专利名称：金荞麦组织培养快速育苗方法
技术领域：
本发明涉及通过组织培养技术的植物再生，具体属于一种药用植物金荞麦的组织培养快速育苗方法。
背景技术：
目前，恶性肿瘤已成为日益常见且严重威胁人类生命和生活质量的主要疾病之一。因此，抗癌药物和癌预防药物的机理以及研发成了近年来科学家研究的热点。金荞麦 (Fagopyrum dibotrys(D. Don) Hara)为蓼科(Polygonaccae)荞麦属的多年生草本,是一种营养丰富并具有重要药用价值的资源植物。金荞麦的块根是我国民间传统的一味中草药。 据《本草纲目》记载，能“降气宽肠，磨积滞，清热肿痛，除白浊血滞，脾积泄泻”。现代药理学研究证明，金荞麦块根中含有一类包括左旋表儿茶素、表儿茶素-3-没食子酸酯及原矢车菊素B-2、B-4和原矢车菊素B-2的3，3’ - 二没食子酸酯在内的原花色素的缩合性单宁混合物(张雯洁等，1994)。这类缩合物对来源于肺、肝、结肠、白细胞和骨骼的癌细胞生长具有抑制作用(Chan P K 2003)，是多种抗癌药物和癌预防药物(如复方金荞麦颗粒、金荞麦片、和威麦宁胶囊等)的主要成分之一。此外，金荞麦还有解热消炎、祛痰镇咳、抗血小板聚集、抗突变、提高巨噬细胞吞噬功能等重要作用(何显忠，2001)。由于野生金荞麦资源大量减少，而需求日益增加。我国已于1999年将其列入《国家重点保护野生植物名录(第一批)》。金荞麦种子发芽率低，常规繁殖为根茎无性繁殖，而金荞麦的药用部位也是块根， 这种矛盾限制了金荞麦在中药产业发展中的广泛应用。近年来，金荞麦市场需求逐年增加， 传统获取金荞麦的方法是以采集和消耗野生资源为代价，由于多年来无计划的滥采滥挖以及自然环境的破坏导致金荞麦野生资源再生能力大大下降等原因，使得天然野生药用金荞麦资源严重不足，需要通过人工栽培来补充。由于金荞麦对成土母质要求不严，为人工引种栽培提供了有利条件。刘铁城等1981年就已在北京地区试种成功。由于人工栽培产量的限制，加之栽培品种在营养价值、药用成分含量和效价等方面的研究还是空白，限制了金荞麦在北京地区的推广应用。近年来，金荞麦在新药领域的应用发展很快，原料药材需求量逐年增加，而野生资源日趋匮乏，人工栽培产量较低，明显不能满足制药工业发展的需要。在北京地区扩大金荞麦引种栽培开发新药源具有广阔的发展空间和应用前景。因此，迫切需要采用一种更加科学、系统、有效、实用的技术，进行金荞麦优良品种的筛选和培育，特别是对现有的、已被广大药农所接受的人工栽培种进行种质提纯、复壮，培育出品质优良、变异小的高产、优质金荞麦并批量生产和供应市场，是目前亟待解决的问题。利用生物技术手段培育金荞麦优质种苗是解决中草药种质资源短缺的重要途径。 植物组织培养技术是快速育苗的有效方法，已在花卉、林木、蔬菜等领域得到了广泛的应用。应用组织培养方法快速繁殖优质药用植物金荞麦，是解决金荞麦供求矛盾、提高种植水平和金荞麦生料药质量的快速而有效地途径。皖西学院植物细胞工程安徽省工程技术研究中心的黄仁术等人，已经对金荞麦的离体快繁技术进行了研究。但该研究指出，细胞分裂素6-BA的水平不宜过高，过高会刺激外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深；还容易出现玻璃化现象，其茎不宜诱导生根，繁殖系数大为降低。更重要的是该研究并没有对金荞麦组培苗的炼苗移栽技术进行研究，而组培苗的移栽成活率是该技术能否真正地应用于商品化生产的关键。
发明内容
本发明的目的是建立药用植物金荞麦的组织培养快速育苗方法，规模化生产优质金荞麦种苗。该方法简单实用，高效迅速，适宜规模化生产。本发明经过反复实验，多重筛选，优化组织培养繁育条件，提出了适宜药用植物金荞麦组织培养快速繁育种苗的方法。本发明用田间金荞麦(Fagopyrum dibotrys (D. Don) Hara)新萌枝条为外植体；筛选出了不定芽快速增殖的培养基成分；筛选出了适宜的生根培养基配方，筛选并建立了适宜的试管苗移栽条件及田间管理措施。本发明的金荞麦组织培养快速育苗方法，具体步骤包括(1)外植体表面灭菌以金荞麦带腋芽的幼茎为外植体，切成2-3cm长的茎段，先用70%酒精处理30s，接着在0. 升汞溶液中浸泡10-15分钟，期间不断摇晃，最后用无菌水冲洗干净；(2)不定芽诱导与增殖将经上述处理的外植体切成单芽茎段，分别接种于含外源激素的MS培养基中，在25士2°C，1500-3000LuX，12_16h/d光照下培养25_30d，得到无根苗，每隔30d继代培养1次；继代培养基配方为MS培养基+1. Omg/L-3. Omg/L 6-BA+0mg/ L-l. Omg/L TDZ+0mg/L-0. 2mg/L NAA+25% -35%蔗糖，pH 5. 8-6. 0。上述培养基优选为MS培养基+2. 0mg/L 6-BA+O. 5mg/L TDZ+0. 2mg/L NAA+30% 蔗糖，pH 6.0。在该培养基中接种IOd后，不定芽迅速增殖并形成丛生芽，增值系数可达12.0 以上。无菌苗生长健壮，苗高2-3cm。以上培养基中，外植体上的腋芽均能正常萌发。每隔 25-35d可继代培养。(3)生根诱导选取健壮的2cm左右的无根苗，转至生根培养基中诱导生根，得到完整的试管植株；生根培养基配方为=IAMS培养基+0. lmg/L-1. 0mg/L NAA+15% -25%蔗糖，pH 5. 8-6. 0 ；在 25士2°C，1500-3000Lux，12_16h/d 光照下培养 15_20d。优选生根培养基为l/2MS+0. 5mg/L NAA+20%蔗糖，pH 6.0。该培养基条件下，金荞麦不定芽苗生根状态良好，生根率为100%，平均生根数为5. 85，平均根长为2. 5cm，呈辐射状分布，移栽易成活。(4)炼苗与移栽选取生根良好且健壮的试管苗，先在培养瓶中闭盖炼苗5-8d，再开盖炼苗2d，然后小心取出试管苗，洗净培养基，移入含有草炭土和珍珠岩(1 1-3 1， 体积比)混合基质的营养钵中并置于温室中，初期注意喷水保湿，用塑料薄膜覆盖，7d后逐渐揭去薄膜通风，增加光照，及时补足营养钵水分，2-4周后新根形成，移栽成活，营养钵中过渡培养1个月后移栽至田间，田间移栽成活率可达90%以上。其中，6-BA 为 6-benzylaminopurine 6-苄氨基嘌呤TDZ 为 Thidiazuron (N-phenyl-N，-1，2，3-thidiazol-5_urea)苯基脲类衍生物 (N-苯基-N，-1,2,3-赛二唑-5-脲)NAA % Naphthaleneacetic acid与现有技术相比，本发明具有以下优点和效果
(1)继代培养基中通过添加TDZ能够诱导大量的丛生芽，提高了繁殖系数，缩短了金荞麦种苗繁育周期。在金荞麦茎段诱导不定芽的再生体系中，不同激素组合应用对金荞麦不定芽的增殖具有显著影响。BA利于不定芽的诱导，TDZ促进丛生芽的产生，NAA促进不定芽的伸长。金荞麦传统种植育苗多采用根插繁殖方式，繁殖系数低，难以满足大规模生产的需求。本发明可以在较短的时间内规模化生产金荞麦优质种苗，并且可以选择优质品种、 变种或类型进行规模化的工厂化育苗。(2)以茎段为外植体，通过不定芽直接再生的方式进行快速繁殖，保持了优良性状的遗传稳定性，并且取材容易，更新方便。(3)多次试验证明，炼苗移栽过程中，通过先闭盖炼苗5-8d，再开盖炼苗2d的过渡炼苗法，能明显提高试管苗的适应能力，移栽成活率达90%以上。(4)可以根据市场供求关系，合理安排和调整生产规模，及时组织生产，并可实现周年生产。(5)具有普遍适用性。本发明基于对江苏产金荞麦及其具有优良性状的金荞麦辐射诱变突变体进行的快速繁育研究，有助于今后筛选得到的金荞麦优质品种或类型的快速繁殖与推广。
图1示金荞麦不定芽的增殖外植体在激素配比为2. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L TDZ+0. 2mg/L NAA+30%蔗糖的MS培养基中，不定芽迅速增殖，4周后得到大量丛生芽。图2示金荞麦不定芽苗生根将2-3cm高的不定芽苗接入含0. 5mg/L NAA+20%蔗糖的1/2MS培养基中，15天不定根开始形成，20d时形成完整根系。图3示金荞麦试管苗移栽至有基质的营养钵中试管苗经炼苗后，洗净根部的培养基，移栽到含有草炭土和珍珠岩混合基质的营养钵中。图4示金荞麦试管苗移栽大田营养钵中的试管苗适应大田环境，根系发育完善后，移栽至大田，生长表现正常。图5示移栽至大田的金荞麦试管苗开花试管苗移栽至大田3个月后开花。图6示移栽后的金荞麦试管苗块根移栽至大田的试管苗生长状态良好，根茎发育正常。
具体实施例方式实施例1将引自江苏，在药用植物研究所试验基地栽培多年的金荞麦幼嫩茎段作为外植体，切成2-3cm切段，经70 %酒精处理30s，无菌水冲洗2遍，再在0. 1 %升汞溶液中浸泡 12分钟，期间不断摇晃，最后用无菌水冲洗5次，每次1分钟。将经上述处理的外植体切成单芽茎段30个，接种于含2. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L TDZ+0. 2mg/L NAA+30%蔗糖的MS培养基中，在25士2°C，1500-3000Lux，12-lMi/d光照下培养，进行不定芽的诱导与增殖，4周后得到丛生苗(如图1)，每隔30d继代培养1次，继代3次以后得到大量不定芽苗。选取健壮的2-3cm左右的无根苗，转至生根培养基中诱导生根，生根培养基配方为l/2MS+0. 5mg/ LNAA+20%蔗糖，pH 6.0。在同样培养条件下培养20d得到完整的试管植株(如图2)。选取生根良好且健壮的植株先在培养瓶中闭盖炼苗5-8d，再开盖炼苗2d，然后小心取出试管苗，洗净培养基，移入含有草炭土和珍珠岩(1 1，体积比)混合基质的营养钵中(如图3)， 在温室中过渡培养。初期注意保湿，用塑料薄膜覆盖，7d后逐渐揭去薄膜通风，增加光照，及时补足营养钵水分，4周后新根形成，移栽成活，将营养钵置于田间，1周后移栽至田间，30d 后田间移栽成活率可达90%以上(如图4)。3个月后，试管移栽苗正常开花(如图5)，10 月底采收金荞麦块根，发育良好(如图6)实施例2将引自贵州，在药用植物研究所试验基地栽培多年的金荞麦幼嫩茎段作为外植体，切成2-3cm长的切段，经70%酒精处理30s，无菌水冲洗2遍，再在0. 升汞溶液中浸泡10分钟，期间不断摇晃，最后用无菌水冲洗5次，每次1分钟。将经上述处理的外植体切成单芽茎段30个，接种于含1. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L NAA+30%蔗糖的MS培养基中，在 25士2°C，1500-3000LuX，12-16h/d光照下培养，进行不定芽的诱导，2周后腋芽萌发，形成无菌苗。把所得的无菌苗继续切割成单芽茎段，转入筛选得到的芽增殖培养基。培养基组成为:MS+2. Omg/L 6-BA+O. 2mg/L TDZ+0. 5mg/L NAA+30%蔗糖，pH 6. 0，每隔 30d 继代培养 1次，继代3次以后得到大量不定芽苗。选取健壮的2-3cm左右的无根苗，转至生根培养基中诱导生根，炼苗及移栽(同实施例1)。其余的不定芽苗转入不定芽增殖培养基中继代增殖培养。
权利要求
1.一种金荞麦组织培养快速育苗方法，其特征在于包括以下步骤(1)外植体表面灭菌以金荞麦带腋芽的幼茎为外植体，切成2-3cm切段，先用70%酒精处理30s，接着在0. 1 %升汞溶液中浸泡10-15分钟，期间不断摇晃，最后用无菌水冲洗干净；(2)不定芽诱导与增殖将经上述处理的外植体切成单芽茎段，分别接种于含外源激素的MS培养基中，在25士2°C，1500-3000LuX，12-16h/d光照下培养25-30d，得到无根苗，每隔30d继代培养1次；继代培养基配方为MS培养基+1. Omg/L-3. Omg/L 6-BA+0mg/ L-l. Omg/L TDZ+0mg/L-0. 2mg/L NAA+25% -35%蔗糖，pH 5. 8-6. 0 ；(3)生根诱导选取健壮的、2cm左右长的无根苗，转至生根培养基中诱导生根，得到完整的试管植株；生根培养基配方为1/2MS培养基+0. lmg/L-1. Omg/L NAA+15%-25%蔗糖， pH 5. 8-6. 0 ；在 25士2°C，1500-3000Lux，12_16h/d 光照下培养 15_20d ；(4)炼苗与移栽选取生根良好的试管苗，先在培养瓶中闭盖炼苗5-8d，再开盖炼苗 2d，然后小心取出试管苗，洗净培养基，移入含有体积比为1 1-3 1的草炭土和珍珠岩混合基质的营养钵中并置于温室中，初期注意保湿，用塑料薄膜覆盖，7d后逐渐揭去薄膜通风，增加光照，及时补足营养钵水分，2-4周后，将营养钵置于田间，1-2周后移栽至田间。
2.根据权利要求1所述的金荞麦组织培养快速育苗方法，其特征在于所述的步骤(1) 中外植体表面灭菌为先用70%酒精处理30s，接着在0. 升汞溶液中浸泡12分钟，期间不断摇晃，最后用无菌水冲洗5次，每次1分钟。
3.根据权利要求1所述的金荞麦组织培养快速育苗方法，其特征在于所述的步骤(2) 中不定芽诱导与增殖培养基为MS培养基+2. Omg/L 6-BA+O. 5mg/L TDZ+0. 2mg/L NM+30% 蔗糖，pH 6.0。
4.根据权利要求1所述的金荞麦组织培养快速育苗方法，其特征在于所述的步骤(3) 中生根培养基为l/2MS+0. 5mg/L NAA+20%蔗糖，pH 6. 0。
5.根据权利要求1所述的金荞麦组织培养快速育苗方法，其特征在于所述的步骤(4) 中炼苗方式采用先闭盖炼苗8d，再开盖炼苗2d的两步炼苗法，混合基质中草炭土和珍珠岩的体积比为1 1。
全文摘要
本发明提供了一种药用植物金荞麦的组织培养快速育苗方法。该方法选择金荞麦的带芽茎段作为外植体，表面灭菌后接种于附加2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L TDZ+0.2mg/L NAA+30％蔗糖的MS培养基中诱导不定芽的快速增值，继代3次后得到大量不定芽苗；将2-3cm左右的不定芽苗转入1/2MS+0.5mg/LNAA+20％蔗糖的培养基中诱导生根；经炼苗后移栽田间，试管苗的移栽成活率在90％以上。本发明方法快速、高效，成本低，移栽成活率高，便于推广，遗传稳定好，适用于各种金荞麦栽培品种或类型。可根据市场情况，在短时间内大量繁殖和生产优质的金荞麦种苗和原料药材。
文档编号A01H4/00GK102228006SQ20111016021
公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月15日 优先权日2011年6月15日
发明者李艾莲, 陈彩霞 申请人:中国医学科学院药用植物研究所