专利名称：一种福建山樱花体细胞胚胎发生方法
技术领域：
本发明属于植物培育技术，涉及一种福建山樱花体细胞胚胎发生方法。
背景技术：
福建山樱花、Cerasus campanulata Maxim.)隶属于蔷薇科(Rosaceae)李亚科 (Prunusoidea)樱属(Cerasus)，又名绯寒樱、福建樱、山樱桃、钟花樱、结樱桃等，落叶乔木，高达15m;树皮灰褐色或黑褐色，粗糙不开裂，质地坚韧、横向剥落。叶纸质，卵形，椭圆状卵形或卵状矩圆形，长圹9cm，宽2. 5^3. 5cm，先端渐尖，基部近圆形或微带心形，边缘有锐而细的单或微重锯齿。有一对红色腺体，单叶螺旋状互生，重锯齿缘(双重锯齿缘)，揉碎具有杏仁味；托叶线形，细裂状。每年冬末春初开花，先花后叶，花呈下垂性开展，腋出，单生或3飞朵形成伞房花序，花梗细长，有腺毛，花萼钟形，花瓣桃红色、绯红色或暗红色，先端呈凹形，半开状，雄蕊多数。通常11月能见花蕾，冬末初春开花，盛花期1月下旬至2月下旬。花后结卵形至椭圆形核果，至4飞月间果实成熟，果长约1.5cm，成熟时深红色，果小但可食，内藏一粒种子；福建山樱花在土质疏松的红壤、黄壤中生长良好，在干旱瘠薄的荒山生长不良，可在低海拔地区种植，并有很强的适应性和较强的抗污染性。性喜光照充足和温暖的环境，较耐高温和阴凉，可在低海拔地区种植，最适生育温度15 28°C，并有很强的适应性和较强的抗污染性能力。福建山樱花早春开花，适宜种植与中国式庭院的水池边、假山旁或院落中，亦可布置与公园中。福建山樱花生长缓慢，其木材可用于室内装修和器械用具等用材，该树种，花色粉红，尚美观，可做庭园树种栽培。其果实成熟时，果皮鲜红色，既美观， 亦可食用。福建山樱花的花果还具有一定的食用价值，花朵晒干后可代替茶叶使用，也可做成糕点或经盐渍后当成油炸物或汤类的配料。花瓣加入面包中还可增加美观及风味；浸泡于绍兴酒中，饮来分外香醇。果实可洗净后生食，也可用糖腌渍后食用，或制成果酱或蜜饯。开展福建山樱花新品种选育研究，对丰富我国的观赏花木资源，改善生态环境具有重要的意义。但福建山樱花现存林分极为稀少、种实成熟时极易爆裂，种子的采收贮存与发芽极为困难，传统育种方法中，不论是利用无性系改良方法进行品种改良，还是进行有性杂交育种，或是把有性育种和无性利用二者有机地结合起来，都不易取得大的突破，且通常需要耗费十多年乃至数十年的时间，育种效率有待提高。随着植物组织和细胞培养技术的不断完善，在理论研究和生产实践的应用上都已取得一些重大成果。据不完全统计，全世界约有1000多种高等植物作过离体培养的研究， 其中绝大多数可通过体细胞胚发生途径形成再生植株。而且愈来愈多的研究表明，植物体细胞在离体培养中，通过体细胞胚胎发生途径形成再生植株已是极其普遍的现象，并认为该发生途径是植物体细胞在离体培养条件下的一个基本发育途径。这也就是说，植物的体细胞可能具有潜在的，像有性过程产生合子胚一样的全能性。为提高育种效率近年来利用组织培养的技术对福建山樱花的研究较多，2002年王光萍最先利用福建山樱花的嫩枝进行丛生芽诱导和丛生芽生根，为福建山樱花的组织培养摸索了条件。2006年吕月良对福建山樱花不定芽诱导和植株再生规模化繁殖试验，试管苗
3移栽成活率较高，各项指标已达到快繁育苗的要求，为工厂化作业提供了条件。2006年黄宇翔等也对福建山樱花组培快繁进行研究，并探索了如何缩短组培快繁的时间。2008年邹娜，徐楠等对福建山樱花试管苗生根条件的优化，以提高试管苗移栽成活率。对于福建山樱花的器官发生的研究已经比较系统，而这些研究目前还不能够实现快速培育福建山樱花来满足使用要求。在2010年的《福建山樱花不定芽繁殖及体细胞胚胎发生研究》研究生硕士学位论文中，贾利娜对福建山樱花体细胞胚胎发生进行了探索性试验，采用福建山樱花的叶片、 叶柄、枝条、花瓣、花托和花柄为外植体进行诱导，只有叶片、叶柄、花瓣、花柄有类似胚的发育，类似胚的结构只长出根便发育停止，最终未发育成体胚及体胚苗，枝条和花托的愈伤组织也没有分化。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种周期短、繁殖率高、成本低廉的福建山樱花体细胞胚胎发生方法。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为一种福建山樱花体细胞胚胎发生方法，包括以下步骤
(1)春季采集福建山樱花的未成熟果实，先用流水冲洗2h，然后在无菌条件下切开种皮，取出两片子叶和未成熟胚接到诱导培养基，控温23°C，培养半个月，得胚性愈伤组织； 其中，诱导培养基采用MS培养基，在其中附加l.(T4.0mg/L 2，4_D、0. 2 1. Omg/L 6-苄胺基嘌呤(BA)、500mg/L水解酪蛋白、lOmg/L维生素C、30g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH5. 8 ；
(2)将步骤(1)的胚性愈伤组织转入增殖培养基，控温23°C，暗培养至产生球形胚状体；其中，增殖培养基采用MS或1/2MS培养基，在其中附加0. 5^1. Omg/L 2，4_D、 0. 2 0. 5mg/L BA、500mg/L 水解酪蛋白、lOmg/L 维生素 C、30g/L 蔗糖和 6g/L 琼脂，ρΗ5· 8 ；
(3)将步骤(2)的球形胚状体转入培育培养基，控温22 27光照12h d — S光照度为1200 Ix,光培养至长出幼苗；其中，培育培养基采用MS基本培养基，在其中附加1 Omg/L维生素C、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，ρΗ5· 8 ；
(4)将步骤(3)的幼苗转入生长培养基，培养至长成完整小苗；其中，生长培养基采用 MS培养基，在其中附加10mg/L维生素C、蔗糖20g/L和琼脂6g/L，pH5. 8。步骤(1)中，诱导培养基中的2，4-D的浓度优选为2. 0 3. Omg/L。有益效果与现有技术中的体细胞发生方法相比，本发明的福建山樱花体细胞胚胎发生方法具有的突出优势为首次采用福建山樱花的未成熟果实，取其未成熟胚为外植体进行诱导，增殖且得到体胚苗和结构完整的再生植株，是一种周期短、繁殖率高、成苗快、 结构完整、遗传相对性稳定成本低廉的方法，突破了福建山樱花现存林分极为稀少、种实成熟时极易爆裂，种子的采收贮存与发芽极为困难，传统育种方法困难且育种效率低，无法满足园林绿化及生产的需要的现状。
图1是2，4-D浓度与胚性愈伤组织诱导率的关系曲线。图中的纵坐标为诱导率 (%)，横坐标为2，4-D的浓度，单位为mg/L ；
4图2是外植体接种到诱导培养基上的图3左图是外植体在诱导培养基上直接体细胞胚胎发生图4右图是外植体在诱导培养基上胚根伸长生长图5左图是外植体在诱导培养基上膨大生长且边缘有愈伤组织长出的图6右图是外植体在诱导培养基上诱导出的胚性愈伤组织图7是愈伤组织增殖阶段的愈伤组织图8和图9均为胚性愈伤组织在增殖阶段产生的胚状体；
图10是将胚状体转到培育培养基上光下培养图11是体胚苗生长培养基上的图。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的解释。以下实施例所使用的材料和培养基配方如下
材料选择长势良好、抗性强的优良母株，开花授粉、坐果后采集其未成熟果实为材
料；
诱导培养基在MS或B5培养基中附加广4mg/L 2，4_D、0. 2 lmg/L BA、500mg/L水解酪蛋白、10mg/L的维生素C、30g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH5. 8 ；
增殖培养基在MS或1/2MS培养基中附加0. 5 1.0mg/L 2，4_D、0. 2 0. 5mg/L ΒΑ、 500mg/L水解酪蛋白、lOmg/L维生素C、30g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH5. 8 ；
培育培养基在MS培养基中附加:10mg/L维生素C、蔗糖30g/L和琼脂6g/L，ρΗ5· 8 ； 生长培养基在MS培养基中附加10mg/L维生素C、蔗糖20g/L和琼脂6g/L，pH5. 8 ； 其中，MS、B5以及1/2MS培养基均为业内标准配方。实施例1胚性愈伤组织的诱导
采用未成熟胚进行胚性愈伤组织的诱导。春季采集未成熟果实先用流水冲洗2h，然后在超净台上用酒精灭菌30s，用灭过菌的蒸馏水冲洗干净再用0. 1%的升汞或84消毒液处理Γ20π η，蒸馏水冲洗干净，未成熟果实在超净工作台内用解剖刀切开种皮，取出两片子叶和未成熟胚接到诱导培养基上，如图2所示，将接种好的材料置于23°C的培养箱中进行暗培养。未成熟胚接到诱导培养基上后约半个月后开始启动，如图3、图4、图5和图6中所示，有的直接体细胞胚胎发生，有的红色的胚根开始伸长，有的则在子叶子叶膨大边缘有白色突起，有的在刀口边缘长出白色、淡黄色或黄绿色愈伤组织。如图1所示，各种浓度的2，4-D均能诱导愈伤组织产生，浓度低的2，4_D利于福建山樱花直接体细胞胚胎发生，浓度为2. (Γ3. Omg/L的2，4-D特别利于胚性愈伤组织的产生。实施例2胚性愈伤组织增殖阶段
胚性愈伤组织增殖阶段，采用增殖培养基，增殖培养基继续使用MS基本培养基，置于 23°C的培养箱中进行暗培养，如图7所示。胚状体的发生，在胚性愈伤组织增殖培养基上， 继代几次后，如图8和图9所示，黄绿色愈伤上有白色的，球形的胚状体产生。实施例3胚状体的发育和成熟
胚状体的发育和成熟，球形胚形成以后，转入培育培养基进行光下培养，光照ll'h.d S光照度为1200 lx，室温为22 27°C。如图10所示，幼苗在MS培养基上发育成小植株，转入生长培养基，继续培养，长成完整小苗，如图11所示。 本发明的福建山樱花体细胞胚胎发生技术为福建山樱花的大规模无性繁殖育苗提供一种周期短、繁殖率高、成本低廉的方法，有效解决了福建山樱花现存林分极为稀少、 种子成熟时极易爆裂、种子的采收贮存与发芽极为困难、传统育种方法困难、且育种效率低，无法满足园林绿化及生产需要问题。
权利要求
1.一种福建山樱花体细胞胚胎发生方法，其特征在于，包括以下步骤(1)春季采集福建山樱花的未成熟果实，先用流水冲洗2h，然后在无菌条件下切开种皮，取出两片子叶和未成熟胚接到诱导培养基，控温23°C，培养半个月，得胚性愈伤组织；其中，诱导培养基采用MS培养基，在其中附加1. 0 4· Omg/L 2，4_D、0. 2 1. Omg/L ΒΑ、 500mg/L水解酪蛋白、lOmg/L维生素C、30g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH5. 8 ；(2)将步骤(1)的胚性愈伤组织转入增殖培养基，控温23°C，暗培养至产生胚状体；其中，增殖培养基采用MS或1/2MS培养基，在其中附加0. 5 1. Omg/L 2，4_D、0. 2 0. 5mg/L BA、500mg/L水解酪蛋白、lOmg/L维生素C、30g/L蔗糖和6g/L琼脂，pH5. 8 ；(3)将步骤(2)的胚状体转入培育培养基，控温22 27°C，光照12h d— 1，光照度为 1200 lx，光培养至长出幼苗；其中，培育培养基采用MS培养基，在其中附加10mg/L维生素 C、蔗糖 30g/L 和琼脂 6g/L，ρΗ5· 8 ；(4)将步骤(3)的幼苗转入生长培养基，培养至长成完整小苗；其中，生长培养基采用 MS培养基，在其中附加10mg/L维生素C、蔗糖20g/L和琼脂6g/L，pH5. 8。
2.根据权利要求1所述的福建山樱花体细胞胚胎发生方法，其特征在于步骤(1)中， 诱导培养基中的2，4-D的浓度为2. (Γ3. Omg/L。
全文摘要
本发明公开了一种福建山樱花体细胞胚胎发生方法，该方法包括在诱导培养基上诱导未成熟胚的胚性愈伤组织、采用增殖培养基进行胚性愈伤组织增殖、采用培育培养基和生长培养基分别进行胚状体的发育和成熟，直至长成完整小苗。本发明的福建山樱花体细胞胚胎发生技术为福建山樱花的大规模无性繁殖育苗提供一种周期短、繁殖率高、成本低廉的方法，有效解决了福建山樱花现存林分极为稀少、种子成熟时极易爆裂、种子的采收贮存与发芽极为困难、传统育种方法困难、且育种效率低，无法满足园林绿化及生产需要问题。
文档编号A01H4/00GK102217534SQ201110097798
公开日2011年10月19日 申请日期2011年4月19日 优先权日2011年4月19日
发明者吕月良, 张元莉, 施季森, 苏倩, 陈璋, 陈金慧 申请人:南京林业大学