专利名称：一种高效诱导枣树2n花粉的方法
技术领域：
本发明涉及一种基于微创技术高效诱导枣树高活力2η花粉的方法。
背景技术：
枣树(Ziziphus jujuba Mill.)是原产我国的特色优势果树，为我国第一大干果 树种。‘赞皇大枣’是迄今已知的唯一的自然三倍体枣品种，表现出果大、丰产、适应性强等 优点。最近，本专利发明人利用秋水仙素诱变二倍体的‘临猗梨枣’，选育出了第一个四倍体 枣树新品种‘辰光’，‘辰光’较‘临猗梨枣’表现为果大、质优。枣的近缘种毛叶枣(Ziziphus mauritianaLam.)的栽培品种多为四倍体，也都表现为果大、适应性强。因此，枣的倍性育种 前景广阔，也越来越受到重视。通过无性多倍化获得的多倍体，常存在嵌合现象，需要复杂耗时的纯化过程才能 得到同质多倍体。而且，无性多倍化获得的多倍体没有外来优异基因的渗入，不能实现优异 基因的重组。迫切需要通过有性多倍化途径开展枣树的倍性育种。2n花粉(巨型花粉)在有性倍性育种中具有重要价值①有利基因的高效转移。 利用2η配子便于将野生种或栽培种中的抗性基因或矮化基因等有利基因直接引入拟改良 的栽培品种，并可以直接用于育种或生产；②稳定传递杂合性。果树作物在遗传上是高度杂 合的，传统的育种方法很容易失去亲本的优良性状，通过2η配子育种可以稳定地传递亲本 的杂合性，当后代最大限度地保持了亲本杂合性时，可以获得较大程度的杂种优势；③克服 自交不亲和。果树大多是多年生作物，有些果树树种存在自交不亲和现象，利用2η配子可 以大大提高自交结实能力，在苹果、文旦柚等果树上均已有成功报道；④克服胚乳平衡数障 碍，缩短育种过程；⑤培育无核品种，通过2η配子，不需要四倍体亲本，在二倍体水平上杂 交，即可直接获得三倍体，柑橘、柿等树种上均有成功报道。据本专利发明人检测，在自然条件下，仅有1.79%的枣树品种可以产生以上 的2η花粉，绝大多数优良品种的2η花粉自然发生比例极低，不能满足倍性育种需要。因此， 对枣树优良品种进行2η花粉诱导，通过有性杂交，整合优良性状，进行有性多倍体育种，具 有重要的价值。据本专利发明人曾尝试利用涂抹法进行巨型花粉的诱导，但诱导效果不理 想；之后采用微创技术，使诱变剂通过微创口直接进入枣吊中，高活力2η花粉的诱导效率 显者提尚。
发明内容
本发明建立了一种基于微创技术高效诱导枣树高活力2η花粉的方法。本发明解决其技术问题所采用的技术方案是以秋水仙素为诱变剂，首先对拟诱 变的枣吊(枣树上开花结果的枝条)基部进行割伤，用脱脂棉覆盖伤口，然后将诱变剂(秋 水仙素)药液滴入脱脂棉中，使枣吊通过微创伤口将药液吸入木质部并向上运输，阻止幼 龄花蕾中的花粉母细胞减数分裂过程中纺锤丝的形成，诱导花粉染色体加倍，从而获得高 活力2η花粉。
本发明的具体内容，即利用微创技术高效诱导枣树高活力2η花粉的具体方法如 下(1)枣吊预处理开花前19-22d，选择树冠外围发育正常的健壮枣吊，用刀片割 伤其基部，伤口长度0. 8-1. 2mm左右，深达木质部，尽量保持伤口光滑、无毛边。(2) 2n花粉的诱导枣吊经过预处理后，用脱脂棉迅速覆盖伤口，用保鲜膜将脱脂 棉固定在伤口处，使伤口和脱脂棉充分接触；保鲜膜外用牛皮纸包裹进行遮光，用注射器将 含有二甲基亚砜(DMSO)的0.3%秋水仙素滴加在脱脂棉上，以浸透脱脂棉为准，每隔 4-6h补滴药液1次，以保持脱脂棉湿润，24h后撤去所有包裹物，用清水冲洗伤口。(3)花粉的采集和观测在蕾裂期，采集处理过的花蕾，用解剖针快速剥取成熟花 粉，置于载玻片上，滴加0.5%氯化三苯基四氮唑(TTC)染色液，室温下遮光放置Ih后，镜检 其中2η花粉的比例和活力。本发明专利的有益效果是，通过秋水仙素诱导，获得高比例、高活力的2η花粉，可 以直接用于授粉，提高三倍体杂交后代的出现几率。该技术应用于枣树2η花粉诱导，方法 简单便捷，诱导效率高。
图1诱导获得的高活力2η花粉(染成红色的巨型花粉)
具体实施例方式以二倍体优良品种‘蜂蜜罐’为试材，于2010年5月12日-13日选择树冠外围发 育正常的健壮枣吊，用刀片割伤其基部，长度0. 8-1. 2mm左右，深达木质部，伤口光滑、无毛 边；迅速用脱脂棉覆盖伤口，用保鲜膜将脱脂棉固定在伤口处使伤口和脱脂棉充分接触，保 鲜膜外用牛皮纸进行包裹遮光；用注射器将0. 3%秋水仙素(含有DMS0)滴加在脱脂棉 上，浸透脱脂棉；每隔4-6h补滴药液1次，保持脱脂棉湿润，24h后撤去所有包裹物，用清水 冲洗伤口 ；于6月1日-7日，采集处理过已达蕾裂期的花蕾，于室内用解剖针快速剥取成熟 花粉，置于载玻片上，滴加0.5% TTC染色液，室温下遮光放置Ih后镜检，2η花粉比例平均 达18. 3%、最高的达30. 0%，2η花粉活力平均为80%，而未经处理的对照2η花粉比例平均 仅为0%。2η花粉活力平均为80%。
权利要求
1. 一种高效诱导枣树2η花粉的方法，其特征在于包括以下几个步骤(1)枣吊预处理开花前19-22d，选择健壮的枣吊，用刀片割伤其基部，伤口长度 0. 8-1. 2mm，深达木质部。(2)2n花粉的诱导经步骤(1)预处理后的枣吊，先用脱脂棉覆盖其基部伤口，再用保鲜 膜将脱脂棉固定在伤口处，使伤口和脱脂棉充分接触；保鲜膜外用牛皮纸包裹进行遮光，然 后用注射器将含有二甲基亚砜(DMSO)的0. 3%秋水仙素滴加在脱脂棉上，浸透脱脂棉， 每隔4-6h补滴药液1次，保持脱脂棉湿润；24h后撤去所有包裹物，用清水冲洗伤口。(3)花粉的采集和观测在蕾裂期，采集经步骤⑴和步骤(2)处理过的枣吊上的花蕾， 用解剖针快速剥取其中的成熟花粉，置于载玻片上，滴加0.5%氯化三苯基四氮唑(TTC)染 色液，室温条件下遮光放置Ih后，镜检其中2η花粉的比例和活力。
全文摘要
一种高效诱导枣树2n花粉的方法，即以秋水仙素为诱变剂，首先对拟诱变的枣吊基部进行割伤，用脱脂棉覆盖伤口，然后将秋水仙素药液滴入脱脂棉中，使枣吊通过微创伤口将药液吸入木质部并向上运输，阻止幼龄花蕾中的花粉母细胞减数分裂过程中纺锤丝的形成，诱导花粉染色体加倍，从而获得高活力2n花粉。该技术应用于枣树高活力2n花粉诱导，方法简单便捷，诱导效率高。
文档编号A01H1/08GK102100176SQ201110051588
公开日2011年6月22日 申请日期2011年3月4日 优先权日2011年3月4日
发明者刘孟军, 刘平, 薛治慧 申请人:河北农业大学