专利名称：一种由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法和该锌指核酸酶及其表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法和该锌指核酸酶及其表达载体。
背景技术：
传统的基因靶向修饰依赖于细胞内自然发生的同源染色体的随机交换，特异性不高，效率也非常低，通常为10_6级，增加了实际操作中的工作量，限制了这些技术的应用。由于在人体细胞内同源重组的效率特别低，通过单纯的同源重组实现人类基因组的永久修复是不切实际的，这也严重阻碍了生物医学的研究和安全有效的基因治疗的进展。锌指核酸酶(ZFNs)技术是新近发展起来的一种可用于动植物转基因、人类遗传疾病基因治疗以及微生物基因组改造的新兴技术。锌指核酸酶是一种人工合成酶，此酶含有两个功能性结构域锌指蛋白构成的DNA结合域和非特异性核酸酶构成(Fok I)催化域。 这种核酸酶就像一把剪刀，可识别特异的DNA位点并切割DNA，通过细胞内固有的DNA双链断裂修复机制，在导入引入外源基因的前提下，达到在该位点插入外源基因，或者将该位点的基因敲除的目的。目前该技术以其高效性和特异性受到高度重视。近几年来，已经有多篇研究成果在NATURE、SCIENCE等杂志上发表。这一技术的特异性和高效性已经在果蝇、植物细胞和人类细胞中得到验证。哺乳动物细胞对锌指核酸酶产生的DNA双链切口(DSB)具有自我修复功能，修复的方法有同源重组(HR)和非同源重组末端连接(NHEJ)两种。应用同源重组(HR)修复机制的情况下，可以在该位点插入一个外源基因，产生转基因细胞(KNOCK-IN)；应用细胞固有的非同源重组末端链接(NHEJ)机制的情况下，细胞在修复断裂的DNA双链时，需要去掉断口处几个核苷酸，从而导致该基因阅读框的改变，从而实现该基因定向敲除(KNOCK-OUT)。目前对锌指核酸酶转基因技术的研究主要集中在国外，国内尚未见相关报道。 2006年，Kelly Beumer等利用锌指核酸酶对果蝇的生殖细胞基因组的y和ry位点定向打靶，发现诱导后的生殖细胞形成的亲本几乎都发生了突变，而且这些亲本的后代有25%的新突变体，大部分的新突变体都有通过同源重组插入的带有标记基因的目的基因。这表明锌指核酸酶在果蝇生殖细胞定向打靶中具有高效性和特异性。2008年Yarmick Doyon在斑马鱼ntl基因敲除的研究中，将锌指核酸酶的mRNA注入斑马鱼的单细胞胚胎，成体后在锌指核酸酶的识别位点上发生了高效率的突变，且出现了预期的特定性状消失现象，ntl基因的平均突变率为20%。利用锌指核酸酶对斑马鱼基因敲除的高效性和特异性说明，这种方法可以应用于斑马鱼或其他生物基因组任何位点的敲除，前提是将锌指核酸酶的mRNA注入生物体的受精卵中，且能稳定表达。通过不断的探索和改进，目前锌指核酸酶技术已经成功应用于各种动植物的基因敲除或转基因研究中。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中由于常规转基因过程中位置效应和插入失活等原因导致的动物转基因技术的瓶颈问题一内源基因无法定向敲除和外源基因无法高效定向导入的问题提供了一种由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法和该锌指核酸酶及其表达载体。。本发明的技术方案如下一种由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法，包括下述步骤(1)、内源基因靶位点的选择根据内源基因序列特异性选择二聚体ZFN(锌指核酸酶)识别并结合的靶位点；(2)、构建穿梭载体 pAdTrack-CMV-T2A ；(3)、将步骤⑴中的二聚体ZFN插入步骤⑵中构建的ZFN腺病毒表达载体 pAdTrack-CMV-T2A中，得到目的质粒pAdTrack-CMV-T2A_ZFN ；取Pme I内切酶线性化的该质粒和腺病毒骨架载体pAD-ea sy共转化到大肠杆菌BJ5183感受态中同源重组，得到重组 ZFN腺病毒载体pAd-T2A-ZFN ；(4)、腺病毒包装，得到ZFN腺病毒；(5)、步骤(4)得到的ZFN腺病毒转染哺乳动物细胞。上述技术方案中所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法， 其中，所述步骤(1)中二聚体ZFN包含左边ZFN编码序列和右边ZFN编码序列，其中左边ZFN 编码的序列如SEQ ID NO. 1所示，右边ZFN编码的序列如SEQ ID NO. 2所示；二聚体ZFN识别并结合的靴位点序列为 SEQ ID NO. 3 所示的 5，-GGTCATCCTCATCCTGATAAACTGCAAAAGG-3， ，其互补链序列为 3，-CCAGTAGGAGTAGGACTATTTGACGTTTTCC-5，。上述技术方案中所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法， 其中，所述步骤O)中穿梭载体pAdTrack-CMV-T2A的构建是通过在pAdTrack_CMV系统的多克隆位点Mil和》ιοΙ之间插入T2A剪切肽，使得多克隆位点区变为Acc65I、KpnI, Seal、Sail、T2A 剪切肽、ClaI、MLuI、BstBI、XhoI 和 Bgl II，所述 pAdTrack-CMV 系统的序列如SEQ ID NO. 7所示，所述T2A剪切肽的序列如SEQ ID NO. 5所示，所述穿梭载体 pAdTrack-CMV-T2A 的序列如 SEQ ID N0. 4。上述技术方案中所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法， 其中，所述步骤(3)中重组ZFN腺病毒载体pAd-T2A-ZFN的制备是将SEQ ID NO. 1所示的左边ZFN编码序列插入到SEQ ID N0. 4所示的穿梭载体pA(Trrack-CMV-T2A的KpnI和MlI两酶切位点之间，将SEQ ID N0. 2所示的右边ZFN编码序列插入到SEQ ID N0. 4所示的穿梭载体 pAdTrack-CMV-T2A 的 ClaI 和 XhoI 两酶切位点，得到目的质粒 pAdTrack-CMV-T2A_ZFN ； 取Pme I线性化的该质粒和腺病毒骨架载体pAD-easy共转化到大肠杆菌BJ5183感受态中重组，于LB+30y g/mL kanamycin的固体培养基上37°C培养过夜，提取质粒，Pac I酶切鉴定，得到序列如SEQ ID N0. 6所示的重组ZFN腺病毒载体pAd-T2A_ZFN。上述技术方案中所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法， 其中，步骤(4)所述的腺病毒包装是指重组ZFN腺病毒载体pAd-T2A-ZFN经用I^c I内切酶处理后，用脂质体2000将I^c I内切酶线性化的质粒pAd-T2A-ZFN转染293细胞，进行腺病毒包装，得到重组ZFN腺病毒。
上述技术方案中所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法， 其中，步骤( 所述的腺病毒转染哺乳动物细胞是指用ZFN腺病毒感染Hela229，得到细胞株 Hela229-ZFN。上述技术方案中所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法中所采用的二聚体ZFN，其中，所述二聚体ZFN包含左边ZFN编码序列和右边ZFN编码序列， 其中左边ZFN编码的序列如SEQ IDN0. 1所示，右边ZFN编码的序列如SEQ ID NO. 2所示， 所述二聚体ZFN识别并结合的靶位点序列为SEQ ID NO. 3所示的5，-GGTCATCCTCATCCTGAT AAACTGCAAAAGG-3，，其互补链序列为 3，-CCAGTAGGAGTAGGACTATTTGACGTTTTCC-5，。上述技术方案中所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法所采用的穿梭载体pAdTrack-CMV-T2A，其特征在于所述穿梭载体pAdTrack-CMV-T2A的序列如SEQ ID NO. 4所示。上述技术方案中所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法中所采用的重组ZFN腺病毒表达载体pAd-T2A-ZFN，其中，所述重组ZFN腺病毒表达载体 pAd-T2A-ZFN 的序列如 SEQ ID NO. 6 所示。上述技术方案中所述的pA(Trrack-CMV-T2A-ZFN是指在SEQ ID NO. 4所示的ZFN 腺病毒表达载体pAdTrack-CMV-T2A的KpnI和MlI两酶切位点之间含有SEQ ID NO. 1所示的左边ZFN编码序列，在ClaI和BioI两酶切位点含有SEQ ID N0. 2所示的右边ZFN编码序列。上述技术方案中所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法中所采用的ZFN腺病毒，其中，所述ZFN腺病毒是由重组ZFN腺病毒载体pAd-T2A_ZFN经用 Pac I内切酶处理后，用脂质体2000将I^c I内切酶处理过的目的质粒pAd_ZFN转染四3 细胞，进行腺病毒包装，得到的重组ZFN腺病毒。本发明所述的方法具有以下有益效果1、本专利用腺病毒介导ZFN的导入，也可以用其他的病毒转染或其他的导入ZFN 的表达序列方式；2、利用ZFN技术，动物哺乳细胞基因突变效率达到13%，在有供体DNA片段存在的前提下，5%的动物哺乳细胞该基因发生了同源重组。大大提高了内源基因的定向敲除和外源基因高效定向导入效率。
1、图1为ZFN腺病毒表达载体pAdTrack-CMV_T2A图谱；2、图2为2%琼脂糖胶检测T7核酸内切酶I与异源二聚体DNA反应结果。
具体实施例方式为使本发明的技术方案便于理解，以下结合具体实施方式
对本发明作进一步的说明。实施例一、由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法一、内源基因靶位点的选择根据内源基因序列特异性和具体的需要选择二聚体ZFN识别并结合的靶位点，所述二聚体ZFN包含左边ZFN编码序列和右边ZFN编码序列，其中左边ZFN编码序列的如SEQID NO. 1所示，右边ZFN编码序列的序列如SEQ ID NO. 2所示；二聚体ZFN识别并结合的靶位点序列为 SEQ ID NO. 3 所示 5，-GGTCATCCTCATCCTGATAAACTGCAAAAGG-3，，其互补链序列为 3' -CCAGTAGGAGTAGGACTATTTGACGTTTTCC-5'；二、构建穿梭载体 pA(Trrack-CMV-T2A 对穿梭载体pAdTrack-CMV进行改造，在其多克隆位点处Mil和BioI之间插入 Τ2Α 剪切肽，序列为TTCGAAACGCGTATCGATGGCTCCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTGCTAACATGCGGTGA CGTCGAGGAGAATCCTGGCCCA,如 SEQ ID NO. 5 所示，使得 pAdTrack-CMV_T2A 系统多克隆位点区变为 Acc65 I,Kpn I,Sca I.Sal I、T2A 剪切肽、Cla I,Mlu I,Bst BI,Xho I 和 Bgl II, 其图谱如图1所示。三、重组ZFN腺病毒载体pAd-T2A_ZFN的制备将SEQ ID NO. 1所示的左边ZFN编码序列插入到SEQ ID N0. 4所示的穿梭载体pAcWrack-CMV-TZA的KpnI和MlI两酶切位点之间，将SEQ ID N0. 2所示右边 ZFN编码序列插入到SEQ I D N0. 4所示的穿梭载体pAcWrack-CMV-TZA的Cla I和 Xho I两酶切位点。得到目的质粒pAdTrack-CMV-T2A-ZFN;用Riie I内切酶线性化质粒 pAdTrack-CMV-T2A-ZFN约1 μ g (酶切体系如下表)，按Takara核酸共沉剂操作说明纯化线性化的质粒，溶于8 μ L ddH20,约IOOng/ μ L0取1 μ L Rne I线性化的该质粒和1 μ L腺病毒骨架载体pAD-easy (lOOng/ μ L)共转化到大肠杆菌BJ5183感受态中重组，于LB+30 μ g/ mL kanamycin的固体培养基上37°C培养过夜，提取质粒，Pac I酶切鉴定，阳性质粒被切割为301Λ大片段和3. O或4. 5kb的小片段。得到ZFN腺病毒载体pAd-T2A_ZFN。
权利要求
1.一种由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法，包括下述步骤(1)、内源基因靶位点的选择根据内源基因序列特异性选择二聚体ZFN识别并结合的靶位点；(2)、构建穿梭载体pAdTrack-CMV-T2A ；(3)、将步骤⑴中的二聚体ZFN插入步骤⑵中构建的ZFN腺病毒表达载体 pAdTrack-CMV-T2A中，得到目的质粒pAdTrack-CMV-T2A_ZFN ；取Pme I内切酶线性化的该质粒和腺病毒骨架载体pAD-easy共转化到大肠杆菌BJ5183感受态中同源重组，得到重组 ZFN腺病毒载体pAd-T2A-ZFN ；(4)、腺病毒包装，得到ZFN腺病毒；(5)、步骤(4)得到的ZFN腺病毒转染哺乳动物细胞。
2.根据权利要求1所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法，其特征在于所述步骤(1)中二聚体ZFN包含左边ZFN编码序列和右边ZFN编码序列，其中左边ZFN编码的序列如SEQ ID NO. 1所示，右边ZFN编码的序列如SEQ ID NO. 2所示；二聚体 ZFN识别并结合的靶位点序列为SEQ ID NO. 3所示的5，-GGTCATCCTCATCCTGATAAACTGCAAAA GG-3，，其互补链序列为 3，-CCAGTAGGAGTAGGACTATTTGACGTTTTCC-5，。
3.根据权利要求1所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法， 其特征在于所述步骤O)中穿梭载体pAdTrack-CMV-T2A的构建是通过在pAdTrack-CMV 系统的多克隆位点Mil和》ιοΙ之间插入T2A剪切肽，使得多克隆位点区变为Acc 651、 KpnI、Seal, Sail、T2A 剪切肽、ClaI、MluI、BstBI、XhoI 和 Bgl II，所述 pAdTrack-CMV 系统的序列如SEQ ID NO. 7所示，所述T2A剪切肽的序列如SEQ ID NO. 5所示，所述穿梭载体 pAdTrack-CMV-T2A 的序列如 SEQ ID NO. 4。
4.根据权利要求1所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法，其特征在于所述步骤(3)中重组ZFN腺病毒载体pAd-T2A-ZFN的制备是将SEQ ID NO. 1所示的左边ZFN编码序列插入到SEQ ID NO. 4所示的穿梭载体pAdTrack-CMV_T2A 的KpnI和Mil两酶切位点之间，将SEQ ID NO. 2所示的右边ZFN编码序列插入到SEQ ID NO. 4所示的穿梭载体pAdTrack-CMV-T2A的ClaI和BioI两酶切位点，得到目的质粒 pAdTrack-CMV-T2A-ZFN ；取Rne I线性化的该质粒和腺病毒骨架载体pAD-easy共转化到大肠杆菌BJ5183感受态中重组，于LB+30y g/mL kanamycin的固体培养基上37°C培养过夜，提取质粒，Pac I酶切鉴定，得到序列如SEQ ID NO. 6所示的重组ZFN腺病毒载体 pAd-T2A-ZFN。
5.根据权利要求1所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法，其特征在于步骤(4)所述的腺病毒包装是指重组ZFN腺病毒载体pAd-T2A-ZFN经用I^c I 内切酶处理后，用脂质体2000将I^c I内切酶线性化的质粒pAd-T2A-ZFN转染293细胞， 进行腺病毒包装，得到重组ZFN腺病毒。
6.根据权利要求1所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法，其特征在于步骤( 所述的腺病毒转染哺乳动物细胞是指用ZFN腺病毒感染Hela229，得到细胞株 Hela2^-ZFN。
7.权利要求1所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法所采用的二聚体ZFN，其特征在于所述二聚体ZFN包含左边ZFN编码序列和右边ZFN编码序列，其中左边ZFN编码的序列如SEQ ID NO. 1所示，右边ZFN编码的序列如SEQ ID NO. 2所示， 所述二聚体ZFN识别并结合的靶位点序列为SEQ ID NO. 3所示的5，-GGTCATCCTCATCCTGAT AAACTGCAAAAGG-3，，其互补链序列为 3，-CCAGTAGGAGTAGGACTATTTGACGTTTTCC-5，。
8.权利要求1所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法所采用的穿梭载体pAdTrack-CMV-T2A，其特征在于所述穿梭载体pAdTrack-CMV_T2A的序列如 SEQ ID NO. 4 所示。
9.权利要求1所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法所采用的重组ZFN腺病毒载体pAd-T2A-ZFN，其特征在于所述重组ZFN腺病毒表达载体 pAd-T2A-ZFN 的序列如 SEQ ID NO. 6 所示。
10.权利要求1所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法所采用的ZFN腺病毒，其特征在于所述ZFN腺病毒是由重组ZFN腺病毒载体pAd-T2A_ZFN经用 Pac I内切酶处理后，用脂质体2000将I^c I内切酶处理过的目的质粒pAd_ZFN转染293 细胞，进行腺病毒包装，得到的重组ZFN腺病毒。
11.权利要求1所述的由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法所采用的目的质粒pAdTrack-CMV-T2A-ZFN是指在SEQ ID N0. 4所示的ZFN腺病毒表达载体 pAdTrack-CMV-T2A的KpnI和MlI两酶切位点之间含有SEQ ID NO. 1所示的左边ZFN编码序列，在ClaI和BioI两酶切位点含有SEQ ID N0. 2所示的右边ZFN编码序列。
全文摘要
本发明一种由锌指核酸酶介导的哺乳动物内源基因定向敲除的方法和该锌指核酸酶及其表达载体，属于基因工程技术领域。其中所述的方法包括(1)内源基因靶位点的选择；(2)构建穿梭载体pAdTrack-CMV-T2A；(3)制备重组ZFN腺病毒载体pAd-T2A-ZFN；(4)腺病毒包装，得到ZFN腺病毒；(5)步骤(4)得到的ZFN腺病毒转染哺乳动物细胞。本发明利用ZFN技术，使动物哺乳细胞基因突变效率达到13％，大大提高了内源基因的定向敲除效率。
文档编号A01K67/027GK102174576SQ20111002736
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月25日 优先权日2011年1月25日
发明者任刚, 张婷婷, 张存芳, 张智英, 李亚明, 李战伟, 杨涵江, 王令, 王瑞, 雷洁, 麻丽霞 申请人:西北农林科技大学