专利名称：水稻光敏感核不育基因pms3的分离克隆及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及植物基因工程技术领域。具体涉及一种水稻光敏感核不育基因pms3的分离克隆、功能验证及在水稻改良中的应用。
背景技术：
水稻是世界人口的主要粮食来源之一。随着世界人口的膨胀，土地面积的减少，水稻单产及总产量的提高一度成为育种工作者追求的目标。基于不育系、保持系和恢复系的“三系”法杂交水稻的成功培育与利用堪称水稻育种史上“一次伟大的革命”，但是，随着人口的继续增长以及人们生活水平的日益提高，对粮食生产提出了更高的要求，三系杂交稻不育胞质单一的弊端也逐渐显露出来，成为了阻碍三系杂交稻进一步推广和利用的重要因素。光温敏核不育水稻是石明松1973年从粳稻品种农垦58群体中首次发现的自然 突变体，命名为农垦58S(石明松.对光照长度敏感的隐性雄性不育水稻的发现及初步研究.中国农业科学，1985，2 :44-48)，它在长日照下雄性不育，短日照下雄性可育。利用这个重要特性，该水稻品种在长日高温条件下可作为不育系用于杂交制种，而在短日低温条件下又能自交繁殖下一年的不育系种子，因此，在杂交水稻种子生产过程中可以免去作为产生不育系种子的保持系，使常规使用的“三系”减少为“两系”。另外，农垦58S与其他的水稻品种杂交F1代均为正常可育，配组自由度增大，其育性恢复不受胞质基因限制，因而比CMS的恢复源更广泛。通过分离克隆光、温敏雄性不育基因，研究其作用的机理，阐明其作用的本质，并以此为指导，转化到理想的遗传背景中，将有助于快速创造优良的目标品系以应用于生产，从而提高水稻产量。
发明内容
本发明的目的是从水稻中分离克隆光敏感核不育基因pms3，对该基因进行功能验证及在水稻育种中的应用。该基因是一个不编码蛋白的长链RNA(见实施例5)。利用该基因的信息将极大的提高了优良不育系选育的速度，加快两系法育种进程，进一步提高水稻的生物学产量。本发明涉及分离和应用一个包含pms3基因的DNA片段，并对该片段的作用机理进行阐述。这一段DNA具有如SEQ ID NO : I所示的核苷酸序列。本发明涉及分离和应用编码长链RNA的光敏感核不育基因pms3，这个基因具有如SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列，包括与SEQ ID NO :2所示的核苷酸序列有90%以上同源性的基因序列，也包括因插入、替代或缺失一个或多个碱基而产生的突变体等位基因或衍生物。这个基因的等位基因具有如SEQID NO :3所示的核苷酸序列。本发明克隆的水稻光敏感核不育基因pms3突变植株，其花粉的育性受到光照长度的影响在长日照条件下，花粉完全败育；而短日照条件下，花粉则表现部分或全部可育。将突变植株中的包含pms3基因的DNA片段通过遗传转化的方法导入到正常水稻品种中，可以使正常水稻的花粉败育(见实施例I)，可用于新的不育系的培育。本发明涉及根据pms3的DNA片段序列信息发展的用于培育水稻光敏感核不育系的分子标记，通过对水稻正常植株与光敏感突变植株的pms3基因区段的DNA序列比较分析发现，光敏感突变植株的pms3基因中有一个特有的单碱基的替换突变，根据这个单碱基的突变，我们发展了可以用于辅助育种的分子标记(见实施例2)。本发明中，pms3基因表达量的上升可以使光敏感雄性不育植株的花粉恢复正常，将该基因构建到植物表达载体中时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导型启动子，使pms3基因在不育植株中过量表达或者诱导表达，可以人工改变水稻的花粉育性，用于水稻育种(见实施例4)。
序列表SEQ ID NO 1显示的是本发明分离克隆的包含有pms3基因的DNA片段序列(全长6440bp ;在第171 Ibp处碱基G突变为C)。序列表SEQ ID NO 2显示的是本发明分离克隆的pms3基因的核苷酸序列(全长1236bp,不含intron,不编码蛋白，该DNA序转录成RNA后就能发挥功能)。序列表SEQ ID NO 3显不的是本发明分尚克隆的pms3基因等位基因的核昔酸序列(全长1236bp,不含intron,不编码蛋白，该DNA序转录成RNA后就能发挥功能,相对于SEQ ID NO 2所示的序列的第790位的“C”，该序列在第790bp处存在一个等位基因突变， 即由C突变为G)。图I :互补载体pCAMBIA1301示意图。图2. pms3基因功能互补实验。图中A S6K互补转化成熟时期阴性植株(左)与阳性植株(右)株型比较；B :成熟时期阴性植株(左)与阳性植株(右)小穗育性比较；C 开花时期阴性植株(左)与阳性植株(右)的小花形态比较；D :开花时期阴性植株(左)与阳性植株(右)的花药形态观察；E :阴性植株花粉碘染，bar = 50 μ m ；F :阳性植株花粉碘染，bar = 50 μ m ；G :1\代阴性植株(_)与阳性植株(+)花粉育性与小穗育性统计(3个家系)，数值代表平均值+/_标准误。图3 :基于农垦58S突变序列发展的分子标记。图中A :本发明中CAPS标记形成的原理；B =CAPS标记农垦58，农垦58S及DH80中的基因型表现；C :利用该CAPS标记对6种常规水稻品种及42种野生稻品种的基因型鉴定，C中所涉及的水稻资源如下所述(具体来源见《遗传资源来源披露登记表》，该遗传资源不是作为本发明的遗传用途，仅仅是作为测试材料的对照)I-珍汕97 ；2-明恢63 ;3_日本晴；4_中花11 ;5_牡丹江8 ;6-农垦58S ;7-农垦 58 ;8-DH80 ;9-mPA64s ; 10-IRGC 1012 ;11_IRGC 1034 ;12_IRGC 14619 ;13_IRGC 17376 ；14-IRGC 26977 ;15-IRGC 27635 ; 16-IRGC 30346 ; 17-IRGC 53453 ; 18-IRGC 53454 ；19-IRGC 66515 ；20-IRGC 66528 ;21_IRGC 66560 ;22_IRGC 66627 ;23_IRGC 66809 ；24-IRGC 66813 ;25-IRGC 66831 ;26_IRGC 77144 ;27_IRGC 73118 ;28_IRGC 74730 ；28-IRGC 76290 ；30-IRGC 76404 ;31_IRGC 77143 ;32_IRGC 77144 ;33_IRGC 77529 ；34-IRGC 77636 ;35_IRGC 77645 ;36_IRGC 77665 ;37_IRGC 78269 ;38_IRGC 80180 ；39-IRGC 81586 ;40-IRGC 82097 ；41-IRGC 84154 ；42-IRGC 104921 ；43-IRGC 113509 ；44-IRGC 80622 ;45_IRGC 81831 ;46_IRGC 81845 ;47_IRGC 81883 ;48_IRGC 81915 ；49-IRGC 81928 ;50_IRGC 82037 ;51_IRGC 83795。
上述以IRGC编号开头的为国际水稻研究所统一编号的野生稻品种。图4 :超量表达载体pCAMBIA1301A构建示意图。图5 :pms3基因超量表达转基因植株的表型。图中A :pms3基因超量表达转基因植株!\代单株pms3基因的表达量检测(上)及GUS标记检测(下)；B =T1代阴性植株㈠与阳性植株(+)花粉育性与小穗育性统计(3个家系)，数值代表平均值+/-标准误。C:pms3基因超量表达转基因阳性植株与阴性植株成熟期整株表现；D pms3基因超量表达转基因阳性植株与阴性植株刚开花后花药形态比较，左边为阴性植株的花药，右边为阳性植株的花药；Bars = O. 5mm。E pms3基因超量表达转基因阳性植株与阴性植株小穗形态比较，左边为阴性植株的小穗，右边为阳性植株的小穗；F pms3基因超量表达转基因阳性植株与阴性植株花粉育性比较，上边为阴性植株的花粉，右边为阳性植株的花粉，Bars = 50μπιο图6 :pms3基因在水稻全生育期不同组织中的表达分析。编号1_15分别代表水稻不同发育时期的不同组织1，苗期根；2，苗期叶；3，分蘖期叶；4，二次枝梗分化期叶鞘；5，·雌雄蕊形成期茎；6，二次枝梗分化期叶片；7，雌雄蕊形成期叶片；8，花粉母细胞形成期叶片；9，花粉母细胞有丝分裂期剑叶；10，二次枝梗分化期幼穗；11，雌雄蕊形成期幼穗；12，花粉母细胞时期幼穗；13，花粉母细胞减数分裂期幼穗；14，有丝分裂期时期的穗；15，抽穗期的小穗。图7 :原位杂交确定pms3基因在水稻中的表达部位。图中A :该基因在农垦58叶鞘中有微量表达:该基因在农垦58叶片中有微量表达；C :该基因在农垦58花粉母细胞中表达；D :该基因在农垦58减数分裂的花药中表达；E :该基因在农垦58减数分裂后液泡化小孢子中表达；F :阴性对照。标尺长度为15 μ m。图8 :农垦58和农垦58S花药石蜡切片的比较。图中A、B、C、D、E和F分别表示农垦58花药在孢母细胞细胞时期、减数分裂二分体时期、减数分裂四分体时期、小孢子时期、液泡化花粉时期和成熟花粉期的花药横切片；G、H、I、J、K和L分别表示农垦58S花药在孢母细胞细胞时期、减数分裂二分体时期、减数分裂四分体时期、小孢子时期、液泡化花粉时期和成熟花粉期的花药横切片。英文字母分别表示花药的结构。E，表皮细胞；En，药室内壁；ML，中层；T，绒毡层；Ms,造孢细胞；Msp,小孢子Mp,成熟花粉Bars = 15 μ m。
具体实施例方式以下实施例进一步定义本发明，并描述了本发明在上述前期工作基础上分离克隆pms3基因以及验证pms3基因功能的方法。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。实施例I :分离克隆包含有pms3基因区段的DNA片段I.利用图位克隆技术鉴定水稻光敏感核不育基因pms3本发明中基因的定位群体所用到的亲本包括农垦58S和DH80，其中DH80由农垦SSS/BHFi代花药培养加倍而来(水稻材料农垦58S来源文献Li X.，Lu Q.，Wang F.，Xu C.，Zhang Q. 2001，Separation of thetwo-locus inheritance ofphotoperiod-sensitive genic male sterility in rice and precisely mapping thepms3 locus. Euphytica 119:343-348)。本发明的基因定位工作中总共构建了农垦58S/DHSOF2随机群体约7000株的定位群体，在武汉华中农业大学试验田分单株种植，通过两年田间育性观察，得到极端不育单株892株(水道材料来源农垦58S/DH80F2 Lu Q.，Li X.，Guo D. ,Xu C·,Zhang Q. 2005,Localization of pms3,a gene forphotoperiod-sensitivegenic male sterility, to a 28.4~kb DNA fragment. Mol Genet Genomics 273 507-511)。将这些极端不育单株的叶片按照常规报道的CTAB法全部抽提总DNA，酶切转膜，对pms3区段的分子标记进行重组交换分析。总DNA的抽提按Murray和Thompson (MurrayM. G. , Thompson ff. F. 1980, Rapidisolation of high molecular weight plant DNA. NuclAcids Res. 8 =4321-4325)的CTAB法进行。分子标记的RFLP分析，包括DNA酶切、电泳、转膜和杂交，按 Liu 等人的实验程序进行(Liu K et al. 1997, A genome-wideanalysis of widecompatibility in rice and the precise location of the S51ocus in the molecularmap. Theor ApplGenet. 95 :809_814)。pms3 基因被限定在分子标记 237295/HhaI (自己命名)和148125L/177182R/BsrBI (自己命名)之间，它们之间的物理距离是12kb。结果如表 I所示。2.遗传转化载体的构建我们采用互补转化与超量表达转化的方式来进一步确定基因的功能。本发明中，花粉育性受到一对等位基因的控制，武汉夏季长日照条件下，农垦58正常可育，农垦58S完全败育，而农垦58与农垦58S的杂种育性为50%，甚至更低。我们不能直接区分它们的显隐性关系，因此，我们采用双向互补转化的策略验证基因的功能。互补载体构建方法如下以pCAMBIA1301载体为骨架载体，用SacI与SalI双酶切农垦58的BAC，BAC的编号为117H5，得到6440bp大小的基因组片段，该片段位于上述定位区间12kb内，将该片段连接到PCAMBIA1301中，即N6K互补转化载体。在N6K载体基础上用KpnI单酶切后回收载体，同时以58S DNA为模本，用引物SNP-Fl与pms3_F4配对扩增，获得1852bp外源，将PCR产物TA clone测序验证，然后用KpnI单酶切获得1477bp长的片段，与回收的载体连接，得到的阳性克隆为S6K。N6K与S6K除了一个SNP差异外，其余全部相同，全长6440bp (该片段的DNA序列如序列表SEQ ID NO 1所示，在第171 Ibp处，N6K为C碱基，S6K为G碱基)。表I定位区间分子标记分析重组单株结果(部分数据)
权利要求
1.一种分离的编码长链RNA的光敏感核不育基因pms3在控制水稻花粉育性中的应用，其特征在于，该基因的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示。
2.如权利要求I所述的基因pms3的等位基因pms3在控制水稻花粉育性中的应用，其特征在于，所述的等位基因pms3的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :3所示，在该序列的第790bp处存在一个碱基突变。
3.—种检测水稻光敏感核不育基因的分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N01所示，在该序列的171 Ibp处存在一个碱基突变。
4.权利要求3所述的分子标记在水稻光敏感核不育系标记辅助选育中的应用。
全文摘要
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及水稻基因工程技术领域。本发明通过图位克隆的方法分离得到一个编码长链RNA的光敏感核不育基因pms3，该基因能调控水稻花粉的育性。pms3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO2所示。其等位基因的核苷酸序列如SEQ ID NO3所示，在该序列的790bp处存在一个由C到G的等位基因突变。本发明还得到一种选育水稻光敏感核不育基因的分子标记，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO1所示，在该序列的1711bp处存在一个碱基突变。本发明获得的控制水稻花粉育性的基因pms3，其等位基因以及选育水稻光敏感核不育系的分子标记可广泛应用到水稻的育种与遗传改良，尤其是在新的水稻不育系的产生，光敏感水稻不育系的选育中的应用。
文档编号A01H5/00GK102952795SQ20111024036
公开日2013年3月6日 申请日期2011年8月18日 优先权日2011年8月18日
发明者张启发, 丁寄花, 陆青 申请人:华中农业大学