专利名称：一种快速有效地用沃尔巴克氏体(Wolbachia)转染蚊子的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速有效地用沃尔巴克氏体 (Wolbachia)转染蚊子的方法。
背景技术：
沃尔巴克氏体(Wolbachia)是广泛分布于节肢动物体内的共生微生物，它可能是昆虫共生微生物中最为丰富的类群。它分布于鞘翅目、双翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、鳞翅目等昆虫种类中。它以垂直传播作为其在宿主世代间传递的基本模式。它稳定地存在于宿主的生殖细胞内，通过卵细胞传递给宿主子代，并可通过多种方式如细胞质不亲和、雌性化和杀雄性等调控宿主的生殖活动。通过这些调控作用促进其在宿主种群内广泛传播。在沃尔巴克氏体(Wolbachia)引起的宿主生殖行为改变中，细胞质不亲和 (Cytoplasmic ^compatibility，Cl)是最常见的一种类型。它表现为当被沃尔巴克氏体(Wolbachia)感染的雄蚊与未感染雌蚊或感染不同种类Wolbachia的雌雄蚊交配时，精子和卵子结合后胚胎无法发育。沃尔巴克氏体(Wolbachia)的胞质不亲和的特性可导致 Wolbachia感染的蚊能侵入未感染或感染不同种Wolbachia的蚊群进行种群压制和种群替代。它的应用对蚊媒病防治具有巨大的价值。它的具体应用依赖于在病媒蚊群中人工引入沃尔巴克氏体(Wolbachia)感染。一些医学上重要的传播疾病蚊种如按蚊(传播疟疾)和伊蚊(传播登革)天然都不感染沃尔巴克氏体(Wolkichia)。所以建立人工用沃尔巴克氏体(Wolbachia)转染蚊子的方法显得十分重要。目前，主要采用胚胎注射的方法转染蚊子。此方法大致过程为获取沃尔巴克氏体(Wolkichia)，胚胎注射和转染成功蚊株的筛选。现阶段，有二种方法获取沃尔巴克氏体(Wolbachia):—种是先采用人工强制蚊子或果蝇产卵的方法收集含有沃尔巴克氏体 (Wolbachia)的胚胎，再从中直接抽取胞浆；另一种是先从含有沃尔巴克氏体(Wolbachia) 组织中提取沃尔巴克氏体(Wolkichia)，把它转入细胞内，让它在细胞内生长一段时间 (1-2年)后，再提取它用于转染蚊子。对于第一种方法，沃尔巴克氏体(Wolbachia)的获取依赖于人工强制产卵的方法收集的含有沃尔巴克氏体(Wolbachia)的胚胎，而人工强制产卵的方法可控性很差。大多数情况下，不能有效地在需要的时间内(胚胎注射需在蚊卵不超过排出后1. 5小时左右完成注射，以便沃尔巴克氏体进入生殖细胞；超过排出后1. 5小时的卵一般不能用于胚胎注射)获取用于抽取沃尔巴克氏体(Wolbachia)的胚胎。所以，大量时间和精力会消耗在规定时间人工强制产卵的方法获取含有沃尔巴克氏体(Wolbachia) 的胚胎上。而第二种耗时太长，不利于快速建立沃尔巴克氏体(Wolbachia)转染的蚊株。并且目前，转染成功蚊株的筛选一般是在原代(GO)，即胚胎注射后的蚊卵孵化并培育成的母成虫中进行筛选转染成功的阳性蚊株。但是这种方法是不妥的，这是因为理论上，在原代(GO)中的阳性并不能代表转染成功，同时，此方法丢弃了原代(GO)中阴性株，这将会损失大量的珍贵原代(GO)，因为有些阳性株就存在于这些被丢弃的阴性原代(GO)的子代(Gl)中。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速有效用沃尔巴克氏体(Wolbachia)转染蚊子的方法，利用该方法转染蚊子，可以快速有效的建立沃尔巴克氏体(Wolbachia)转染成功的蚊株。本发明首先快速的从含有沃尔巴克氏体的昆虫的卵巢中分离获取纯化的沃尔巴克氏体(Wolkichia)，然后再经常规的胚胎注射转染，获得原代(GO)的蚊株，在子代(第一代，Gl)筛选阳性蚊株，由此筛选获得的阳性蚊株即为真正转染成功的蚊株，而不会浪费珍贵的原代(GO)蚊株，从而实现了本发明的目的。本发明的快速有效用沃尔巴克氏体(Wolbachia)转染蚊子的方法，包括沃尔巴克氏体(Wolbachia)的获取，胚胎注射和转染成功蚊株的筛选，其特征在于所述的沃尔巴克氏体的获取，包括以下步骤(1)昆虫卵巢的制备解剖含有沃尔巴克氏体(Wolbachia)的昆虫，获得其卵巢， 置于SPG缓冲液中；(2)将卵巢勻浆，用SPG缓冲液冲洗收集，然后置于离心机中离心IOOg lOOOg， Imin lOmin，取上清再离心5000g 15000g，5 20min，去除上清，沉积物再用SPG缓冲液冲悬，再离心IOOg lOOOg，Imin lOmin，取上清，即得到纯化的沃尔巴克氏体 (Wolkichia)，该纯化的的沃尔巴克氏体(Wolbachia)即可用于蚊子的胚胎注射；所述的转染成功蚊株的筛选是将胚胎注射后的蚊卵培育获得原代母成虫(GO)、获取的原代母成虫(GO)与野生型公蚊交配后产生第一代(Gl)蚊株，从中筛选含有沃尔巴克氏体(Wolbachia)的阳性蚊株，由此筛选获得的阳性蚊株即为真正转染成功的蚊株。所述的含有沃尔巴克氏体(Wolbachia)的昆虫包括天然或人工感染沃尔巴克氏体(Wolbachia)的昆虫，优选为天然或人工感染沃尔巴克氏体(Wolbachia)的蚊子和果蝇。所述的沃尔巴克氏体的获取中步骤(2)优选为将卵巢勻菜，用SPG缓冲液冲洗收集，然后置于离心机中离心，300g, 5min,取上清再离心12000g，lOmin，去除上清，沉积物再用SPG缓冲液冲悬，再离心300g，5min，取上清，即得到纯化的沃尔巴克氏体(Wolbachia)。 利用该步骤离心分离，分离效果好。优选，所述的从原代母成虫与野生型公蚊交配后产生第一代蚊株中筛选含有沃尔巴克氏体的阳性蚊株，其具体方法是提取第一代蚊株产卵后的母蚊的卵巢，应用沃尔巴克氏体特征性基因引物进行PCR找到转染成功的蚊株。所述的沃尔巴克氏体特征性基因引物进一步优选为沃尔巴克氏体表面蛋白基因的通用引物81F 5' -TGG TCC MT MG TGA TGA AGA AAC 和 69IR 5' -AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA0所述的SPG缓冲液属于现有技术的缓冲液，其配方为每升含有218mM蔗糖，3. SmM KH2PO4, 7. 2mM K2HPO4,4. 9mM L-谷氨酸，余量为水，pH 7.2。在GO代的阳性只能说明通过胚胎注射沃尔巴克氏体(Wolbachia)进入了蚊体，而 Gl代阳性表明在GO代通过胚胎注射的沃尔巴克氏体(Wolbachia)进入了 GO代蚊子的生殖细胞，只有进入生殖细胞的沃尔巴克氏体(Wolbachia)才有能垂直传播到下一代，所以在 Gl代筛选到的阳性蚊株才是真正转染成功的蚊株。
本发明避开了人工强制产卵的方法，采用活体解剖的方法直接获得含有沃尔巴克氏体(Wolbachia)的昆虫卵巢组织(来源丰富，且容易获取)，将其勻浆，再利用离心沉淀的方法使卵巢组织和沃尔巴克氏体(Wolbachia)分离，从而得到纯化的、可用于胚胎注射转染的沃尔巴克氏体(Wolbachia)。将该纯化的沃尔巴克氏体(Wolbachia)经常规方法注射转染蚊子胚胎，卵培育获得原代母成虫(GO)、获取原代母成虫与野生型公蚊交配后产生第一代(Gl)蚊株，从中筛选含有沃尔巴克氏体的阳性蚊株，由此筛选获得的阳性蚊株即为真正转染成功的蚊株。由此可见本发明的方法中沃尔巴克氏体(Wolbachia)的获取，其来源(含有沃尔巴克氏体(Wolbachia)的昆虫卵巢组织)丰富，并且容易获取，整个方法操作简便，可控性极强，非常容易在规定的时间内获取大量的沃尔巴克氏体(Wolbachia)用于胚胎注射转染，从而节省了大量的时间和精力，提高的工作效率。而转染成功蚊株的筛选是在第一代 (Gl)进行，由此筛选到的阳性蚊株绝对是真正转染成功的蚊株，而不会出现假阳性的可能， 并且不会浪费珍贵的原代(GO)代蚊株。因此本发明的用沃尔巴克氏体(Wolbachia)转染蚊子的方法是一种快速有效的方法，本发明的实现有利于迅速的建立转染有沃尔巴克氏体(Wolbachia)的蚊株，从而有利于其大规模的应用。
图1是实施例1中的蚊卵排列于载玻片上并进行胚胎注射图；图2是利用PCR的方法检测Gl代中的蚊株是否转染成功，其中M为Marker，1-5 为待筛选的Gl蚊株，6为阴性对照，7为阳性对照，PCR产物为610bp ；图3是利用FISH方法检测蚊组织中的沃尔巴克氏体(Wolbachia)，图的左边为转染沃尔巴克氏体成功的蚊的卵巢的卵母细胞，在卵母细胞的两端和体表可见大量的荧光颗粒，为Wolbachia ；图的右边为阴性对照，未见荧光信号。
具体实施例方式以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1 1、沃尔巴克氏体的获取采用解剖方法收集含有沃尔巴克氏体(Wolbachia)的白纹伊蚊(Aedes albopictus)的卵巢，一次解剖多个蚊体收集其卵巢，一次收集的卵巢重大约50mg，收集后置于Iml的SPG缓冲液中。用杜恩斯组织勻浆器(Dounce Tissue Grinder) 破碎卵巢组织，卵巢组织通过杜恩斯组织勻浆器碾磨10次，每次0. 5min,碾磨后的组织用 0. 5ml的SPG缓冲液冲洗收集。收集液再置于离心机中离心300g，5分钟，去除一些组织碎片。转移上清液于新的离心管后再次离心12000g，10分钟。去除上清液，离心管中沉积物含有纯化的沃尔巴克氏体(Wolbachia)。再用50微升的SPG缓冲液溶解上述离心管中的沉积物后，再次离心300g，5分钟，进一步去除残存的组织碎片防止它堵塞胚胎注射的针头， 得到上清液，上清液即为纯化的沃尔巴克氏体(Wolkichia)。此上清夜即可作为胚胎注射液用于转染蚊子胚胎。2、胚胎注射用胚胎注射的方法使提取的沃尔巴克氏体(Wolbachia)转染蚊子胚胎的过程包括胚胎注射针头的制备、蚊子胚胎的收集和准备和胚胎注射。胚胎注射针头的制备采用毛细管(Quartz with filament, 0. D. 1. 0mm, I. D. :0.7mm)和拉针器(P2000 Micropipette puller, Sutter Instrument Co.)制备胚胎注射针头。设定对应的拉针仪参数(Heat-280, Fil_3，Vel-30，Del-240, Pull_150)，将毛细管拉制成开口小于 5 μ m 的注射针，用磨针器(micro-pipette beveller, Sutter Instrument Co.)磨开针头。蚊子胚胎收集和准备用人工强制蚊子产卵的方法收集蚊子(斯氏按蚊，Anopheles stephensi)胚胎。准备一只50ML离心管，转移8个已血餐4天的母蚊子到一只50ML离心管(管底铺上用水湿润的棉球，棉球表面有滤纸覆盖)，让母蚊子产卵45分钟。收集蚊卵，在解剖镜下用 5号小镊子选取并排列大约50个灰色的蚊卵于滤纸上。蚊卵应排列成一直的顺序，即蚊卵的前极(钝部)向左，后极(锐部)向右(见图1)。转移排列好的蚊卵到载玻片上，让蚊卵在空气中干燥约10秒后，用矿物油(Halocarbon 700)覆盖玻片上的蚊卵，防止它们的进一步干燥(见图1)。胚胎注射用加样枪头在胚胎注射针头中加入步骤1中制备好的含有沃尔巴克氏体(Wolbachia)的胚胎注射液，安装针头到显微注射器(Marishige Scientific, JAPAN)，在显微镜(10X目镜)下注射蚊卵。注射的位置是在蚊卵的后极(见图1)。注射完成后，用小镊子小心转移注射后的蚊卵到湿润的滤纸。把滤纸直接放入盛有高压灭菌过的蒸馏水的小杯中孵化。 3、转染成功蚊株的筛选筛选、鉴定和扩增转染成功的蚊株过程包括孵化胚胎注射后的蚊卵并培育获得母成虫(原代，G0)、获取母成虫与野生型公蚊交配后的子代(第一代Gl)和在子代(第一代，Gl)中筛选并扩增转染成功的蚊株。孵化胚胎注射后的蚊卵并培育获得母成虫(原代G0)注射后蚊卵直接放入盛有高压灭菌过的蒸馏水的小杯中孵化，注射后2天后检查幼虫个数并获得孵化率0%-5%)。在标准环境(80%相对湿度和27°C )中培育孵化的幼虫至蛹，让每个蛹在单独环境中发育成成虫以保证获得处女母蚊 (原代G0)。获取的母成虫(处女母蚊)与野生型公蚊交配后的子代(第一代Gl 用处女母蚊与野生型的处女公蚊交配一周后，给予足量的血餐。血餐后按常规收集蚊卵，孵化蚊卵并培育至成虫(第一代，Gl))。在子代(第一代，Gl)中筛选并扩增转染成功的蚊株待第一代 (Gl)成虫交配、血餐后，所有母蚊单独产卵。提取产卵后的母蚊的卵巢，用PCR方法(采用 Phire Animal Tissue Direct PCR Kit和检测沃尔巴克氏体(Wolbachia)表面蛋白基因的通用引物81F 5' -TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC禾P691R 5' -AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA进行PCR)找到转染成功的蚊株。具体方法为解剖获得待测的蚊的卵巢组织，放入 DNA Release Additive 的 STE 缓冲液(IOOmM NaCI, IOmM Tris HCI, ImM EDTA，PH8.0)中， 550C 5分钟，95°C 5分钟后制备成待测样品液备用。20 μ L体系PCR反应液组成2X Phire Animal Tissue PCR Buffer 10 μ L, Phire Hot Start II DNA Polymerase 0.4卩1，胃弓| 物最终浓度各ο. 5 μ M，待测样品液2 μ L，加灭菌蒸馏水至反应体积20 μ L。PCR反应条件 980C (5min) ；95°C (5s)，55°C (5s)，72°C (20s)，35 个循环后，2%琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 结果。见图2 其中M为Marker，line 1-5为待筛选的Gl蚊株，line 6为阴性对照，line 7为阳性对照，PCR产物为610bp，由图2可以看出1号孔和4号孔对应的Gl蚊株为转染成功的蚊株。发现了转染成功的蚊株后，孵化它的卵进而扩增种群，同时用上述PCR方法和 FISH方法(具体方法为用4% formaldehyde固定解剖得到血餐后3天的蚊卵巢，15分钟后，用0.1%的TWEEN 20清洗。固定后的蚊卵巢与尾端含有荧光标记的探针杂交M小时。探针序列来源于wolbachia的16SrRNA基因。随后经过3次洗脱后，标本置于荧光显微镜观察。)监测沃尔巴克氏体Wolbachia的母代转移率(maternal transfer rate)，见图3: 图的左边为转染沃尔巴克氏体成功的蚊的卵巢的卵母细胞，在卵母细胞的两端和体表可见大量的荧光颗粒，为Wolbachia;图的右边为阴性对照，未见荧光信号。实施例2 1、沃尔巴克氏体的获取将含有沃尔巴克氏体(Wolbachia)的白纹伊蚊(Aedes albopictus)采用解剖方法收集其卵巢，一次解剖多个白纹伊蚊收集其卵巢，一次收集的白纹伊蚊卵巢重大约50mg，收集后置于Iml的SPG缓冲液中。用杜恩斯组织勻浆器(Doimce Tissue Grinder)破碎卵巢组织，卵巢组织通过杜恩斯组织勻浆器碾磨10次，每次0. 5min, 碾磨后的组织用0. 5ml的SPG缓冲液冲洗收集。收集液再置于离心机中离心100g，10分钟， 去除一些组织碎片。转移上清液于新的离心管后再次离心15000g，5分钟。去除上清液，离心管中沉积物含有纯化的沃尔巴克氏体(Wolbachia)。再用50微升的SPG缓冲液溶解上述离心管中的沉积物后，再次离心100g，10分钟，进一步去除残存的组织碎片防止它堵塞胚胎注射的针头，得到上清液，上清液即为纯化的沃尔巴克氏体(Wolbachia)。此上清夜即可作为胚胎注射液用于转染蚊子胚胎。2、胚胎注射用胚胎注射的方法使提取的沃尔巴克氏体(Wolbachia)转染蚊子胚胎的过程包括胚胎注射针头的制备、蚊子胚胎的收集和准备和胚胎注射。胚胎注射针头的制备采用毛细管(Quartz with filament, 0. D. 1. Omm, I. D. :0.7mm)和拉针器(P2000 Micropipette puller, Sutter Instrument Co.)制备胚胎注射针头。设定对应的拉针仪参数(Heat-280, Fil_3，Vel-30，Del-240, Pull_150)，将毛细管拉制成开口小于 5 μ m 的注 MffrfflJgff"^ (micro-pipette beveller, Sutter Instrument Co.) JgJf#i。 if 胎收集和准备用人工强制蚊子产卵的方法收集埃及伊蚊(Aedes egypti)胚胎。准备一只50ML离心管，转移8个已血餐4天的母蚊子到一只50ML离心管(管底铺上用水湿润的棉球，棉球表面有滤纸覆盖)，让母蚊子产卵45分钟。收集蚊卵，在解剖镜下用5号小镊子选取并排列大约50个灰色的蚊卵于滤纸上。蚊卵应排列成一直的顺序，即蚊卵的前极(钝部)向左，后极(锐部)向右(见图1)。转移排列好的蚊卵到载玻片上，让蚊卵在空气中干燥约30秒后，用矿物油(Halocarbon 700)覆盖玻片上的蚊卵，防止它们的进一步干燥(见图1)。胚胎注射用加样枪头在胚胎注射针头中加入步骤1中制备好的含有沃尔巴克氏体 (Wolbachia)的胚胎注射液，安装针头到显微注射器(Marishige Scientific，JAPAN)，在显微镜(10X目镜)下注射蚊卵。注射的位置是在蚊卵的后极(见图1)。注射完成后，用小镊子小心转移注射后的蚊卵到湿润的滤纸。保存注射后的蚊卵在80%相对湿度和27°C环境中，保存5-7天。3、转染成功蚊株的筛选筛选、鉴定和扩增转染成功的蚊株过程包括孵化胚胎注射后的蚊卵并培育获得母成虫(原代，GO)、获取母成虫与野生型公蚊交配后的子代(第一代Gl)和在子代(第一代，Gl)中筛选并扩增转染成功的蚊株。孵化胚胎注射后的蚊卵并培育获得母成虫(原代GO)采用缺氧环境诱导注射后蚊卵的孵化。注射后蚊卵放入盛有高压灭菌过的蒸馏水的小杯中，把小杯放入抽气负压容器(-15inHg)中约一小时，一小时后检查幼虫个数并获得孵化率(5% -8% )。在标准环境(80%相对湿度和27°C )中培育孵化的幼虫至蛹，让每个蛹在单独环境中发育成成虫以保证获得处女母蚊(原代GO)。获
7取的母成虫(处女母蚊)与野生型公蚊交配后的子代(第一代Gl 用处女母蚊与野生型的处女公蚊交配一周后，给予足量的血餐。血餐后按常规收集蚊卵，孵化蚊卵并培育至成虫 (第一代，Gl))。在子代(第一代，Gl)中筛选并扩增转染成功的蚊株待第一代(Gl)成虫交配、血餐后，所有母蚊单独产卵。提取产卵后的母蚊的卵巢，用PCR方法(采用Wiire Animal Tissue Direct PCR Kit和检测沃尔巴克氏体(Wolbachia)表面蛋白基因的通用引物 81F 5' -TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC 禾口 69IR 5' -AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA进行PCR)找到转染成功的蚊株。具体方法为解剖获得待测的蚊的卵巢组织，放入 DNARelease Additive 的 STE 缓冲液(IOOmM NaCI, IOmM Tris HCI, ImM EDTA, PH8. 0)中， 550C 5分钟，95°C 5分钟后制备成待测样品液备用。20 μ L体系PCR反应液组成2X Phire Animal Tissue PCR Buffer 10 μ L, Phire Hot Start II DNA Polymerase 0.4卩1，胃弓| 物最终浓度各ο. 5 μ M，待测样品液2 μ L，加灭菌蒸馏水至反应体积20 μ L。PCR反应条件 98 0C (5min) ；95 °C (5s), 55 °C (5s), 72 °C (20s)，35 个循环后，2% 琼脂糖凝胶电泳鉴定 PCR 结果，由此而获得转染成功的蚊株。实施例3 1、沃尔巴克氏体(Wolbachia)的获取为将含有沃尔巴克氏体(Wolbachia)的库蚊(Cx.pipiens molestus)采用解剖方法收集其卵巢，一次解剖多个库蚊收集其卵巢，一次收集的库蚊卵巢重大约50mg，收集后置于Iml的SPG缓冲液中。用杜恩斯组织勻浆器 (Dounce Tissue Grinder)破碎卵巢组织，卵巢组织通过杜恩斯组织勻浆器碾磨10次，每次 0. 5min，碾磨后的组织用0. 5ml的SPG缓冲液冲洗收集。收集液再置于离心机中离心lOOOg， 1分钟，去除一些组织碎片。转移上清液于新的离心管后再次离心5000g，20分钟。去除上清液，离心管中沉积物含有纯化的沃尔巴克氏体(Wolbachia)。再用50微升的SPG缓冲液溶解上述离心管中的沉积物后，再次离心，lOOOg，1分钟，进一步去除残存的组织碎片防止它堵塞胚胎注射的针头，得到上清液，上清液即为纯化的沃尔巴克氏体(Wolbachia)。此上清夜即可作为胚胎注射液用于转染蚊子胚胎。2、胚胎注射用胚胎注射的方法使提取的沃尔巴克氏体(Wolbachia)转染蚊子胚胎的过程包括胚胎注射针头的制备、蚊子胚胎的收集和准备和胚胎注射。胚胎注射针头的制备采用毛细管(Quartz with filament, 0. D. 1. 0mm, I. D. :0.7mm)和拉针器(P2000 Micropipette puller, Sutter Instrument Co.)制备胚胎注射针头。设定对应的拉针仪参数(Heat-280, Fil_3，Vel-30，Del-240, Pull_150)，将毛细管拉制成开口小于 5 μ m 的注射针，用磨针器(micro-pipette beveller, Sutter Instrument Co.)磨开针头。蚊子胚胎收集和准备用人工强制蚊子产卵的方法收集白纹伊蚊(Aedes albopictus)胚胎。准备一只 50ML离心管，转移8个已血餐4天的母蚊子到一只50ML离心管(管底铺上用水湿润的棉球，棉球表面有滤纸覆盖)，让母蚊子产卵45分钟。收集蚊卵，在解剖镜下用5号小镊子选取并排列大约50个灰色的蚊卵于滤纸上。蚊卵应排列成一直的顺序，即蚊卵的前极(钝部)向左，后极(锐部)向右(见图1)。转移排列好的蚊卵到载玻片上，让蚊卵在空气中干燥约30秒后，用矿物油(Halocarbon 700)覆盖玻片上的蚊卵，防止它们的进一步干燥(见图1)。胚胎注射用加样枪头在胚胎注射针头中加入步骤1中制备好的含有沃尔巴克氏体 (Wolbachia)的胚胎注射液，安装针头到显微注射器(Marishige Scientific，JAPAN)，在显微镜(10X目镜)下注射蚊卵。注射的位置是在蚊卵的后极(见图1)。注射完成后，用小镊子小心转移注射后的蚊卵到湿润的滤纸。保存注射后的蚊卵在80%相对湿度和27°C环境中，保存5-7天。 3、转染成功蚊株的筛选筛选、鉴定和扩增转染成功的蚊株过程包括孵化胚胎注射后的蚊卵并培育获得母成虫(原代，GO)、获取母成虫与野生型公蚊交配后的子代(第一代Gl)和在子代(第一代，Gl)中筛选并扩增转染成功的蚊株。孵化胚胎注射后的蚊卵并培育获得母成虫(原代GO)采用缺氧环境诱导注射后蚊卵的孵化。注射后蚊卵放入盛有高压灭菌过的蒸馏水的小杯中，把小杯放入抽气负压容器(-15inHg)中约一小时，一小时后检查幼虫个数并获得孵化率(5% -8% )。在标准环境(80%相对湿度和27°C )中培育孵化的幼虫至蛹，让每个蛹在单独环境中发育成成虫以保证获得处女母蚊(原代GO)。 获取的母成虫(处女母蚊)与野生型公蚊交配后的子代(第一代Gl 用处女母蚊与野生型的处女公蚊交配一周后，给予足量的血餐。血餐后按常规收集蚊卵，孵化蚊卵并培育至成虫(第一代，Gl))。在子代(第一代，Gl)中筛选并扩增转染成功的蚊株待第一代 (Gl)成虫交配、血餐后，所有母蚊单独产卵。提取产卵后的母蚊的卵巢，用PCR方法(采用Phire Animal Tissue Di rect PCR Kit和检测沃尔巴克氏体(Wolbachia)的噬菌体 Bacteriophage locus (orf7)基因引物0rf7c_R 5' -TTGCTTGCTCAACACTTACACTT和 0rf7c_ F 5' -CCCACATGAGCCAATGAC GTCTG进行PCR)找到转染成功的蚊株。具体方法为解剖获得待测的岐的卵巢组织，放入DNARelease Additive的STE缓冲液(IOOmM NaCI, IOmM Tris HCI，ImM EDTA, PH8. 0)中，55°C 5分钟，95°C 5分钟后制备成待测样品液备用。20 μ L体系 PCR 反应液组成2X Phire Animal Tissue PCR Buffer 10 μ L, Phire Hot Start II DNA Polymerase 0. 4 μ L，两引物最终浓度各0. 5 μ M，待测样品液2 μ L，加灭菌蒸馏水至反应体 IR 20 μ L0 PCR 反应条件98°C (5min) ；95°C (5s)，55°C (5s)，72°C (20s)，35 个循环后，2% 琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR结果，由此而获得转染成功的蚊株。
权利要求
1.一种快速有效用沃尔巴克氏体(Wolbachia)转染蚊子的方法，包括沃尔巴克氏体的获取，胚胎注射和转染成功蚊株的筛选，其特征在于所述的沃尔巴克氏体的获取，包括以下步骤(1)昆虫卵巢的制备解剖含有沃尔巴克氏体的昆虫，获得其卵巢，置于SPG缓冲液中；(2)将卵巢勻浆，用SPG缓冲液冲洗收集，然后置于离心机中离心IOOg lOOOg， Imin lOmin，取上清再离心5000g 15000g，5 20min，去除上清，沉积物再用SPG缓冲液冲悬，再离心IOOg lOOOg，Imin lOmin，取上清，即得到纯化的沃尔巴克氏体，该纯化的沃尔巴克氏体即可用于蚊子的胚胎注射；所述的转染成功蚊株的筛选是将胚胎注射后的蚊卵培育获得原代母成虫、获取的原代母成虫与野生型公蚊交配后产生第一代蚊株，从中筛选含有沃尔巴克氏体的阳性蚊株，由此筛选获得的阳性蚊株即为转染成功的蚊株。
2.根据权利要求1所述的快速有效用沃尔巴克氏体转染蚊子的方法，其特征在于，所述的含有沃尔巴克氏体的昆虫包括天然或人工感染沃尔巴克氏体的昆虫。
3.根据权利要求2所述的快速有效用沃尔巴克氏体转染蚊子的方法，其特征在于，所述的含有沃尔巴克氏体的昆虫为天然或人工感染沃尔巴克氏体的蚊子或果蝇。
4.根据权利要求1所述的快速有效用沃尔巴克氏体转染蚊子的方法，其特征在于，所述的沃尔巴克氏体的获取中步骤O)为将卵巢勻浆，用SPG缓冲液冲洗收集，然后置于离心机中离心，300g, 5min,取上清再离心12000g，lOmin,去除上清，沉积物再用SPG缓冲液冲悬，再离心300g，5min，取上清，即得到纯化的沃尔巴克氏体。
5.根据权利要求1所述的快速有效用沃尔巴克氏体转染蚊子的方法，其特征在于，所述的从原代母成虫与野生型公蚊交配后产生第一代蚊株中筛选含有沃尔巴克氏体的阳性蚊株，其具体方法是提取第一代蚊株产卵后的母蚊的卵巢，应用沃尔巴克氏体特征性基因引物进行PCR找到转染成功的蚊株。
6.根据权利要求5所述的快速有效用沃尔巴克氏体转染蚊子的方法，其特征在于， 所述的沃尔巴克氏体特征性基因引物为沃尔巴克氏体表面蛋白基因的通用引物81F 5' -TGG TCC AAT AAG TGA TGA AGA AAC 和 69IR 5' -AAA AAT TAA ACG CTA CTC CA0
全文摘要
本发明公开一种快速有效地用沃尔巴克氏体(Wolbachia)转染蚊子的方法。它是采用活体解剖的方法直接获得含有沃尔巴克氏体的昆虫卵巢组织(来源丰富，且容易获取)，将其匀浆，再利用离心沉淀的方法使卵巢组织和沃尔巴克氏体分离，从而得到纯化的、可用于胚胎注射转染的沃尔巴克氏体。将该纯化的沃尔巴克氏体经常规方法注射转染蚊子胚胎，卵培育获得原代母成虫(G0)、获取原代母成虫与野生型公蚊交配后产生第一代(G1)蚊株从中筛选含有沃尔巴克氏体的阳性蚊株，由此筛选的阳性蚊株即为真正转染成功的蚊株。因此本发明的用沃尔巴克氏体转染蚊子的方法是一种快速有效的方法，本发明的实现有利于迅速的建立转染有沃尔巴克氏体的蚊株，从而有利于其大规模的应用。
文档编号A01K67/033GK102349473SQ201110230149
公开日2012年2月15日 申请日期2011年8月11日 优先权日2011年8月11日
发明者奚志勇, 朱俭 申请人:广州沃巴克生物科技有限公司