专利名称：一种白花泡桐优树试管嫁接幼化的方法
技术领域：
本发明涉及一种泡桐优树的幼化方法，特别是一种白花泡桐优树试管嫁接幼化的方法，它适用于对白花泡桐成熟化效应严重的优树材料进行幼化，提高了白花泡桐优树的无性繁殖能力。
背景技术：
泡桐是我国最重要的速生优质用材树种和生态防护树种之一，在我国商品林建设和生态环境保护方面一直发挥着不可替代的作用。我国也是世界上泡桐种质资源最丰富、分布范围最广的国家，仅大陆就有九种两变种和众多变异类型。其中白花泡桐生长快，适应范围广，抗性强，材质优良，在我国南方泡桐产区占有十分重要的地位。然而，由于自然和人为等种种原因，我国泡桐种质资源日趋减少，特别是一些珍贵泡桐资源遭到毁灭性破坏或已濒临灭绝，这严重威胁着我国特有珍贵资源的生存与发展。挽救、保护和综合利用泡桐种质资源已迫在眉睫，收集优良泡桐种质资源并进行无性繁殖是挽救和保护泡桐种质资源的必要措施。目前，泡桐的繁殖主要采用埋根繁殖的方法。然而，受生长环境条件的限制，多数泡桐优树根段采集十分困难；部分优树虽然能够采集到根段，但萌芽率也很低，因此，对泡桐优树，很难进行埋根繁殖。泡桐优树材料的收集，主要采取收集优树枝条进行。受成熟效应的影响，所采集的优树枝条生理上严重衰弱，无性繁殖能力急剧降低，采用常规的扦插和组织培养均很难获得成功，采用常规嫁接方法，又不能获得优树材料自身的根系，使得以后的优良无性系测定和造林生产中埋根育苗无法正常进行。因此，要对老龄优树材料进行幼化，获得具有较强无性繁殖能力的根段材料，将老龄优树材料幼化并进行无性繁殖是育种研究工作中重要问题。
发明内容
本发明的目的是针对白花泡桐优树材料成熟化效应严重，无性繁殖能力低的突出问题，研究出一种白花泡桐优树试管嫁接幼化的方法。该方法是先将白花泡桐优树材料进行嫁接复壮，然后再通过组织培养和试管嫁接相结合进行幼化，它不但避免了白花泡桐优树根段采集难的问题，同时也使白花泡桐优树材料的幼化周期缩短，幼化效率大大提高，有力地推动了白花泡桐育种的进程。本发明的技术方案是这样实现的
一种白花泡桐优树试管嫁接幼化的方法，该方法包括以下步骤
(一)材料的嫁接复壮首先是将秋季、早春收集的白花泡桐优树枝条进行嫁接，嫁接方式采用芽接或枝接进行，砧木采用川泡桐无性系；
(二)组织培养和试管嫁接幼化4月中旬至8月底采集优树嫁接材料萌发的嫩枝进行组织培养和试管嫁接幼化，其过程包括以下几个步骤
第一步、外植体灭菌采集经嫁接复壮过的白花泡桐优树带腋芽茎段作为外植体，用洗洁精将嫩枝表面清洗干净，然后放在超净工作台上，进行表面灭菌，灭菌时，先用75%的酒精浸泡8 10秒后，快速用无菌水冲洗2 3次，再用0. 1% 0. 12%的氯化汞溶液浸泡5 8分钟，用无菌水冲洗3次，然后用无菌滤纸吸干材料表面的水，再用100 μ g/mL氨苄青霉素浸泡3分钟；
第二步、初代培养表面灭菌后的外植体材料经适当剪切处理后，接种到初代培养基中进行培养，培养条件为室温25 ^°C，光照强度2000 50001UX，光照时间每天8:00 20:00，初代培养5 8天后转接到相同培养基继续培养10 15天；
第三步、试管嫁接幼化切取初代培养萌发的嫩芽作为接穗，以建始桐3号为砧木进行无菌嫁接，嫁接方式采用劈接进行，嫁接后转接到嫁接幼化培养基中进行培养，培养条件同初代培养，培养10 15天，剪除砧木上的萌芽，继续培养25 30天；
第四步、继代增殖培养将已经幼化伸长，生长旺盛的白花泡桐优树接穗萌发的嫩芽， 剪切长度为1. 5 3. Ocm带1 2节的茎段，转移至增殖培养基中，进行增殖培养，增殖培养继代周期为25 35天，培养条件为室温27 ，光照强度3000 40001ux，光照时间每天8:00 20:00 ；
第五步、诱导生根切取长约3cm粗壮的白花泡桐幼化的嫩芽，转接在生根培养基中诱导生根，生根培养条件的室温为M ^TC,生根光照时间控制为每天12h，光照强度为 2000 40001ux,生根时间为7 12天；
第六步、炼苗和移栽待白花泡桐试管苗根长至1.0 1.5cm时，进行室内炼苗，炼苗时先洗净附着在根部的培养基，然后栽植到泥炭土和珍珠岩的混合基质中，混合基质中的草炭土和珍珠岩的比例为3 :1或2 :1，浇透水，覆盖保湿3 5天，25天后将幼苗移栽到口径为15cm的营养盆中，营养盆中装有沙壤土和泥炭土比例为4 1的混合基质，置于塑料大棚壮苗，壮苗过程中，根据需要及时浇水、喷施叶面肥溶液及预防病虫害，大棚壮苗一个半月， 进行大田移栽。进一步，所述的(一)材料的嫁接复壮中的嫁接时间是在秋季和早春进行；嫁接方式采用芽接和枝接，砧木采用川泡桐优树的川优3。进一步，所述的(二)组织培养和试管嫁接幼化的第二步、初代培养基步骤中的初代培养培养基为:MS + ^ig/L(2. 0 6. 0)6-BA+0. 3mg/L(0. 2 0. 5) NAA，再加入琼脂 5. Ig/ L,蔗糖30g/L,其PH值为5. 8 6. 0。进一步，所述的(二)组织培养和试管嫁接幼化的第三步、试管嫁接幼化步骤中的试管嫁接幼化培养基为MS+ (0. 1 0. 3) mg/LNAA，再加入琼脂5. lg/L，蔗糖浓度为15 30g/L, PH 值为 5. 8 6. 0。进一步，所述的(二)组织培养和试管嫁接幼化的第四步、继代增殖培养步骤中的增殖培养基为1/2MS +6 mg/L (4· 0 8· 0) 6-BA +0.3 mg/L NAA，再加入琼脂 5. lg/L， 蔗糖15 20g /L, PH值为5. 8 6. 0。进一步，所述的(二)组织培养和试管嫁接幼化的第五步、诱导生根步骤中的生根培养基为:l/2MS+(0. 1 0. 2 mg/L) NAA +(0 0. 2 mg/L)IBA，再加入琼月旨 5. 0 6. Og/ L，蔗糖 15 20g/L，PH 值为 5. 8 6. 0。本发明的积极效果是
1、本发明是将成熟化效应较严重的优树材料经嫁接复壮，再进行组织培养和试管嫁接幼化，它克服了白花泡桐优树根段采集难，埋根萌芽率低的缺点，有效地实现了白花泡桐优树的幼化，同时，也缩短了白花泡桐优树材料的幼化周期，提高了幼化效率，有力地推动了
5白花泡桐育种的进程。2、本发明解决了白花泡桐优树材料成熟化效应严重，无性繁殖能力低的突出问题，采用本技术进一步提高了白花泡桐优树的幼化成功率和幼化效率，降低了科研成本。3、通过本发明的实施，为白花泡桐优树的幼化开辟了一个新途径。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例1 以白花泡桐优树‘白优3’为例对本发明作进一步的详细说明。一种白花泡桐优树试管嫁接幼化的方法，该方法包括以下步骤
(一)材料的嫁接复壮首先将秋季、早春收集的在冬季经过室内沙藏处理的‘白优3’优树枝条，于4月中旬进行嫁接，嫁接方式采用劈接进行，选用直径4 5cm的健壮的川泡桐优树‘川优3’无性系作砧木，接穗萌发后，及时抹除砧木上的萌芽，依据生长情况，加强水肥及病虫害管理；
(二)组织培养和试管嫁接幼化5月中旬采集长度超过20cm的嫁接苗的嫩枝进行组织培养和试管嫁接幼化，其过程包括以下几个步骤
第一步、外植体灭菌采集经嫁接复壮过的白花泡桐优树嫩枝，剪切带腋芽茎段长度为 1. 2 1. 5cm，用洗洁精将嫩枝表面清洗干净，然后放在超净工作台上，进行表面灭菌，灭菌时，先用75%的酒精浸泡8秒后，快速用无菌水冲洗2次，再用0. 1%的氯化汞溶液浸泡7分钟后，用无菌水冲洗3次，然后用无菌滤纸吸干材料表面的水，再用100μ g/mL氨苄青霉素浸泡3分钟；
第二步、初代培养表面灭菌后的外植体材料经适当剪切处理后，接种到初代培养基中进行培养，初代培养基为MS + 4mg/L6-BA +0. 3 mg/LNAA，琼脂浓度为5. lg/L，蔗糖浓度为 30g/L, PH值为5. 8，置于光照培养室中进行培养，培养条件为室温25 ^°C，光照强度 30001ux，光照时间每天8 00 20 00，初代培养6天后，再转接到相同培养基继续培养10 天；
第三步、试管嫁接幼化试管嫁接采用劈接进行，砧木选用长度约如m，粗壮，去顶芽的 ‘建始桐3号’无性系组培苗茎段，接穗选用外植体经初代培养后萌发的长度约2cm嫩芽，嫁接时，先将砧木顶部劈开长约1cm，再将幼嫩的接穗基部用手术刀削成契形，嵌入到砧木顶部的切口中，然后用铝箔片绑扎好后，转接到幼化培养基中置于光照培养室中进行培养，幼化培养基为MS+0. ang/LNAA，琼脂浓度为5. lg/L，蔗糖30g/L，PH值为5. 8，光照培养室培养条件为室温25 ^°C，光照强度30001UX，光照时间每天8:00 20:00，培养10 15天， 剪除砧木上的萌芽，继续培养25 30天；
第四步、继代增殖培养将已经幼化伸长，生长旺盛的白花泡桐优树接穗萌发的嫩芽， 剪切成长度为2 3cm带1 2节的茎段，转移至继代增殖培养基中，进行增殖培养，继代增殖培养基为1/2MS + 8. 0mg/L6-BA+0. 4mg/L NAA,琼脂浓度为5. Og/L，蔗糖浓度为20g/ L，PH值5. 8，继代周期为32天，培养条件为室温27 ，光照强度3000 40001ux， 光照时间每天8:00 20:00 ；
第五步、诱导生根切取长3cm左右粗壮的白花泡桐幼化的嫩芽，转接在生根培养基中诱导生根，生根培养基为l/2MS+0. ang/LNAA，再加入琼脂5. Og/L，蔗糖15g/L，PH值为 5. 8，生根光照时间控制为每天12h，光照强度为30001UX，生根培养时间为10 12天；第六步、炼苗和移栽待白花泡桐试管苗根长至1. 0 1. 5cm左右，进行室内炼苗，炼苗时先洗净附着在根部的培养基，然后栽植到泥炭土和珍珠岩的混合基质中，草炭土和珍珠岩的比例为3 :1，浇透水，覆盖保湿3天，室内25天后将幼苗移栽到口径为15cm的营养盆中，营养盆中装有沙壤土和泥炭土比例为4 1的混合基质，置于塑料大棚壮苗，壮苗过程中根据需要及时浇水、喷施叶面肥溶液及预防病虫害，大棚壮苗一个半月，进行大田移栽。
权利要求
1.一种白花泡桐优树试管嫁接幼化的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(一)材料的嫁接复壮首先是将秋季、早春收集的在冬季经过室内沙藏处理的白花泡桐优树枝条进行嫁接，嫁接方式采用芽接或枝接进行，砧木采用J11泡桐无性系；(二)组织培养和试管嫁接幼化4月中旬至8月底采集优树嫁接材料萌发的嫩枝进行组织培养和试管嫁接幼化，其过程包括以下几个步骤第一步、外植体灭菌采集经嫁接复壮过的白花泡桐优树带腋芽茎段作为外植体，用洗洁精将嫩枝表面清洗干净，然后放在超净工作台上，进行表面灭菌，灭菌时，先用75%的酒精浸泡8 10秒后，快速用无菌水冲洗2 3次，再用0. 1% 0. 12%的氯化汞溶液浸泡 5 8分钟后，用无菌水冲洗3次，倒出无菌水，然后用无菌滤纸吸干材料表面的水，再用 100 μ g/mL氨苄青霉素浸泡3分钟；第二步、初代培养经表面灭菌后的外植体材料经适当剪切处理后，接种到初代培养基中进行培养，培养条件为室温25 28°C，光照强度2000 5000lux，光照时间每天8 00 20:00，初代培养5 8天后转接到相同培养基继续培养10 15天；第三步、试管嫁接幼化切取初代培养萌发的嫩芽作为接穗，以建始桐3号为砧木进行无菌嫁接，嫁接方式采用劈接进行，嫁接后转接到嫁接幼化培养基中进行培养，培养条件同初代培养，培养10 15天，剪除砧木上的萌芽，继续培养25 30天；将已经幼化伸长，生长旺盛的白花泡桐优树接穗萌发的嫩芽；第四步、继代增殖培养将已经幼化伸长，生长旺盛的白花泡桐优树接穗萌发的嫩芽， 剪切长度为1. 5 3. Ocm带1 2节的茎段，转移至增殖培养基中，进行增殖培养，增殖培养继代周期为25 35天，培养条件为室温27 29°C，光照强度3000 40001ux，光照时间每天8:00 20:00 ；第五步、诱导生根切取长约3cm的粗壮的白花泡桐幼化的嫩芽，转接在生根培养基中诱导生根，生根培养条件的室温为24 29°C，生根光照时间控制为每天12h，光照强度为 2000 40001ux,生根时间为7 12天；第六步、炼苗和移栽待白花泡桐试管苗根长至1.0 1.5cm左右，进行室内炼苗，炼苗时先洗净附着在根部的培养基，然后栽植到泥炭土和珍珠岩的混合基质中，混合基质中的草炭土和珍珠岩的比例为3 :1或2 :1，浇透水，覆盖保湿3 5天，25天后将幼苗移栽到口径为15cm的营养盆中，营养盆中装有沙壤土和泥炭土比例为4 1的混合基质，置于塑料大棚壮苗，壮苗过程中，根据需要及时浇水、喷施叶面肥溶液及预防病虫害，大棚壮苗一个半月，进行大田移栽。
2.根据权利要求1所述的一种白花泡桐优树试管嫁接幼化的方法，其特征在于(一) 材料的嫁接复壮中的嫁接时间秋季和早春进行，嫁接方式采用芽接和枝接，砧木采用川泡桐优树的川优3。
3.根据权利要求1所述的一种白花泡桐优树试管嫁接幼化的方法，其特征在于(二) 组织培养和试管嫁接幼化的第二步、初代培养基步骤中的初代培养培养基为MS + 4mg/ L (2. 0 6. 0) 6-BA+O. 3mg/L(0. 2 0. 5)NAA，再加入琼脂 5. lg/L，蔗糖 30g/L，其 PH 值为 5. 8 6. O0
4.根据权利要求1所述的一种白花泡桐优树试管嫁接幼化的方法，其特征在于(二) 组织培养和试管嫁接幼化的第三步、试管嫁接幼化步骤中的试管嫁接幼化培养基为MS+(0. 1 0. 3)mg/LNAA，再加入琼脂5. lg/L，蔗糖浓度为15 30g/L, PH值为5. 8 6. 0。
5.根据权利要求1所述的一种白花泡桐优树试管嫁接幼化的方法，其特征在于(二) 组织培养和试管嫁接幼化的第四步、继代增殖培养步骤中的增殖培养基为1/2MS +6 mg/ L (4. 0 8. 0) 6-BA +0. 3 mg/L NAA，再加入琼脂 5. lg/L，蔗糖 15 g / L 20g /L, PH 值为 5. 8 6. 0。
6.根据权利要求1所述的一种白花泡桐优树试管嫁接幼化的方法，其特征在于(二) 组织培养和试管嫁接幼化的第五步、诱导生根步骤中的生根培养基为=IAMS+ (0. 1 0. 2 mg/L) NAA + (0 0. 2 mg/L) IBA，再加入琼脂 5. 0 6. Og/L，蔗糖 15 20g/L，PH 值为 5. 8 6. O0
全文摘要
本发明提供了一种泡桐优树的幼化方法，即一种白花泡桐优树试管嫁接幼化的方法，该方法包括材料的嫁接复壮；组织培养和试管嫁接幼化；外植体灭菌；初代培养；试管嫁接幼化；继代增殖培养；诱导生根；炼苗和移栽步骤完成。本发明是将成熟化效应较严重的优树材料经嫁接复壮，再进行组织培养和试管嫁接幼化克服了白花泡桐优树根段采集难，埋根萌芽率低的缺点，有效地实现了白花泡桐优树的幼化，同时也缩短了白花泡桐优树材料的幼化周期，有力地推动了白花泡桐育种的进程；本发明解决了白花泡桐优树材料成熟化效应严重，无性繁殖能力低的突出问题，采用本技术进一步提高了白花泡桐优树的幼化的成功率和幼化效率，降低了科研成本。
文档编号A01G1/06GK102172219SQ20111003148
公开日2011年9月7日 申请日期2011年1月29日 优先权日2011年1月29日
发明者傅建敏, 刘昌勇, 吴硕, 张悦, 李芳东, 梁玉琴, 邓建军, 黄琳 申请人:国家林业局泡桐研究开发中心