专利名称：肌肉增强子序列及其应用的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种来自斑马鱼肌肉型肌酸激酶b(ckmb)基因的肌肉增强子及其应用。
背景技术：
基因转殖是现今生物技术领域广泛应用的技术，其是经由遗传工程技术将可表达特定基因产物的核酸分子导入细胞，以修饰其基因表达、给予新的表现性状或作为大量生产特定基因产物的工具。例如，针对牛、羊、猪、鱼、虾等经济动物，可用以改良品种、改良肉质、增加生长率、提高抗病能力及适应力、或提升观赏价值等。以鱼而言，水族产业消费型态 由传统蓄养观赏，渐渐提升趋向艺术化、精致化与生活化。而生物科技的发展与创新运用促成了“荧光鱼”的诞生，荧光鱼产业具有技术密集、高附加价值等特性，因此具有庞大的发展潜力与商机。一般而言，欲使导入细胞的核酸分子在细胞内表达出所欲的基因产物需要适当的启动子序列调控，以达所欲效果，例如，组织专一性表达、诱导性表达、或提升的蛋白质表达量，而增强子序列可再进一步增强启动子活性。以鱼类而言，目前常用于基因转殖荧光观赏鱼的启动子包括来自斑马鱼肌凝蛋白轻炼2 (myosin light chain 2,mylz2)的2. 2kb启动子。然而，斑马鱼mylz2启动子在斑马鱼种外的其它鱼种和物种的活性仍有改善加强的空间。因此，在此领域中，仍有需要一种可提升启动子活性的增强子序列，以应用于动物，特别是鱼类的转殖基因技术，。
发明内容
本发明是从斑马鱼肌肉型肌酸激酶b (ckmb)基因分离出一段肌肉增强子序列，其具有明显提高启动子活性的效果，并进一步利用该增强子序列结合启动子制备转殖基因动物(如荧光鱼)，不仅可于不同目(Order)鱼种中应用，亦有应用到其它脊椎动物如哺乳类的肌肉细胞中的潜力，有利于在生物反应器中的应用。因此，在一方面，本发明提供一种分离的核酸分子，其是由SEQ ID NO 1的核苷酸序列所组成，其具有增强子的活性。在另一方面，本发明提供一种重组表达框，其包括(a)第一核苷酸片段，其包括一含启动子的核苷酸序列及SEQ ID NO :1的核苷酸序列；及(b)第二核苷酸片段，其编码外源蛋白且操作地与第一核酸片段连接，使得该外源蛋白在第一核苷酸片段的调控下表达。根据本发明，该含启动子的核苷酸序列是衍生自斑马鱼肌肉型肌酸激酶b(ckmb)基因。在一具体实例中，该含启动子的核苷酸序列是选自SEQ ID NOS :2至11所组成的群的任一序列。在另一具体实例中，该第一核苷酸片段是选自SEQ ID N0:2、3、12及13所组成的群的任一序列。在一具体实例中，其中该外源蛋白是荧光蛋白。在又一方面，本发明提供一种表达载体，其包括上述重组表达框。本发明还提供一种宿主细胞，其包括上述表达载体。本发明亦提供一种制备转殖基因动物的方法，其包括将前述表达载体导入动物的配子、受精卵、胚胎或体细胞的细胞核或细胞质内，使该表达载体所含的核苷酸片段在胚胎或细胞中继续复制，进而在个体及其后代细胞中表达；其中该动物不包含人类。根据本发明的具体实施例，本发明的方法可用于制备转殖基因鱼，特别是荧光鱼。其是使用显微注射技术将该表达载体导入鱼的受精卵中。其中该鱼是斑马鱼或神仙鱼。本发明亦提供一种分离的核酸分子，其具有选自SEQ ID NOS 2至13所组成的群 的任一核苷酸序列。
上述发明内容及以下具体实施方式
与所附图式一并阅读将更增了解。为达阐明本发明的目的，图式中所示具体实例为目前最佳实施方式。然而，应了解本发明并不限于所示的特定排列及结构。图I 为 pT2-mylz2_P2· O-AmCyanl 载体结构不意图；图2 为 pT2-mylz2-P2. O-TcFP-Il 载体结构示意图；图3 为 pT2-mylz2-P2. O-TcFP-13 载体结构示意图；图4为根据本发明的ckmb-P2363片段(-1202/+1161);由ATG(+1162)转译起始点往前进行选殖2363bp片段，序列中标示重要肌肉生长相关转译因子结合位置；+1为转译起始位置，*为第二个转译起始位置，丨和丨代表I. 2kb启动子是列删减位置。下半部阴影部位表示335bp增强子片段；图5 为根据本发明以载体(a)pT2-ckmb-P2363-TcFP_13 及(b)pT2-ckmb-P1271-TcFP-13利用显微注射至斑马鱼单一细胞阶段(one-cell stage)受精卵，以荧光显微镜观察2天大的斑马鱼胚胎的瞬时表达，其中左图是经HcRedl滤镜观察，右图是亮视野合并图。曝光时间1000msec,比例尺为Imm;图6 为根据本发明以载体(a)pT2-ckmb-P2363-TcFP_13 及(b)pT2-ckmb-P1271-TcFP-13利用显微注射至斑马鱼单一细胞阶段受精卵，以荧光显微镜观察3天大的斑马鱼胚胎的瞬时表达，其中左图是经AmCYANl滤镜观察，右图是亮视野合并图；曝光时间500msec,比例尺为Imm ；图7为片段系列删减的启动子构建示意图及活性分析结果；虚线部分为未选殖区段，实线部分为实际选殖区段，各形状区块表示转译因子结合位置，位于实线上方代表顺向，位于实线下方代表反向；启动子活性及专一性依照强度划分为五个等级，以正号表示，+/_代表与其它组别相比趋近于不表达，但仍具有微弱表达。I表示MyoD家族，*表示MEF2，
I表示E-盒子,I表示TATA盒子,ι表示TREX/SIX4, 表示MAZ,—表示外显子1，D表示外显子2 (在ATG之前)；图8为pT2-ckmb-P1343-TcFP-13载体构建示意图；|表示MyoD家族，表示MEF2，
I表示E-盒子，ι表示SIX4/MEF3,表示MAZ, |表示TATA盒子，表示外显子I,-表示外显子2 (在ATG的前)；图9 为根据本发明以载体 pT2-ckmb-P1271-TcFP-13 及 pT2-ckmb-P1343-TcFP_13利用显微注射至斑马鱼单一细胞阶段受精卵，以荧光显微镜观察3天大的斑马鱼胚胎的瞬时表达；曝光时间500msec,比例尺为Imm ；图10为以各种载体利用显微注射至斑马鱼单一细胞阶段受精卵，使用商业套组进行冷光活性分析的结果；图11为根据本发明制备的基因转殖荧光观赏鱼Tg(ckmb-P2363 TcFP-13)Fl子代；图12为根据本发明以斑马鱼ckmb调节序列表达台湾珊瑚红色荧光蛋白(TcFP-Il)的亲代神仙鱼(F0，二个月)，其肌肉可见镶嵌性表达红色荧光；图13为根据本发明以pT2-EnInl-ckmb-P2363-TcFP-ll载体导入小鼠C2C12肌母 细胞，经诱导分化成肌管细胞后，观察到强烈的荧光蛋白表达，其中(a)是可见光图，(b)是荧光图以及(C)是合并图；图14为本发明的335bp核苷酸片段(SEQ ID NO 1)；图15为本发明的ckmb-P1343核苷酸片段(SEQ ID NO 2)；图16为本发明的ckmb_P2363片段核苷酸片段(SEQ ID NO 3)；图17为本发明的ckmb-P69片段核苷酸片段(SEQ ID NO 4)、ckmb_P183片段(SEQID NO 5)、ckmb-P227 片段(SEQ ID NO 6)及 ckmb_P251 片段(SEQID NO 7)；图18为本发明的ckmb-P371片段核苷酸片段(SEQ ID NO 8)及ckmb_P511片段(SEQ ID NO 9)；图19为本发明的ckmb_P1079片段核苷酸片段(SEQ ID NO 10)；图20为本发明的ckmb_P1271片段核苷酸片段(SEQ ID NO 11)；图21为本发明的EnInl-ckmb-P371片段核苷酸片段(SEQ ID NO 12)；图22为本发明的EnInl-ckmb-P2363片段片段核苷酸片段(SEQ ID NO 13)；图23为斑马鱼肌球蛋白轻链2启动子(对照组)核苷酸片段(SEQ ID NO 14)。本发明的各个具体实例的细节说明如后。本发明的其它特征将会经由以下各个具体实例中的详细说明及申请专利范围而清楚呈现。无须进一步的阐述，相信本发明所属技术领域中技术人员基于前述说明即可利用本发明至最广的程度。因此，可以理解以下的说明仅仅是作为例示说明，而非以任何方式限制本发明范围。
具体实施例方式除非另有指明，所有在此处使用的技术性和科学性术语具有如同本发明所属领域技术人员一般所了解的意义。本文所使用的“一”的表述方式，如未特别指明，是指至少一个(一个或一个以上)
的数量。本文所使用的“核酸分子”或“核酸”一词是指核苷酸单体的聚合体，其可以是单股或双股、直线型或环状、脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。一核苷酸单体包括磷酸基部分、糖基部分及碱基部分。常见的核苷酸的碱基部分包括鸟嘌呤(G)、腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、胸腺嘧啶(T)及尿嘧啶(U)，其中腺嘌呤与胸腺嘧啶或尿嘧啶配对，以及鸟嘌呤与胞嘧啶配对。本文所使用的“分离的核酸分子”是指从天然生物体来源纯化而来的核酸，或以化学合成法或PCR扩增技术所制得的核酸。核酸的纯化方法、化学合成法及PCR扩增技术可参见 Molecular Cloning A Laboratory Manual,第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Sambrook J 等人编著，1989,以及 Current Protocols in Molecular Biology,Frederick M. A.等人编著，2001, John Wiley & Sons, Inc.。此一领域的技术人员可依据惯知的技术获得本发明的核酸分子，详细方法描述于以下实例中。本文所使用的“可操作性地连 接”或类似用语是指调节序列与另一编码特定基因产物的核苷酸序列的连接方式，使得该核苷酸序列接受调节序列的控制或调节，而在适当条件下表达出该基因产物。本文所使用的“重组”是用以描述核酸分子含有非天然连接的序列。重组核酸分子可为载体形式，其可包括一或多个编码基因的结构序列及用于表达该基因的调节序列，例如，启动子序列。载体的种类包括但不限于质体、黏质体、噬菌体、YAC或PAC等。重组载体可用于表达或复制所导入的基因序列。典型地，在重组载体中，编码基因的结构序列是操作性地连结于调节序列，使得重组载体导入适当宿主中时，编码基因的结构序列在该调节序列的调控下表达。调节序列可包括但不限于启动子序列、起始密码子、复制起始点、增强子序列或分泌讯息序列等。本文所使用的“核酸分子编码...”或其类似用语是指，该核酸分子带有一或多个编码特定基因产物的核苷酸序列，而可在适当条件下作为模板表达出该基因产物。应了解的是，由于基因密码(由三个核苷酸所组成)的简并性，故不同的基因密码可编码相同的氨基酸残基，例如，GAU与GAC，两者在核苷酸序列上不同，但均编码相同氨基酸残基，S卩天门冬酸(Asp)。针对相同的多肽产物，所属领域技术人员可运用例行技术及已知的基因密码偏好性(codon usage)，获得对应的核苷酸序列及其简并序列。因此，本文所述编码特定基因产物的核苷酸序列尚包括其简并序列(可编码相同基因产物)。本文所使用的“重组表达框”一词是指一通过重组技术或合成产生的核苷酸序列，得以在宿主细胞中进行基因表达。表达框可嵌入质体或染色体中。典型地，一重组表达框包含欲转录的核苷酸序列及调节序列。在一方面，本发明提供一种分离的核酸分子，其是由SEQ ID NO :1的核苷酸序列所组成，其具有增强子的活性。具体而言，本发明的分离的核酸分子是分离自斑马鱼肌肉型肌酸激酶b (ckmb)基因的下游序列，长度为335bp，具有强烈提升启动子活性的效果。在另一方面，本发明提供一种重组表达框，其包括(a)第一核苷酸片段，其包括一含启动子的核苷酸序列及SEQ ID NO :1的核苷酸序列；及(b)第二核苷酸片段，其编码外源蛋白且操作地与第一核酸片段连接，使得该外源蛋白在第一核苷酸片段的调控下表达。根据本发明，SEQ ID NO 1的核苷酸序列可与任何适当的含启动子的核苷酸序列组合形成第一核苷酸片段，以调节第二核苷酸片段编码的外源蛋白的表达。在一具体实例中，该含启动子的核苷酸序列是衍生自斑马鱼肌肉型肌酸激酶b(ckmb)基因。在一特定实例中，该含启动子的核苷酸序列是选自SEQ ID NOS :2至11所组成的群的任一者。在另一特定实例中，SEQ ID N01的核苷酸序列与该含启动子的核苷酸序列所形成的第一核苷酸片段是选自SEQ ID NO :2、3、12及13所组成的群的任一者。表I列出SEQ ID NOS 1至11对应于ckmb基因的位置。
权利要求
1.一种分离的核酸分子，其由SEQ ID NO :1的核苷酸序列所组成，具有增强子的活性。
2.—种重组表达框,其包括 (a)第一核苷酸片段，其包括一含启动子的核苷酸序列及SEQID NO 1的核苷酸序列；及 (b)第二核苷酸片段，其编码外源蛋白且操作地与第一核酸片段连接，使得该外源蛋白在第一核苷酸片段的调控下表达。
3.如权利要求2的重组表达框，其中该含启动子的核苷酸序列是衍生自斑马鱼肌肉型肌酸激酶b (ckmb)基因。
4.如权利要求2的重组表达框，其中该含启动子的核苷酸序列是选自SEQIDNOS :2至11所组成的群的任一序列。
5.如权利要求2的重组表达框，其中该第一核苷酸片段是选自SEQID N0:2、3、12及13所组成的群的任一序列。
6.如权利要求2的重组表达框，其中该外源蛋白是荧光蛋白。
7.—种表达载体,其包括如权利要求2至6项中任一项的重组表达框。
8.—种宿主细胞，其包括如权利要求7的表达载体。
9.一种制备转殖基因动物的方法，其包括将如权利要求7的表达载体导入动物的配子、受精卵、胚胎或体细胞的细胞核或细胞质内，使该表达载体所含的核苷酸片段在胚胎或细胞中继续复制，进而在个体及其后代细胞上表达所编码的外源蛋白；其中该动物不包含人类。
10.如权利要求9的方法，其是用于制备转殖基因鱼。
11.如权利要求10的方法，其是使用显微注射技术将该表达载体导入鱼的受精卵中。
12.如权利要求10的方法，其中该鱼是斑马鱼或神仙鱼。
13.一种分离的核酸分子，其具有选自SEQ ID NOS :2至13所组成的群的任一核苷酸序列。
全文摘要
本发明是关于一种来自斑马鱼肌肉型肌酸激酶b(ckmb)基因的肌肉增强子及其应用。本发明的增强子可提升启动子活性，可用于制备转殖基因动物及应用于生物反应器中。
文档编号A01K67/033GK102911937SQ201110221498
公开日2013年2月6日 申请日期2011年8月3日 优先权日2011年8月3日
发明者龚纮毅, 陈鸣泉, 吴金洌, 黄士晋 申请人:龚纮毅