专利名称：北冬虫夏草可结实性母种资源选育方法
技术领域：
本发明涉及一种冬虫夏草的母种选育方法，尤其涉及一种北冬虫夏草可结实性母种资源选育方法。属于食用菌、药用菌遗传育种领域。
背景技术：
冬虫夏草Cord yceps sinensis是我国传统的名贵药材,其所具有的特殊药理作用和治疗功效已得到人们认可。近年来由于人类活动范围的扩大，生态环境的恶化，导致野生冬虫夏草持续减少，价格也持续飙升。到2010年优质虫草已经销售到16万元/公斤(干)。为解决冬虫夏草资源紧缺问题，人们很早就开始关注蛹虫草，从1986年起，人们把野生蛹虫草采集回来，通过组织分离获得菌种，20多年里，蛹虫草栽培获得重大技术突破。目前它已经成为冬虫夏草的最佳替代品。全世界已知虫草类有350余种，我国目前有62种，但最为昂贵的只有冬虫夏草和蛹虫草。但目前北冬虫夏草人工栽培中因菌种退化问题而导致的生产用母种种源栽培后不能稳定出草，从而制约了北冬虫夏草大规模生产。
发明内容
本发明为了解决目前北冬虫夏草人工栽培中因菌种退化问题而导致的生产用母种种源栽培后不能稳定出草，从而制约了北冬虫夏草大规模生产所带来的种源技术问题，本发明提供了一种北冬虫夏草可结实性母种资源选育方法，是以野生鲜北虫草或人工培育的蚕蛹鲜北虫草子实体作为母种选育初始种源，在对北虫草子实体进行组织分离中采用双氧水作为活体材料消毒剂，而不使用乙醇和生汞作为消毒剂，采用分生孢子涂布法进行母种继代培养，在菌落和可结实性菌丝评价筛选中先后使用了独特的母种培养基及一整套仿野生生态环境培育方法，并通过菌丝显微形态学观察和选择菌落子实体原基形成时间作为选育参数；该方法的具体实现步骤是I)以野生鲜北虫草或人工培育的蚕蛹鲜北虫草子实体为材料通过组织分离手段获得母种选育初始种源；2)组织分离中不使用乙醇和生汞作为消毒剂处理活体材料，采用5%的双氧水作为活体材料消毒剂，喷雾消毒后20分钟可进行菌种分离工作；3)母种继代培养接种方法采用分生孢子转接法；4)接种后菌管在下列条件下培养培养温度20°C ±2°C湿度60% ±5%接种后前2天避光培养，从第3天到第10天全程见光培养，光源采用日光灯照度前低后高，从1500勒克斯到6000勒克斯；5)选择性状优良菌丝的菌管作为后续选育出发菌株；6)模拟北冬虫夏草自然生长环境进行子实体原基诱导，模拟条件为根据白天和夜晚轮回以12小时为时长，白天给予20°C ±2°C 6000勒克斯光照，晚上18°C ±2°C避光培养，该处理前要在无菌条件下给菌管内菌丝换气，连续处理3天；
7)从第4天起以20°C ±2°C 6000勒克斯光照条件培养，以7_10天内通过解剖镜或放大镜观察以子实体原基形成多，均匀，色泽深褐菌管为可结实性母种资源；8)对选育的可结实性母种资源进行凹玻片微室无菌培养，在光学显微镜下进行形态观察，根据分生孢子在菌丝体上的着生状态进行判断，最终获得北冬虫夏草可结实性母种资源。本发明的特点及有益效果通过以野生鲜北虫草或人工培育的蚕蛹鲜北虫草子实体为材料，通过组织分离手段获得母种选育初始种源，采用该材料作为组织分离材料，可以最大限度保证菌种的野生性状，降低退化频率；采用双氧水作为活体材料消毒剂，而不使用乙醇和生汞作为消毒剂，可以避免乙醇作为消毒剂对组织材料极强的浸杀性，从而降低活 体材料成活性得不足，也可以避免升汞的高毒性、药品难以购买以及使用剂量和处理时间不宜掌握的不足，通过上述方法所获得母种初始种源具有稳定的遗传性，其产量性状和产生虫草素能力都很强。这一成果对于人工生产功能性北虫草具有重要价值，应用前景广阔。
具体实施例方式北冬虫夏草可结实性母种资源选育方法，是以野生鲜北虫草或人工培育的蚕蛹鲜北虫草子实体作为母种选育初始种源，在对北虫草子实体进行组织分离中采用双氧水作为活体材料消毒剂，而不使用乙醇和生汞作为消毒剂，采用分生孢子涂布法进行母种继代培养，在菌落和可结实性菌丝评价筛选中先后使用了独特的母种培养基及一整套仿野生生态环境培育方法，并通过菌丝显微形态学观察和选择菌落子实体原基形成时间作为选育参数；该方法的具体实现步骤是以野生鲜北虫草或人工培育的蚕蛹鲜北虫草子实体为材料通过组织分离手段获得母种选育初始种源。组织分离中不使用乙醇和生汞作为消毒剂处理活体材料，采用5%的双氧水作为活体材料消毒剂，喷雾消毒后20分钟可进行菌种分离工作。用于组织分离和继代培养所使用的培养基配方为葡萄糖30g/L，蛋白胨16g/L，磷酸二氢钾6g/L，硫酸镁2g/L，硫酸锰0. 5克氯化钙0. 3克水1000ml，复合维生素(21金维他)100毫克琼脂粉18克蒸馏水1000毫升。母种继代培养接种方法采用分生孢子转接法。接种后菌管在下列条件下培养培养温度20°C ±2°C湿度60% ±5%接种后前2天避光培养，从第3天到第10天全程见光培养，光源采用日光灯照度前低后高，从1500勒克斯到6000勒克斯。选择菌丝生长整齐，菌落毛毯状平整，气生菌丝不徒长，菌丝转色快(由白色转成黄色然后到红褐色)，色素分泌多的菌管作为后续选育出发菌株。以选育的出发菌株为材料，模拟北冬虫夏草自然生长环境进行子实体原基诱导程序，所模拟条件为根据白天和夜晚轮回以12小时为时长，白天给予20°C ±2°C 6000勒克斯光照，晚上18°C ± 2°C避光培养，该处理前要在无菌条件下给菌管内菌丝换气，连续处理3天。从第4天起以20°C ±2°C 6000勒克斯光照条件培养，以7_10天内通过解剖镜或放大镜观察以子实体原基(草芽)形成多，均匀，色泽深褐菌管为可结实性母种资源。对选育的可结实性母种资源进行凹玻片微室无菌培养，在光学显微镜下进行形态观察，根据分生孢子在菌丝体上的着生状态进行判断，最终获得北冬虫夏草可结实性母种资源。本发明中对北虫草种源所限定的“可结实性”意指所用种源栽培后能够正常出草，即形成产量性状稳定、形态学指标明显的北冬虫夏草子实体。实施例该方法是通过下述步骤实现的
以野生鲜北虫草或人工培育的蚕蛹鲜北虫草子实体，通过组织分离手段获得母种选育初始种源；组织分离所使用的培养基配方为葡萄糖30g/L，蛋白胨16g/L，磷酸二氢钾6g/L，硫酸镁2g/L，硫酸锰0. 5克氯化钙0. 3克，水1000ml，21金维他100毫克，琼脂粉18克及蒸馏水1000毫升；组织分离中不使用乙醇和生汞作为消毒剂处理活体材料，而是采用5%的双氧水作为活体材料消毒剂，喷雾消毒后20分钟可进行菌种分离工作；采用分生孢子转接法进行母种继代培养接种。用于继代培养所使用的培养基配方同上述组织分离所使用的培养基配方；接种后菌管在下列条件下培养培养温度20°C ±2°〇，湿度60%±5(%;接种后的前2天避光培养，从第3天到第10天全程见光培养，光源采用日光灯照度前低后高，即从1500勒克斯到6000勒克斯。选择出发菌株，选菌丝生长整齐，菌落毛毯状平整，气生菌丝不徒长，菌丝转色快(由白色转成黄色然后到红褐色)，色素分泌多的菌管作为后续选育出发菌株；对选育出的出发菌株，模拟北冬虫夏草自然生长环境进行子实体原基诱导，模拟条件为根据白天和夜晚轮回以12小时为时长，白天给予20°C ±2°C 6000勒克斯光照，晚上18°C ±2°C避光培养，在进行该处理前，要在无菌条件下给菌管内菌丝换气，连续处理3天;从第4天起以20°C ±2°C，6000勒克斯光照条件培养，以7_10天内通过解剖镜或放大镜观察以子实体原基(草芽)形成多，均匀，色泽深褐菌管为可结实性母种资源；对选育的可结实性母种资源进行凹玻片微室无菌培养，在光学显微镜下进行形态观察，根据分生孢子在菌丝体上的着生状态进行判断，最终获得北冬虫夏草可结实性母种资源。
权利要求
1.北冬虫夏草可结实性母种资源选育方法，是以野生鲜北虫草或人工培育的蚕蛹鲜北虫草子实体作为母种选育初始种源，其特征在于在对北虫草子实体进行组织分离中采用双氧水作为活体材料消毒剂，而不使用乙醇和生汞作为消毒剂，采用分生孢子涂布法进行母种继代培养，在菌落和可结实性菌丝评价筛选中先后使用了独特的母种培养基及一整套仿野生生态环境培育方法，并通过菌丝显微形态学观察和选择菌落子实体原基形成时间作为选育参数； 该方法的具体实现步骤是 1)以野生鲜北虫草或人工培育的蚕蛹鲜北虫草子实体为材料通过组织分离手段获得母种选育初始种源； 2)组织分离中不使用乙醇和生汞作为消毒剂处理活体材料，采用5%的双氧水作为活体材料消毒剂，喷雾消毒后20分钟可进行菌种分离工作； 3)母种继代培养接种方法采用分生孢子转接法； 4)接种后菌管在下列条件下培养培养温度20°C±2°C湿度60% ±5%接种后前2天避光培养，从第3天到第10天全程见光培养，光源采用日光灯照度前低后高，从1500勒克斯到6000勒克斯； 5)选择性状优良菌丝的菌管作为后续选育出发菌株； 6)模拟北冬虫夏草自然生长环境进行子实体原基诱导，模拟条件为根据白天和夜晚轮回以12小时为时长，白天给予20°C ±2°C 6000勒克斯光照，晚上18°C ±2°C避光培养，该处理前要在无菌条件下给菌管内菌丝换气，连续处理3天； 7)从第4天起以20°C±2°C 6000勒克斯光照条件培养，以7_10天内通过解剖镜或放大镜观察以子实体原基形成多，均匀，色泽深褐菌管为可结实性母种资源； 8)对选育的可结实性母种资源进行凹玻片微室无菌培养，在光学显微镜下进行形态观察，根据分生孢子在菌丝体上的着生状态进行判断，最终获得北冬虫夏草可结实性母种资源。
2.根据权利要求I所述的北冬虫夏草可结实性母种资源选育方法，其特征在于用于组织分离和继代培养所使用的培养基配方为葡萄糖30g/L，蛋白胨16g/L，磷酸二氢钾6g/L，硫酸镁2g/L，硫酸锰0. 5克氯化钙0. 3克水1000ml，复合维生素100毫克琼脂粉18克蒸馏水1000毫升。
3.根据权利要求I所述的北冬虫夏草可结实性母种资源选育方法，其特征在于所述性状优良菌丝的菌管，为菌丝生长整齐，菌落毛毯状平整，气生菌丝不徒长，菌丝转色快，色素分泌多的菌管。
4.根据权利要求2所述的北冬虫夏草可结实性母种资源选育方法，其特征在于所述复合维生素采用21金维他。
5.根据权利要求I所述的北冬虫夏草可结实性母种资源选育方法，其特征在于菌落培养温度为18-20°C ±2°C，光照强度在1500勒克斯到6000勒克斯。
全文摘要
北冬虫夏草可结实性母种资源选育方法，是为了解决目前北冬虫夏草人工栽培中因菌种退化问题而导致的生产用母种种源栽培后不能稳定出草，从而制约北虫草大规模生产所出现的技术问题而设计的。该方法以特殊的鲜北虫草子实体为组分材料，采用无害性表面消毒剂处理材料，在孢子分离后获得菌落，通过可结实性菌丝评价筛选等技术评价程序，获得具有遗传稳定性的北虫草可结实性种源。该种源具有极高的结实性，从而可应用于北冬虫夏草大规模工厂化栽培中。对人工生产功能性北虫草具有重要价值，应用前景广阔。
文档编号A01G31/00GK102640659SQ20111004373
公开日2012年8月22日 申请日期2011年2月22日 优先权日2011年2月22日
发明者张治平, 张红, 徐方旭, 朱明光, 王升厚 申请人:沈阳师范大学