专利名称：瑶山苣苔组织培养及快速繁殖的方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及瑶山苣苔的组织培养及快速繁殖的 方法。
背景技术：
瑶山苣苔(Dayaoshania cotinifolia W. T. Wang)是苦苣苔科多年生草本植物， 1983年由王文采命名发表的瑶山苣苔属植物新种，为中国广西特有植物。由于其居群数量 少，分布范围狭窄，并受人为活动的影响，其种群数量和分布面积急剧减少。在1999年国务 院颁布的《国家重点保护植物名录》(第一批)中被列为国家I级重点保护野生植物，被《中 国物种红色名录》(第一卷，2004)定为极危种。瑶山苣苔是苦苣苔科较原始的种，具有较高 的科研价值和经济价值，由于资源数量分布极其有限，生境特殊，其基础生物学研究近乎空 白，更谈不上对其进行繁育及开发利用。因此，利用瑶山苣苔叶片为外植体，通过组织培养 技术成功建立其快速繁殖技术体系，为该物种的生物学研究、遗传改良、种质资源保护和可 持续利用奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种瑶山苣苔组织培养及快速繁殖的方法。瑶山苣苔组织培养及快速繁殖的方法，以野外采集的瑶山苣苔植株叶片为外植 体，按以下步骤进行组织培养和快速繁殖(1)不定芽的初代诱导将瑶山苣苔植株叶片外植体经表面消毒后接种到诱导 培养基上，在温度25士3°C、光照强度20μπιΟ1 ·πΓ2 · s—1、光照时间12h/d的条件下，培养 100 140天后，叶片外植体诱导形成愈伤组织和不定芽，其中，所用的初代诱导培养基为 MS+6-BA 0. 1 ~ 0. 4mg · L-1+KT 0. 1 ~ 0. 4mg · L_1+IAB 0. 04 0. 05mg · L_1+Mg2+50mg · L-1+ 蔗糖 30g · L-1+ 琼脂 6g · L-1，pH 5. 0 ；(2)芽的继代增殖将愈伤组织和不定芽转入继代增殖培养基上，在温度 25士3°C、光照强度40μ mol ·πΓ2 光照时间Uh/d的条件下，培养50 60天，获得从生 芽，繁殖系数4. 6 5. 0/60d，每60天继代一次，其中，所用的继代增殖培养基为MS+2-ip 0. 05 0. 2mg · Γ1+ΚΤ0· 05 0. Img · L_1+IAB 0. 02mg · L_1+Mg2+50mg · L-1+ 蔗糖 30g · Γ1+ 琼脂 6β· ΛρΗ 5.0;(3)生根培养将丛生芽苗分切转入生根培养基上，在温度25士3°C、光照强度 40 μ mol ·πΓ2 ν—1、光照时间12h/d的条件下，培养40天后获得长好根的试管苗，其中，所用 的生根培养基为:l/2MS+2-ip 0. 01 0. 05mg · L_1+IAB 0· 1 0. 4mg · L_1+Mg2+50mg · Γ1+ 活性碳 0. 5 1. Og · Γ1+ 蔗糖 20g · Γ1+ 琼脂 6g · ΙΛ pH 5. 0 ；(4)试管苗移栽将长好根的试管苗移栽到移栽基质中，放置于遮荫、湿润的 原生环境下培养，其中，所用的移栽基质为腐质土和椰糠按重量份1 1混均，并添加 Mg2+100mg/kg,^ PH 调至 pH 4. 5 5. 5。
上述步骤(1)中所述初代诱导培养基优选为MS+6-BA 0. 2mg -L"1+KT 0. 2mg -L^+I ABO. 04mg · L_1+Mg2+50mg · L-1+ 蔴糖 30g · L-1+ 琼月旨 6g · L-1，pH 5. 0。上述步骤⑵中所述继代增殖培养基优选为MS+2-ip 0. Img -L^+KT 0. 05mg -Γ1+ ΙΑΒ0. 02mg · L_1+Mg2+50mg · L-1+ 蔴糖 30g · L-1+ 琼月旨 6g · L-1，pH 5. 0。上述步骤(3)中所述生根培养基优选为l/2MS+2-ip 0. 02mg · L^+IAB 0. 2mg · L—1+MglOmg · L-1+ 活性碳 0. 5g · L-1+ 蔗糖 30g · L-1+ 琼脂 6g · L-1，pH 5. 0。所述培养基中的Mg2+由硫酸镁提供。本发明所使用的植物材料为分布于广西金秀县老山林场的野生瑶山苣苔叶片。瑶山苣苔是一种对环境要求十分严格的植物，一旦离开原生地植株不能成活，目 前为止，原生地之外地区的引种栽培尚未获得成功。本方法在对瑶山苣苔生境土壤进行详 细研究的基础上，发现Mg2+对瑶山苣苔的生长起关键作用。因此，本发明利用瑶山苣苔叶 片，通过向培养基添加Mg2+，利用组织培养和植株再生技术，成功地在原生地之外对其种苗 进行试管快速繁殖，为瑶山苣苔异地弓I种奠定了基础。本发明方法的优点在于利用本方法繁育出的瑶山苣苔种苗，有繁殖速度快、生根 率高、遗传稳定性好等特点，能在短期内迅速提高该物种个体数量，达到保护和可持续利用 的目的。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但不是对本发明的限定。实施例1瑶山苣苔的组织培养及快速繁殖方法，具体步骤如下(1)叶片外植体的表面消毒将从广西金秀县老山林场采集的野生瑶山苣苔叶片 作为外植体，用1.0%的洗洁精浸泡10分钟，在流动的自来水下冲洗干净后，置于超净工作 台上用70%的酒精浸泡60秒，再用浓度0. 1 %的HgCl2消毒3分钟，取出叶片，用无菌水浸 洗5次；(2)不定芽的初代诱导将经过表面消毒的瑶山苣苔叶片剪成1.2X1. 5cm小块， 接种于初代诱导培养基 MS+6-BA 0. 4mg Γ1+KT 0. Img .!^+IAB 0. 05mg ·!^+Mg2+SOmg .171+ 蔗糖30g · L-1+琼脂6g · ΛρΗ 5. 0上，在温度25士3°C、光照强度20 μ mol · m_2 · s—1、光照 时间Uh/d的条件下，培养30 35天，叶片切口处增厚膨大，形成暗绿色的愈伤组织，培养 100天后，愈伤组织逐渐分化形成不定芽，不定芽的分化率为31.7%;(3)芽的继代增殖将愈伤组织和不定芽转入继代增殖培养基MS+2-ip 0. 2mg · L_1+KT0. Olmg · L_1+IAB 0. 02mg · L_1+Mg2+50mg · L-1+ 蔗糖 30g · L-1+ 琼月旨 6g · L-1、pH 5. 0上，在温度25士3°C、光照强度40 μ mol · πΓ2 · s—1、光照时间12h/d的条件下，培养30 35天，形成较多丛生小芽，再培养30 35天，丛生芽逐渐长成具有2 3片真叶的比较粗 壮的无根苗，繁殖系数4. 6/60d ；(4)生根培养将长有2 3片真叶的比较粗壮的无根苗分切，接入生根培养基 l/2MS+2-ip 0. 05+IAB 0. 4mg · L_1+Mg2+50mg · Γ1+ 活性碳 1. Og · Γ1+ 蔗糖 20g · Γ1+ 琼脂 6g · L-1、pH 5. 0中，在温度25士3°C、光照强度40 μ mol · m_2 · s—1、光照时间12h/d的条件 下，培养40天后，无根苗逐渐长出不定根，生根率90. 7%，不定根较粗大，须根也较多；
(5)试管苗移栽用有机质含量比较丰富的腐质土和椰糠按重量份1 1比例混 合，每公斤添加IOOmg Mg2+，pH调至5.0，配制移栽基质，将长好根的试管苗移出培养室外炼 苗2 3天，洗净根际培养基，移栽到装有移栽基质的营养杯中，在原生环境林下搭建小拱 棚，每天定期补充水分，保持湿度，培养60 65天，小苗长出新根。实施例2瑶山苣苔的组织培养及快速繁殖方法，具体步骤如下(1)不定芽的初代诱导将经过表面消毒的瑶山苣苔叶片剪成1.2X1. 5cm小块， 接种于初代诱导培养基 MS+6-BA 0. 2mg Γ1+KT 0. 2mg ‘L_1+IAB 0. 04mg ·!^+Mg2+SOmg .171+ 蔗糖30g · L-1+琼脂6g · ΛρΗ 5. 0上，在温度25士3°C、光照强度20 μ mol · m_2 · s—1、光照 时间Uh/d的条件下，培养35 40天，叶片外植体的切口处增厚膨大，形成暗绿色的愈伤 组织，培养120天后，愈伤组织有逐渐分化形成不定芽，不定芽分化率为32. 0% ；(2)芽的继代增殖培养将愈伤组织和不定芽转入继代增殖培养基MS+2-ip 0. Img · L-1+KT 0. 05mg · L_1+IAB 0. 02mg · L_1+Mg2+50mg · L-1+ 蔴糖 30g · L-1+ 琼月旨 6g · L-1， pH 5.0上，在温度25士3°C、光照强度40 μ mol · πΓ2 · s—1、光照时间12h/d的条件下，培养 30 35天，形成丛生芽，继续培养30 35天，丛生芽逐渐长出2 3片真叶，所形成的无 根苗较壮，繁殖系数为4. 7/60d ；(3)生根培养将长有2 3片真叶、比较粗壮的无根苗分切，接入生根培养基 l/2MS+2-ip 0. 02+IAB 0. 2mg · L_1+Mg2+50mg · Γ1+ 活性碳 0. 5g · Γ1+ 蔗糖 20g · Γ1+ 琼脂 6g · L-1、pH 5. 0中，在温度25士3°C、光照强度40 μ mol · m_2 · s—1、光照时间12h/d的条件 下，培养40天后长出不定根，生根率93. 6%，主根粗壮，须根发达。其余均与实施例1相同。实施例3瑶山苣苔的组织培养及快速繁殖方法，具体步骤如下(1)不定芽的初代诱导将经过表面消毒的瑶山苣苔叶片剪成1.2X1. 5cm小块， 接种于初代诱导培养基 MS+6-BA 0. Img · L_1+KT 0. 4mg · I^+IAB 0. 05mg · L_1+Mg2+mg · Γ1+ 蔗糖30g · L-1+琼脂6g · ΛρΗ 5. 0上，在温度25士3°C、光照强度20 μ mol · m_2 · s—1、光照 时间Uh/d的条件下，培养35 40天，叶片外植体的切口处增厚膨大，形成暗绿色的愈伤 组织，培养140天后，愈伤组织分化形成不定芽，不定芽的分化率为31.0%，所形成的不定 芽较壮；(2)芽的继代增殖培养将愈伤组织和不定芽转入继代增殖培养基MS+2-ip 0. 05mg · L-1+KT 0. Img · L_1+IAB 0. 02mg · L_1+Mg2+50mg · L-1+ 蔴糖 30g · L-1+ 琼月旨 6g · Γ1、 pH 5.0上，在温度25士3°C、光照强度40 μ mol · πΓ2 · s—1、光照时间12h/d的条件下，培养 30 35天，形成丛生芽，继续培养30 35天，丛生芽逐渐长出2 3片真叶，繁殖系数为 5. 0/60d ；(3)生根培养将长有2 3片真叶、比较粗壮的无根苗分切，接入生根培养基 l/2MS+2-ipO. Olmg · L_1+IAB 0. Img · L_1+Mg2+50mg · L-1+ 活性碳 0. 5g · L-1+ 蔗糖 20g · Γ1+ 琼脂6g · L-1，pH 5. 0中，在温度25 士 3°C、光照强度40 μ mol · m_2 · s—1、光照时间12h/d的 条件下，培养40天后长出不定根，生根率91.3%，根系发达，植株也较大。其余均与实施例1相同。
上述实施例中所述培养基中Mg2+由硫酸镁提供。下面表1至表3显示实例1至3中不同的激素种类、浓度和组合对诱导、继代和生 根培养材料的影响。表1不同激素浓度对瑶山苣苔初代诱导的影响
权利要求
1.瑶山苣苔组织培养及快速繁殖的方法，其特征在于，以野外采集的瑶山苣苔植株叶 片作为外植体，按以下步骤进行组织培养和快速繁殖(1)不定芽的初代诱导将瑶山苣苔植株叶片外植体经表面消毒后接种到诱导培养基 上，在温度25士3°C、光照强度20μπιΟ1 · πΓ2 · s—1、光照时间12h/d的条件下，培养100 140天，叶片外植体诱导形成愈伤组织和不定芽，其中，所用的初代诱导培养基为MS+6-BA 0. 1 0. 4mg · L_1+KT 0· 1 0. 4mg · L_1+IAB 0. 04 0. 05mg · L_1+Mg2+50mg · L-1+ 蔗糖 30g · Γ1+琼脂 6g · ΛρΗ 5.0 ；(2)芽的继代增殖将愈伤组织和不定芽转入继代增殖培养基上，在温度25士3°C、光 照强度40 μ mol · πΓ2 · s—1、光照时间iai/d的条件下，培养50 60天，获得从生芽，繁殖 系数4. 6 5. 0/60d，每60天继代一次，其中，所用的继代增殖培养基为MS+2-ip 0. 05 0. 2mg · L-1+ΚΤ0. 05 0. Img · L_1+IAB 0. 02mg · L_1+Mg2+50mg · L-1+ 蔗糖 30g · L-1+ 琼月旨 6g · ΙΛ ρΗ 5. 0 ；(3)生根培养将丛生芽苗分切转入生根培养基上，在温度25士3°C、光照强度 40 μ mol ·πΓ2 ν—1、光照时间12h/d的条件下，培养40天后获得长好根的试管苗，其中，所用 的生根培养基为:l/2MS+2-ip 0. 01 0. 05mg · L_1+IAB 0· 1 0. 4mg · L_1+Mg2+50mg · Γ1+ 活性碳 0. 5 1. Og · Γ1+ 蔗糖 20g · Γ1+ 琼脂 6g · ΙΛ ρΗ 5. 0 ；(4)试管苗移栽将长好根的试管苗移栽到移栽基质中，放置于遮荫、湿润的原生环境 下培养，其中，所用的移栽基质为腐质土和椰糠按1 1混均，并添加Mg2+100mg/kg JfpH 调至4. 5 5. 5。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中所述初代诱导培养基为 MS+6-BA 0. 2mg · L_1+KT 0. 2mg · L_1+IAB 0. 04mg · L_1+Mg2+50mg · L-1+ 蔗糖 30g · L-1+ 琼月旨 6g · ΙΛ ρΗ 5. 0。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤O)中所述继代增殖培养基为 MS+2-ip 0. Img · L_1+KT 0. 05mg · I^+IAB 0. 02mg · L_1+Mg2+50mg · Γ1+ 鹿糖 30g · Γ1+ 琼月旨 6g · ΙΛ ρΗ 5. 0。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中所述生根培养基为 l/2MS+2-ip 0. 02mg · L_1+IAB 0. 2mg · L_1+Mg2+50mg · L-1+ 活性碳 0. 5g · L-1+ 蔗糖 30g · L-1+ 琼脂 6g .LipH 5.0。
全文摘要
瑶山苣苔(Dayaoshania cotinifolia W.T.Wang)组织培养及快速繁殖的方法，本发明以分布于广西金秀县老山林场的野生瑶山苣苔叶片为外植体，通过筛选和优化初代诱导、继代增殖、生根和移栽培养基配方和培养条件，经过不定芽的初代诱导、继代增殖和生根培养以及试管苗的移栽阶段，实现珍稀濒危植物瑶山苣苔种苗的快速繁殖，为该物种的生物学研究、遗传改良、种质资源保护和可持续利用奠定基础。
文档编号A01H4/00GK102144556SQ20111003313
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月29日 优先权日2011年1月29日
发明者付传明, 唐凤鸾, 石云平, 赵志国, 黄宁珍 申请人:广西壮族自治区中国科学院广西植物研究所