专利名称：一种离体培养甜菜再生植株的方法及专用培养基的制作方法
技术领域：
本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种离体培养甜菜再生植株的方法及专
用培养基。
背景技术：
植物组织培养的核心理论依据是植物细胞的“全能性”(Totipotency)。植物细胞 的全能性是指植物的每个细胞都具有该植物的全部遗传信息，在一定培养条件下离体细胞 具有发育成完整植株的潜在能力。1756年，Duhamel就发现愈伤组织的形成。1838年，施 来登提出植物细胞学说。1839年T. khwarm提出细胞有机体的每一个生活细胞在适宜的外 部环境条件下都有独立发育的潜能。1878年，Vocbtimg完成切枝经典试验，奠定了植物组 织培养的基础。1902年，德国植物学家Haberlandt在细胞学说的基础上，大胆提出要在试 管中人工培育植物。他预言离体的植物细胞具有发育上的全能性，能够发育成为完整的植 物体，即任何一个植物细胞都具有形成该植物体的能力。1934年White以番茄为材料，建立 了第一个无限生长的根无性系。1948年，我国植物生理学家崔微和美国科学家合作，用不 同种类和比例的植物激素处理离体培养的烟草茎段，发现腺嘌呤和生长素的比例是控制芽 和根形成的主要条件之一。1958年，美国植物学家F. C. Meward等人用胡萝卜韧皮部的细 胞进行培养，终于得到了完整植株，并且这一植株能够开花结实，证实了 Haberlandt关于 细胞全能性的推断。甜菜是有名的难以进行组织培养的一种作物，De Greef等(1979)报 道了一种改进的培养基，使一个株系的愈伤组织产生了再生芽。通过器官发生或体细胞胚 的发生来诱导再生植株即离体技术的运用将使大多数植物的再生得到进一步地改善，但由 愈伤组织的器官再生的频率不高，一些科研工作者已经报道了由愈伤组织直接诱导根的生 成，但完整植株再生成功的例子不多，并且由愈伤组织诱导不定芽再生频率低、重复性差。甜菜是再生难度较大的植物，再生频率较其他植物而言相对较低，很难突破10% 以上。目前甜菜生物技术研究工作主要集中在建立高频率、稳定、简便可重复的植株再生体 系，从而为开展基因程研究工作奠定坚实的基础。目前，还未见有关建立高效离体培养甜菜 再生植株及相关培养基的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种离体培养甜菜再生植株的方法及其专用培养基，本发 明简单易行，操作方便，外植体取材方便，再生植株的再生速度较快，再生频率较以往的方 法高，可加快甜菜的基因工程育种及开发进度。本发明的技术方案如下一种高效培养离体甜菜再生植株的方法，主要步骤包括A、破除甜菜种子的种壳，选择并剥出完整无缺、未受伤害、发育饱满的种子或种 胚；在无菌条件下，种子先用70%乙醇消毒30s，无菌水冲洗2次，再用0. HgC12灭菌 lOmin，用无菌水冲洗5次；将灭菌后的种子或种胚用灭菌滤纸吸干水份后，接种在1/2MS固体培养基表面，每瓶放10-15粒种子；接种后将种子或种胚放入恒温培养箱中25°C恒温暗 培养，待萌发后，在光照培养箱中25°C 2000-30001X继续光照培养。B、步骤A所得甜菜无菌苗长至1-2片真叶时，将顶芽切下，接种于丛生芽诱导培养 基中继续光照培养，25°C、20001X、1^!光照培养，2周继代一次，共继代2次。C、待顶芽周围分化出的丛生芽长至34cm时，切下叶柄，接种于专用培养基中继 续光照培养，25°C、20001X、1^!光照培养，继代2次，得到再生苗；所述专用培养基按mg/L 或g/L为单位组分及配比如下MS基本培养基+7. 4g/L琼脂+30g/L蔗糖+6-苄氨基嘌呤 1. Omg/L+吲哚乙酸0. 3mg/L, pH5. 8，加蒸馏水水定容至1L，高压灭菌；D、将再生苗接种至MS基本培养基继代培养，直至得到再生植株。甜菜再生植株的专用培养基，按mg/L或g/L为单位组分及配比如下MS基本培养 基+7. 4g/L琼脂+30g/L蔗糖+6-苄氨基嘌呤1. Omg/L+吲哚乙酸0. 3mg/L, ρΗ5· 8，加蒸馏 水水定容至1L，高压灭菌。所述的专用培养基在离体培养甜菜再生植株上的应用。所述的高效培养离体甜菜再生植株的方法，所述的甜菜属糖用甜菜品种或饲用甜 菜品种。所述的高效培养离体甜菜再生植株的方法，所述MS基本培养基:MS有机物+7. 4g/ L 琼脂 +30g/L 蔗糖，pH5. 8。所述的高效培养离体甜菜再生植株的方法，所述1/2MS培养基中矿质元素、有机 成分和蔗糖用量为MS培养基的一半，琼脂用量与MS培养基相同，pH 5. 8。所述的高效培养离体甜菜再生植株的方法，丛生芽诱导培养基:MS基本培养基 +7. 4g/L 琼脂 +30g/L 蔗糖 +6-苄氨基嘌呤 0. 3mg/L, pH 5. 8。本发明较其它甜菜离体再生培养方法具有以下优点和效果1、由甜菜顶芽诱导出丛生芽，无需经过愈伤组织培养可直接获得再生植株。2、与传统方法相比较，再生率提高至14 %，培养方法与培养基配制简单易操作，再 生周期短。3、取材不受基因型及季节限制，约50d即可获得再生植株。
具体实施例方式以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。实施方案1 无菌苗及丛生芽制备在制备无菌苗前先需人工破除甜菜种子粗糙种壳，保证种胚完整。用70%乙醇表 面消毒30s，无菌水冲洗2次；再用0. 1% HgCl2灭菌lOmin，用无菌水冲洗5次。将灭菌后 的种子(或种胚)用灭菌滤纸吸干水分后，接种在1/2MS固体培养基表面，每瓶放10-15粒 种子。接种后将种子放入恒温培养箱中25°C恒温暗培养，待出种子萌发后，在光照培养箱中 250C 2000-30001x继续光照培养。待甜菜无菌苗长至1-2片真叶时，将顶芽切下，插入丛生芽诱导培养基(MS， 6-BA0.25mg.L-l)中继续光照培养，2周继代一次。待顶芽周围分化出的丛生芽长至34cm 时即可。待分化出的丛生芽长至34cm时，切下丛生芽叶柄，接入添加不同激素及激素不同浓度的培养基(基本培养基为MS培养基)中，在光照培养箱中25°C，光照强度为 2000-30001x，光周期为16/8d，继续光照培养，约15d左右调查不定芽的再生率，选择再生 率最高的Bll培养基作为甜菜离体培养再生专用培养基，即该专用培养基配方为MS基本 培养基+7. 4g/L琼脂+30g/L蔗糖+6-苄氨基嘌呤1. Omg/L+吲哚乙酸0. 3mg/L, ρΗ5· 8 (见 表1)。表1不同激素和浓度组合对再生的影响
权利要求
1.一种离体培养甜菜再生植株的方法，其特征在于，包括以下步骤A、破除甜菜种子的种壳，选择并剥出完整无缺、未受伤害、发育饱满的种子或种胚；在 无菌条件下，先用70 %乙醇消毒30s，无菌水冲洗2次，再用0. 1 % HgCl2灭菌lOmin，用无 菌水冲洗5次；将灭菌后的种子或种胚用灭菌滤纸吸干水份后，接种在1/2MS固体培养基表 面，每瓶放10-15粒种子；接种后将种子或种胚放入恒温培养箱中25°C恒温暗培养，待萌发 后，在光照培养箱中25°C 2000-30001x继续光照培养；B、步骤A所得甜菜无菌苗长至1-2片真叶时，将顶芽切下，接种于丛生芽诱导培养基中 继续光照培养，251^20001^1 光照培养，2周继代一次，共继代2次；C、待顶芽周围分化出的丛生芽长至34cm时，切下叶柄，接种于专用培养基中继续光 照培养，25°C、20001x、16h光照培养，继代2次，得到再生苗；所述专用培养基按mg/L或g/L 为单位组分及配比如下MS基本培养基+7. 4g/L琼脂+30g/L蔗糖+6-苄氨基嘌呤1. Omg/ L+吲哚乙酸0. 3mg/L, pH5. 8，加蒸馏水水定容至1L，高压灭菌；D、将再生苗接种至MS基本培养基继代培养，直至得到再生植株。
2.如权利要求1所述的离体培养甜菜再生植株的方法，其特征在于，所述的甜菜属糖 用甜菜品种或饲用甜菜品种。
3.如权利要求1所述的离体培养甜菜再生植株的方法，其特征在于，所述MS基本培养 基MS有机物+7. 4g/L琼脂+30g/L蔗糖，pH5. 8。
4.如权利要求1所述的离体培养甜菜再生植株的方法，其特征在于，所述1/2MS培养基 中矿质元素、有机成分和蔗糖用量为MS培养基的一半，琼脂用量与MS培养基相同，pH 5. 8。
5.如权利要求1所述的离体培养甜菜再生植株的方法，其特征在于，丛生芽诱导培养 基MS基本培养基+7. 4g/L琼脂+30g/L蔗糖+6-苄氨基嘌呤0. 3mg/L, pH 5. 8。
6.离体培养甜菜再生植株的的专用培养基，其特征在于，按mg/L或g/L为单位组分及 配比如下MS基本培养基+7. 4g/L琼脂+30g/L蔗糖+6-苄氨基嘌呤1. Omg/L+吲哚乙酸 0. 3mg/L, pH5. 8，加蒸馏水水定容至1L，高压灭菌。
全文摘要
本发明公开了一种高效培养离体甜菜再生植株的方法及专用培养基。本发明的步骤如下A、破除甜菜种子种壳，选择并剥出完整无缺、未受伤害、发育饱满的种子或种胚。经灭菌置于1/2MS固体培养基，光照恒温培养得到无菌苗。B、步骤A所得甜菜无菌苗长至1-2片真叶时，将顶芽切下，接种于丛生芽诱导培养基中，25℃、2000lx、16h光照培养，2周继代一次，共继代2次。C、待顶芽周围分化出的丛生芽长至3-4cm时，切下叶柄，接种于专用培养基中，25℃、2000lx、16h光照培养，继代2次，得到再生苗，再生频率高达14％。本发明所使用方法及培养基具有再生频率高，操作方法及培养基配制简单易行，操作方便。再生周期短，不受基因型及季节限制。
文档编号A01H4/00GK102124951SQ20111000872
公开日2011年7月20日 申请日期2011年1月17日 优先权日2011年1月17日
发明者危晓薇, 李建平, 足木热木, 邵琳, 郝晓燕, 陈勋基, 黄全生 申请人:新疆农业科学院核技术生物技术研究所