.权利要求41所述的方法，其中识别EE-GM3的5’侧翼区域的所述引物包含选自SEQID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，或识别EE-GM3的3’侧翼区域的所述引物包含选自SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GM3的外源DNA内的序列的所述引物包含选自SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID No.1的核苷酸序列或其互补序列、或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互补序列的17至200个连续核苷酸，并且其中识别EE-GM2的5’侧翼区域的所述引物包含选自SEQ ID No 14的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，或识别EE-GM3的3’侧翼区域的所述引物包含选自SEQ ID No 15的核苷酸508至核苷酸1880的互补序列的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GM2的外源DNA内的序列的所述引物包含选自SEQ ID No. 14的核苷酸312至核苷酸810的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 15的核苷酸I至核苷酸507的核苷酸序列或SEQ ID No. 11的核苷酸序列或其互补序列的17至200个连续核苷酸。
43.权利要求41所述的方法，其中识别EE-GM3的5’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列或识别EE-GM3的3’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQ ID No3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GM3的外源DNA内的序列的所述引物在其3’末端包含选自SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID No I的核苷酸序列或其互补序列、或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互补序列的至少17个连续核苷酸，并且其中识别EE-GM2的5’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQ ID No 14的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列或识别EE-GM2的3’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQID No 15的核苷酸508至核苷酸1880的互补序列的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GM2的外源DNA内的序列的所述引物在其3’末端包含选自SEQ ID No. 14的核苷酸312至核苷酸810的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 15的核苷酸I至核苷酸507的核苷酸序列或SEQID No 11的核苷酸序列或其互补序列的至少17个连续核苷酸。
44.权利要求43所述的方法，其中所述EE-GM3特异性引物分别包含SEQID No. 5和SEQ ID No. 4的序列，或分别包含SEQ ID No5和SEQ ID No. 7的序列，并且所述EE-GM2特异性引物分别包含SEQ ID No. 18和SEQ ID No. 19的序列。
45.权利要求44所述的方法，所述方法包括使用EE-GM3PCR鉴定方案扩增约263或约706bp的EE-GM3特异性片段和扩增约151bp的EE-GM2特异性片段。
46.一种用于鉴定原种事件EE-GM3和原种事件EE-GM2在生物样品中的同时存在的试剂盒，所述试剂盒包括一种识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼区域的引物，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，或一种识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的3’侧翼区域的引物，所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列，和一种识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA内的序列的引物，所述外源DNA包含SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID No I的核苷酸序列或其互补序列、或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互补序列，并且其中所述试剂盒还包括一种识别EE-GM2的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼区域的引物，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No 14的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列，或一种识别EE-GM2的包含耐除草剂基因的外源DNA的3’侧翼区域的引物，所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 15的核苷酸508至核苷酸1880的互补序列的核苷酸序列，和一种识别EE-GM2的包含耐除草剂基因的外源DNA内的序列的引物，所述外源DNA包含SEQ ID No. 14的核苷酸312至核苷酸810的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 15的核苷酸I至核苷酸507的核苷酸序列或SEQ ID No·11的核苷酸序列或其互补序列。
47.权利要求46所述的试剂盒，其中识别EE-GM3的所述5’侧翼区域的所述引物包含选自SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，或识别EE-GM3的3’侧翼区域的所述引物包含选自SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GM3的外源DNA内的序列的所述引物包含选自SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID No I的核苷酸序列或其互补序列或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互补序列的17至200个连续核苷酸，并且其中识别EE-GM2的所述5’侧翼区域的所述引物包含选自SEQ ID No 14的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，或识别EE-GM2的3’侧翼区域的所述引物包含选自SEQ ID No 15的核苷酸508至核苷酸1880的互补序列的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GM2的外源DNA内的序列的所述引物包含选自SEQID No. 14的核苷酸312至核苷酸810的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 15的核苷酸I至核苷酸507的核苷酸序列或SEQ ID No 11的核苷酸序列或其互补序列的17至200个连续核苷酸。
48.权利要求46所述的试剂盒，其中识别EE-GM3的所述5’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列或识别EE-GM3的所述3’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GM3的所述外源DNA的内的序列的所述引物在其3’末端包含选自SEQ ID No. 2的核苷酸1452至核苷酸1843的互补序列的核苷酸序列或SEQ IDNo 3的核苷酸I至核苷酸240的核苷酸序列或SEQ ID No I的核苷酸序列或其互补序列、或SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互补序列的至少17个连续核苷酸，并且其中，识别EE-GM2的所述5’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQ ID No 14的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，或识别EE-GM2的所述3’侧翼区域的所述引物在其最3’末端包含选自SEQ IDNo 15的核苷酸508至核苷酸1880的互补序列的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，并且识别EE-GM2的所述外源DNA内的序列的所述引物在其3’末端包含选自SEQID No. 14的核苷酸312至核苷酸810的互补序列的核苷酸序列或SEQ ID No 15的核苷酸I至核苷酸507的核苷酸序列或SEQ ID No 11的核苷酸序列或其互补序列的至少17个连续核苷酸。
49.权利要求46所述的试剂盒，其包括包含SEQID No. 4的序列的引物和包含SEQ IDNo. 5的序列的引物或包括包含SEQ ID No. 5的序列的引物和包含SEQ ID No. 7的序列的引物以及还包括包含SEQ ID No. 18的序列的引物和包含SEQ ID No. 19的序列的引物。
50.一对适用于EE-GM3和EE-GM2的特异性检测的引物，所述第一引物包含在最优化的检测条件下特异性识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域内的序列的序列，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列，并且所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸的1408的互补序列的核苷酸序列，并且所述第二引物包含在最优化的检测条件下特异性识别EE-GM2的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域内的序列的序列，所述5’侧翼区域包含SEQ ID No14的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列，并且所述3’侧翼区域包含SEQ ID No 15的核苷酸508至核苷酸1880的互补序列的核苷酸序列。
51.权利要求50所述的引物对，其中所述第一引物包含选自SEQID No 2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列或选自SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述第二引物包含选自SEQ ID No 14的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列或选自SEQ ID No 15的核苷酸508至核苷酸1880的互补序列的核苷酸序列的17至200个连续核苷酸的核苷酸序列。
52.权利要求50所述的引物对，其中所述第一引物在其最3’末端包含选自SEQID No2的核苷酸I至核苷酸1451的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列或选自SEQID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的互补序列的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列，并且其中所述第二引物在其最3’末端包含选自SEQ ID Nol4的核苷酸I至核苷酸311的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列或选自SEQ ID No 15的核苷酸508至核苷酸1880的互补序列的核苷酸序列的至少17个连续核苷酸的核苷酸序列。
53.一对引物，其中所述第一引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 5的序列并且其中所述第二引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 18的序列。
54.一种包含4种引物的装置， 第一引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 5的序列； 第二引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 4的序列； 第三引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 18的序列；和 第四引物在其最3’末端包含SEQ ID No. 19的序列。
55.权利要求40所述的方法，所述方法包括将生物样品的核酸与针对EE-GM3的第一特异性探针和与针对EE-GM2的第二特异性探针杂交。
56.权利要求55所述的方法，其中所述第一特异性探针的序列与包含EE-GM3的5’侧翼序列或3’侧翼序列的部分和与其邻接的外源DNA的序列的序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述第二特异性探针的序列与包含EE-GM2的5’侧翼序列或3’侧翼序列的部分和与其邻接的外源DNA的序列的序列具有至少80%的序列同一性。
57.权利要求56所述的方法，其中所述第一特异性探针的序列与SEQID No. 2的核苷酸1431至1472或SEQ ID No. 3的核苷酸220至261或所述序列的互补序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述第二特异性探针的序列与SEQ ID No. 14的核苷酸301至322或SEQ ID No. 15的核苷酸497至518或所述序列的互补序列具有至少80%的序列同一性。
58.一种用于鉴定原种事件EE-GM3和原种事件EE-GM2在生物样品中的同时存在的试剂盒，所述试剂盒包括能够与EE-GM3的特异性区域特异性杂交的第一特异性探针和能够与EE-GM2的特异性区域特异性杂交的第二特异性探针。
59.权利要求58所述的试剂盒，其中所述第一特异性探针的序列与包含EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼序列或3’侧翼序列的部分和与其邻接的外源DNA的序列的序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述第二特异性探针的序列与包含EE-GM2的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼序列或3’侧翼序列的部分和与其邻接的外源DNA的序列的序列具有至少80%的序列同一性。
60.权利要求59所述的试剂盒，其中所述第一特异性探针的序列包含与SEQID No. 2的核苷酸1441至1462或SEQ ID No. 3的核苷酸230至251或所述序列的互补序列具有至少80%的序列同一性的序列，并且其中所述第二特异性探针的序列与SEQ ID No. 14的核苷酸301至322或SEQ ID No. 15的核苷酸497至518或所述序列的互补序列具有至少80%的序列同一性。
61.一对用于鉴定原种事件EE-GM3和原种事件EE-GM2在生物样品中的同时存在的特异性探针。
62.权利要求61所述的探针对，其包括第一探针和第二探针，所述第一探针包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与包含EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼序列或3’侧翼序列的部分和与其邻接的外源DNA的序列的序列或其互补序列具有至少80%的序列同一性，并且所述第二探针包含核苷酸序列，所述核苷酸序列与包含EE-GM2的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’侧翼序列或3’侧翼序列的部分和与其邻接的外源DNA的序列的序列或其互补序列具有至少80%的序列同一性。
63.权利要求62所述的引物对，其中所述第一探针与SEQID No. 2的核苷酸1441至1462或SEQ ID No. 3的核苷酸230至251或所述序列的互补序列具有至少80%的序列同一性，并且其中所述第二探针与SEQ ID No. 14的核苷酸301至322或SEQ ID No. 15的核苷酸497至518或所述序列的互补序列具有至少80%的序列同一性。
64.一组用于鉴定原种事件EE-GM3和EE-GM2在生物样品中的同时存在的特异性探针，包括第一探针和第二探针，所述第一探针具有包含与SEQ ID No. 2的核苷酸1441至1462或SEQ ID No. 3的核苷酸230至251或所述序列的互补序列基本上相似的核苷酸序列的序列，所述第二探针具有与SEQ ID No. 14的核苷酸301至322或SEQ ID No. 15的核苷酸497至518或所述序列的互补序列基本上相似的核苷酸序列。
65.一种用于确认种子样品中的种子纯度的方法，所述方法包括用特异性识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GM3特异性区域，和用特异性识别EE-GM2的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GM2特异性区域。
66.一种用于在种子批的样品中筛选种子的原种事件EE-GM3的存在的方法，所述方法包括用特异性识别EE-GM3的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GM3特异性区域，和用特异性识别EE-GM2的包含耐除草剂基因的外源DNA的5’或3’侧翼区域的特异性引物或探针检测EE-GM2特异性区域。
67.一种通过与大体上互补的标记核酸探针杂交来检测原种事件EE-GM3和EE-GM2在生物样品中的存在的方法，其中通过再循环靶核酸序列来放大探针靶核酸比率，所述方法包括 a)将所述祀核酸序列与包含SEQID No 2的核苷酸1452至核苷酸1469的核苷酸序列或其互补序列的第一核酸寡核苷酸或包含SEQ ID No 3的核苷酸223至核苷酸240的核苷酸序列或其互补序列的所述第一核酸核苷酸杂交； b)将所述靶核酸序列与包含SEQID No 2的核苷酸1434至核苷酸1451的核苷酸序列或其互补序列的第二核酸寡核苷酸或包含SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸258的核苷酸序列或其互补序列的所述标记核酸探针杂交，其中所述第一寡核苷酸和第二寡核苷酸重叠至少一个核苷酸，并且其中将所述第一寡核苷酸或所述第二寡核苷酸标记为所述标记核酸探针； C)用产生选择性探针切割从而导致双链体离解的酶仅切割探针靶核酸序列双链体内的标记探针，从而使所述靶序列保持完整； d)通过重复步骤(a)至(c)再循环所述靶核酸序列；和 e)检测切割的标记探针，从而确定所述靶核酸序列的存在；和 f)将所述靶核酸序列与包含SEQID No 14的核苷酸312至核苷酸329的核苷酸序列或其互补序列的第三核酸寡核苷酸或包含SEQ IDNo 15的核苷酸490至核苷酸507的核苷酸序列或其互补序列的所述第三核酸寡核苷酸杂交； g)将所述靶核酸序列与包含SEQID No 14的核苷酸294至核苷酸311的核苷酸序列或其互补序列的第四核酸寡核苷酸或包含SEQ ID No 15的核苷酸508至核苷酸525的核苷酸序列或其互补序列的所述标记核酸探针杂交，其中所述第三寡核苷酸和第四寡核苷酸重叠至少一个核苷酸，并且其中将所述第三寡核苷酸或所述第四寡核苷酸标记为所述标记核酸探针； h)用产生选择性探针切割从而导致双链体离解的酶仅切割探针靶核酸序列双链体内的标记探针，从而使所述靶序列保持完整； i)通过重复步骤(f)至(h)再循环所述靶核酸序列；和 j)检测切割的标记探针，从而确定所述靶核酸序列的存在。
68.一种各自在其基因组中包含原种事件EE-GM3和原种事件EE-GM2的转基因大豆植物或其细胞、部分、组织、种子或后代，已于保藏号NCMB 41659下保藏在NCMB的包含所述事件EE-GM3的参照种子和已于保藏号NCMB 41660下保藏在NCMB的包含所述事件EE-GM2的参照种子，或已于保藏号PTA-11042下保藏在ATCC的在其基因组中包含原种事件EE-GM3和原种事件EE-GM2的参照种子。
69.权利要求68所述的转基因大豆植物、种子、细胞、组织、部分或后代，其基因组DNA，当使用针对EE-GM3的原种事件鉴定方案，利用两个分别包含SEQ ID 4和SEQ ID 5的核苷酸序列的引物进行分析时，产生约263bp的DNA片段，并且其基因组DNA，当使用针对EE-GM2的原种事件鉴定方案，利用两个分别包含SEQ ID18和SEQ ID 19的核苷酸序列进行分析时，产生约151bp的DNA片段。
70.一种各自在其基因组中包含原种事件EE-GM3和原种事件EE-GM2的大豆植物、其植物部分或种子、细胞或组织，所述大豆植物可通过将在其基因组中包含原种事件EE-GM3的大豆植物与在其基因组中包含原种事件EE-GM2的大豆植物杂交来获得，所述包含原种事件EE-GM3的大豆植物可通过从已于保藏号NCMB 41659下保藏在NCMB的种子生长而来的大豆植物的繁殖和/或与其繁育来获得，所述包含原种事件EE-GM2的大豆植物可通过从于保藏号NCMB 41660下保藏在NCMB的种子生长而来的大豆植物的繁殖和/或与其繁育来获得，或所述大豆植物可通过从已于登录号PTA-11042下保藏在ATCC的种子生长而来的大豆植物的繁殖和/或与其繁育来获得。
71.一种包含原种事件EE-GM3和EE-GM2的大豆种子、已于保藏号NCMB 41659下保藏在NCMB的包含事件EE-GM3的参照种子、已于保藏号NCMB 41660下保藏在NCMB的包含事件EE-GM2的参照种子和已于保藏号PTA-11042下保藏在ATCC的包含事件EE-GM3和EE-GM2的参照种子。
72.一种可从权利要求71所述的种子产生的包含原种事件EE-GM3和EE-GM2的转基因大豆植物、细胞或组织。
73.一种用于产生包含原种事件EE-GM3和EE-GM2的大豆植物或种子的方法，包括将根据权利要求68至72中任一项所述的植物与另一种大豆植物杂交，和种植获自所述杂交的种子。
74.一种包含原种事件EE-GM3和EE-GM2的大豆基因组DNA。
75.—对分离的核酸分子,所述第一核酸分子包含与SEQ ID No. 2的核苷酸1441至核苷酸1452或SEQ ID No. 3的核苷酸230至251或所述序列的互补序列基本上相似的核苷酸序列，并且所述第二核酸分子包含与SEQ ID No. 14的核苷酸301至核苷酸322或SEQ IDNo. 15的核苷酸497至518或所述序列的互补序列基本上相似的核苷酸序列。
76.权利要求75所述的分尚的核酸分子对,所述第一核酸分子包含与SEQID No. 2的核苷酸1431至核苷酸1462或SEQ ID No. 3的核苷酸220至261或所述序列的互补序列基本上相似的核苷酸序列，并且所述第二核酸分子包含与SEQ ID No. 14的核苷酸301至核苷酸322或SEQ ID No. 15的核苷酸487至518或所述序列的互补序列基本上相似的核苷酸序列。
77.—种大豆植物，其在其基因组中按顺序包含下列核苷酸序列 a)SEQ ID No 2的核苷酸I至1451的核苷酸序列； b)SEQID I的核苷酸6760至核苷酸6958的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列； c)SEQ ID I的核苷酸6874至核苷酸7298的核苷酸序列； d)SEQ ID I的核苷酸7至核苷酸7291的核苷酸序列； e)SEQID I的核苷酸12至核苷酸7265的核苷酸序列； f)SEQ ID 3的核苷酸217至核苷酸240的核苷酸序列；和 g)SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的核苷酸序列并且还按顺序包含下列序列 h)SEQ ID No 14的核苷酸I至311的核苷酸序列； i)SEQID 11的核苷酸3458至核苷酸3848的核苷酸序列； j) SEQ ID 11的核苷酸413至核苷酸3457的核苷酸序列； k) SEQ ID 15的核苷酸508至核苷酸1880的核苷酸序列。
78.—种按顺序包含下列核苷酸序列的DNA分子 a)SEQ ID No 2的核苷酸I至1451的核苷酸序列； b)SEQID I的核苷酸6760至核苷酸6958的核苷酸序列的互补序列的核苷酸序列； c)SEQ ID I的核苷酸6874至核苷酸7298的核苷酸序列； d)SEQ ID I的核苷酸7至核苷酸7291的核苷酸序列； e)SEQID I的核苷酸12至核苷酸7265的核苷酸序列； f)SEQ ID 3的核苷酸217至核苷酸240的核苷酸序列； g)SEQ ID No 3的核苷酸241至核苷酸1408的核苷酸序列；并且还按顺序包含下列序列h)SEQ ID No 14的核苷酸I至311的核苷酸序列； i)SEQID 11的核苷酸3458至核苷酸3848的核苷酸序列； j) SEQ ID 11的核苷酸413至核苷酸3457的核苷酸序列； k) SEQ ID 15的核苷酸508至核苷酸1880的核苷酸序列；.
79.一种包含EE-GM3和EE-GMl的大豆植物、细胞、组织或种子，其在其细胞的基因组中包含与SEQ ID No. 2的核苷酸1431至1472具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列和与SEQ ID No. 3的核苷酸220至261或所述序列的互补序列具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列，以及还有与SEQ ID No. 12的核苷酸199至220具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列和SEQ ID No. 13的核苷酸558至579或所述序列的互补序列具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列。
80.一种包含EE-GM3和EE-GM2的大豆植物、细胞、组织或种子，其在其细胞的基因组中包含与SEQ ID No. 2的核苷酸1431至1472具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列和与SEQ ID No. 3的核苷酸220至261或所述序列的互补序列具有至少80%、90%,95%或100%的序列同一性的核酸序列，以及还有与SEQ ID No. 14的核苷酸301至322具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列和与SEQ ID No. 15的核苷酸497至518或所述序列的互补序列具有至少80%、90%、95%或100%的序列同一性的核酸序列。
81.—种大豆植物、植物细胞、组织或种子，在它们的基因组中包含核酸分子，所述核酸分子包含与SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互补序列具有至少97%、98%或至少99%的序列同一性的核苷酸序列，或与SEQ ID No. 20或其互补序列具有至少97%、98%或至少99%的序列同一性的核苷酸序列，以及在它们的基因组中包含核酸分子，所述核酸分子包含与EE-GMl或EE-GM2的核苷酸序列或其互补序列具有至少97%、98%或至少99%的序列同一性的核苷酸序列，已于保藏号NCIMB 41658下保藏在NCIMB的包含所述事件EE-GMl的参照种子，和已于保藏号NCMB 41660下保藏在NCMB的包含所述事件EE-GM2的参照种子，例如其中所述EE-GMl或EE-GM2的核苷酸序列分别包含或为SEQ ID No 12或13中的外源DNA序列或SEQ ID No 14或15中的外源DNA序列，分别包含或为植物基因组中的SEQ ID No 12的序列与SEQ ID No 13的序列之间的外源DNA序列或植物基因组中的SEQ ID No 14的序列与SEQ ID No 15的序列之间的外源DNA序列。
82.—种大豆植物、植物细胞、组织或种子，在它们的基因组中包含核酸分子，所述核酸分子与SEQ ID No I的核苷酸序列或其互补序列杂交，或与SEQ ID No. 20的核苷酸位置1452至核苷酸位置16638的核苷酸序列或其互补序列杂交，或与SEQ ID No. 20的核苷酸序列或其互补序列杂交，以及在它们的基因组中包含与EE-GMl或EE-GM2的核苷酸序列或其互补序列杂交的核酸分子，已于保藏号NCMB 41658下保藏的包含EE-GMl的参照种子，和已于保藏号NCMB 41660下保藏的包含EE-GM2的参照种子，例如其中所述EE-GMl或EE-GM2的核苷酸序列包含或为SEQ ID No 12或13中的外源DNA序列，或SEQ ID No 14或15中的外源DNA序列，或植物基因组中的SEQ ID No 12的序列与SEQ ID No 13的序列之间的外源DNA序列，或植物基因组中的SEQ ID No 14的序列与SEQ ID Nol5的序列之间的外源DNA序列。
全文摘要
本发明提供了特定的转基因大豆植物、植物材料和种子，其特征在于此类产物在大豆基因组的特定位置上具有一堆特定的转化事件。还提供了使得能够在生物样品中快速且明确地鉴定此类事件的工具。
文档编号A01H1/02GK103003443SQ201080061916
公开日2013年3月27日 申请日期2010年11月23日 优先权日2009年11月23日
发明者J·T·梅森, L·J·莱托, M·A·艾比, W·H·艾比, G·威尔兹, S·维尔哈格, M·德伯克利尔, V·哈贝克斯, J-M·菲卢洛 申请人:拜尔作物科学股份有限公司, Ms技术有限责任公司