专利名称：以幼叶为外植体花生再生体系的建立方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及以幼叶为外植体花生再生体系的建立方法。
背景技术：
花生是世界重要的油料作物之一，我国的花生产量居世界首位。一些生物及非生物胁迫都会影响花生的产量，尤其是地下害虫、真菌及细菌病害。尽管传统的杂交育种可以得到一些抗虫抗病的品系(Garcia et al.，2006)，但是花生栽培品种遗传多样性低 (Kochert et al.，1991)，杂交育种周期长，育成的抗病性状通常与其他非预期的性状连锁，因此，目前通过分子育种手段培育花生品种，改良花生品质具有明显的优势。再生体系的效率是基因转化成功与否的关键，植物再生体系就是利用细胞的全能性，通过组织培养途径或其他非组织培养途径，在外源激素的作用下经过器官发生或胚体细胞高效、稳定地得到再生植株。外植体的选择要求有较强的再生能力、对抗生素敏感、适宜外源基因的导入及整合。花生的组织培养开始于20世纪40年代，我国则起始于70年代， 但再生效率很低。建立一个高效的花生再生体系，对改良花生品质、提高花生产量具有重要的意义。
发明内容
针对上述领域中的缺陷，本发明提供一种以幼叶为外植体花生再生体系的建立方法，该方法的芽诱导率能达到40%左右，芽伸长率达79 %，继代生长良好，可成为基因转化的良好的再生体系。以幼叶为外植体花生再生体系的建立方法，包括如下步骤(1)选取幼嫩的叶片，剪去叶缘后，正面朝上放置在含有TDZ和NAA的芽诱导培养基上光照培养出芽，TDZ的浓度为O-Imgr1 ；NAA的浓度为0. 5-angr1，所述TDZ的浓度不高于NAA的浓度，且NAA的浓度与TDZ的浓度差值不大于Imgr1 ；(2)将产生的不定芽继代，转移到含有6-BA和NAA的伸长培养基上，诱导芽伸长至 2cm ；6-BA 的浓度为 4-Smgr1，NAA 的浓度为 0. 5-lmgr1 ；(3)将伸长的不定芽转到含有NAA的生根培养基上培养生根，NAA的浓度为 0. 5-lmgr1 ；(4)生根小苗按常规方法移植栽培。所述芽诱导培养基为MS基础培养基。所述芽诱导培养基的TDZ的浓度为0. SmgF1 ；NAA的浓度为0. Smgr1，步骤(1)培养时间为五周。所述伸长培养基为MS基础培养基。所述伸长培养基的6-BA的浓度为Smgl^NAA的浓度为0. Smgr1，步骤⑵培养时间为两周。
所述生根培养基为MS基础培养基。所述生根培养基的NAA的浓度为0. Smgr1，步骤(3)培养时间为两周。所述幼叶为完整胚的子叶在基本培养基上培养5天后长出的幼嫩叶片。所述完整胚的子叶在培养前需对花生作无菌处理。所述无菌处理的方法为花生去壳，放置于75%乙醇中lmin，弃乙醇，0. 升汞中放置％iin，灭菌水洗3次，放置于无菌纸上至晾干。本发明采用幼叶作为花生再生体系的外植体，在含有TDZ和NAA的芽诱导培养基上诱导出芽后，再在含有6-BA和NAA的伸长培养基上促进不定芽伸长，再于含有NAA的生根培养基上培养生根，得到生根小苗，可以按常规方法移植栽培。本发明建立的再生体系， 其芽诱导率高达40%左右，芽伸长率达79%。继代生长良好，可成为基因转化的良好的再生体系。
图1以幼叶为外植体的花生组织培养A 幼叶外植体B 不定芽C 诱导芽D 芽伸长E 生根F 移栽及结实
具体实施例方式芽诱导培养基为MS基础培养基，TDZ (即噻苯隆)的浓度为O-Imgr1 ；NAA(即萘乙酸)的浓度为0. 5-2mgr1伸长培养基为MS基础培养基，6_BA(即6_苄氨基嘌呤)的浓度为4-Smgr1，NAA 的浓度为0. 5-lmgr1 ；生根培养基为MS基础培养基，NAA的浓度为0. 5-lmgr1MS基础培养基可以市售，也可按配方自行配制。花生为市售的任一品种。实施例11.以幼叶为外植体芽诱导培养基及伸长培养基的确定1.花生去壳，放置于75%乙醇中lmin，弃乙醇，0. 1 %升汞中放置％iin，灭菌水洗 3次，放置与无菌纸上至吹干；2.用无菌的手术刀，将花生两个子叶分开，含有完整胚的子叶放置在基本培养基上，光照培养；3.选取培养不同时间幼嫩的叶片，剪去叶缘后，正面朝上放置在含有TDZ、6_BA和 NAA的芽诱导培养基上(表1)，光照培养，每种培养基放置35个左右外植体；表1芽诱导培养基正交实验设计
权利要求
1.以幼叶为外植体花生再生体系的建立方法，包括如下步骤(1)选取幼嫩的叶片，剪去叶缘后，正面朝上放置在含有TDZ和NAA的芽诱导培养基上光照培养出芽，TDZ的浓度为O-Imgr1 ；NAA的浓度为0. 5-angr1，所述TDZ的浓度不高于NAA 的浓度，且NAA的浓度与TDZ的浓度差值不大于Imgr1 ；(2)将产生的不定芽继代，转移到含有6-BA和NAA的伸长培养基上，诱导芽伸长至 2cm ；6-BA 的浓度为 4-Smgr1，NAA 的浓度为 0. 5-lmgr1 ；(3)将伸长的不定芽转到含有NAA的生根培养基上培养生根，NAA的浓度为 0. 5-lmgr1 ；(4)生根小苗按常规方法移植栽培。
2.根据权利要求1所述的方法，所述芽诱导培养基为MS基础培养基。
3.根据权利要求2所述的方法，所述芽诱导培养基的TDZ的浓度为0.SmgF1 ；NAA的浓度为0. Smgr1，步骤(1)培养时间为五周。
4.根据权利要求1所述的方法，所述伸长培养基为MS基础培养基。
5.根据权利要求4所述的方法，所述伸长培养基的6-BA的浓度为Smgl—1，NAA的浓度为0. δπ^Γ1，步骤(2)培养时间为两周。
6.根据权利要求1所述的方法，所述生根培养基为MS基础培养基。
7.根据权利要求6所述的方法，所述生根培养基的NAA的浓度为0.Smgl—1，步骤(3)培养时间为两周。
8.根据权利要求1所述的方法，所述幼叶为完整胚的子叶在基本培养基上培养5天后长出的幼嫩叶片。
9.根据权利要求5所述的方法，所述完整胚的子叶在培养前需对花生作无菌处理。
10.根据权利要求9所述的方法，所述无菌处理的方法为将花生去壳，放置于75%乙醇中lmin，弃乙醇，0. 升汞中放置％iin，灭菌水洗3次，放置于无菌纸上至晾干。
全文摘要
本发明涉及以幼叶为外植体花生再生体系的建立方法，属于生物技术领域。本发明采用幼叶作为花生再生体系的外植体，在含有TDZ和NAA的芽诱导培养基上诱导出芽后，再在含有6-BA和NAA的伸长培养基上促进不定芽伸长，再于含有NAA的生根培养基上培养生根，得到生根小苗，可以按常规方法移植栽培。本发明建立的再生体系，其芽诱导率高达40％左右，芽伸长率达79％。继代生长良好，可成为基因转化的良好的再生体系。
文档编号A01H4/00GK102257965SQ201110179839
公开日2011年11月30日 申请日期2011年6月29日 优先权日2011年6月29日
发明者宋福平, 张 杰, 束长龙, 耿丽丽, 黄大昉 申请人:中国农业科学院植物保护研究所