专利名称：一种短小芽孢杆菌及其在杀灭线虫中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物农药技术领域，具体是一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus) 在杀灭线虫中的应用。
背景技术：
植物寄生线虫是一种世界范围内普遍发生的植物病害，仅根结线虫已知种类达70 多种，危害3000多种植物，每年造成损失巨大。化学杀线虫剂自上个世纪40年代发现以来， 在线虫防治中发挥了重要作用。随着科学技术的进步，发现许多化学杀线虫剂均有副作用， 造成环境污染，危害人体健康。相继有不少被禁用或即将禁用。特别是植物寄生线虫发生于作物根部，由于土壤环境的特殊性，必须大剂量施用才能保证其防效。而大剂量化学农药对地下水污染非常严重。因此，研究开发高效低毒低残留杀线虫剂已经是农业可持续发展中的重要课题。短小芽孢杆菌是一类非常重要的生防菌资源。目前国外主要将短小芽孢杆菌应用于防治蔬菜的根部病害，我国也有用短小芽孢杆菌防治番茄灰霉病、黄瓜菌核病菌等植物病害的报道(李桂霞等，2009 ；于婷等，2009)。目前，尚未有任何过于短小芽孢杆菌杀根结线虫的报道。
发明内容
本发明的目的是通过对一株具有强杀线虫活性的短小芽孢杆菌的研究，提供一种具有杀线虫功能的短小芽孢杆菌^Bacillus pumilus)在杀灭杀线虫中的应用。本发明通过研究测定短小芽孢杆菌的杀线虫活性，能制备出高效的杀线虫菌剂， 这对植物线虫病害的生物防治具有重要的理论指导意义和实践应用价值。本发明的实现方法是将短小芽孢杆菌扩大培养后，对其进行杀线虫药效试验，测定其对全齿复活线虫(Fanagrellus ret/iriras)、根结线虫{Meloidogyne incognitaH 结线虫虫卵的杀虫效果，确定其对线虫的杀伤作用。本发明筛选到的一株对植物寄生线虫具有很好杀虫功能的短小芽孢杆菌为 Bacillus pumilusο短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)菌株的形态特征为呈短杆状，菌体大小 0. 58X2. Ium,具内生芽孢，革兰氏染色呈阳性。该菌株在牛肉膏蛋白胨固体培养基上菌落突起，边缘光滑细腻，呈乳白色，直径1. Imm 1.8mm ；在DSMZ88改良固体培养基上，菌落较小，呈白色，菌落表面较干燥，边缘粗糙，不规则直径为，1.5-2. 0mm。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的制备 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的培养方法
1.试管种培养牛肉膏蛋白胨培养基蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂13g，蒸馏水1000ml，pH6. 8 7. 2，将短小芽孢杆菌接种到该培养基上，25°C 37°C下培养Mh，获得试管种；2.液体扩大培养液体培养基配方为每IOOOml蒸馏水，含牛肉膏3g，蛋白胨10g， pH7. 2 7. 4，将短小芽孢杆菌试管种接种到250ml三角瓶液体培养基中，每瓶装100ml，于 25°C 37°C下摇床培养24h，转速150 250rpm。短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)杀线虫活性试验
1.制备全齿复活线虫iPanagrellusredivivus)线虫将/rei/irims线虫接种于固体培养基上，经活化处理后保存于4°C冰箱备用；将所需线虫用贝曼漏斗法洗出，置于5ml 离心管内，加5ml无菌水洗涤，瞬时离心，弃上清，重复5次得到洁净供试线虫，用无菌水将线虫稀释为含量为15条/μ 的线虫悬浮液；
2.制备根结线虫卵iia)及其虫卵
取含根结线虫的烟根，剪碎放入广口瓶中，加入过氧乙酸溶液，振荡3-5 min后倒入双层筛上(上层筛60目，下层筛400目)，用无菌水反复冲洗后，得到根结线虫卵及其成虫； 短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)糸P. redivivus线虫的活性测定 将牛肉膏蛋白胨培养基融化后到平板，表面铺一层玻璃纸，等量接入该菌悬液，37°C培养Mh (空白对照不接菌，每种培养基有三个重复)；待菌苔长成后，接入AreiZiWt^s线虫约500条/皿；1 观察一次，连续观察36h，每次随机选取100条线虫计算死亡率。短小芽孢杆菌pumilus) ^Wi结线电(Meloidogyne incognita) 虫卵的活性测定
将该菌液加入6孔细胞板中每孔:3ml，分A、B两组各三个重复，A组每孔菌液中加入根结线虫卵100枚；B组每孔菌液中加入根结线虫100条，以无菌牛肉膏蛋白胨液体培养基分别加入线虫卵和成虫为对照各做3个重复，每24h观察一次根结线虫卵的变化；每1 观察一次根结线虫的变化，鉴定线虫死亡的方法为在处理中加入1 5滴5%NaCl溶液，2分钟后观察，死虫僵直，活虫则卷曲或扭动。根据实验结果表明本发明的短小芽孢杆菌(feciBM pumilus)对A redivivus 线虫具有较高的杀伤作用，36小时线虫死亡率达100%。对根结线虫也具有较好的杀伤作用，36小时线虫死亡率96%，虫体僵直。同时通过用该菌液处理根结线虫卵，发现它能破坏卵壳，对虫卵的正常孵化有一定的抑制作用。本发明的短小芽孢杆菌UaciBm ρ丽ilus、1siP. redivivus线虫、根结线虫和根结线虫卵具有较好的杀伤效果，可以作为线虫生防菌剂进行开发。
图1显示处理线虫降解情况。图2显示虫体保持完好的对照线虫。图3显示处理虫卵破裂情况。图4显示保持完好的对照虫卵。
具体实施例方式1、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的制备
短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)从野外获得，具体的培养方法如下
1)试管种培养牛肉膏蛋白胨培养基蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化钠5g，琼脂13g，蒸馏水1000ml，pH6. 8 7. 2，将短小芽孢杆菌接种到该培养基上，25°C 37°C下培养Mh，获得试管种；
2)液体扩大培养液体培养基配方为每IOOOml蒸馏水，含牛肉膏3g，蛋白胨10g， pH7. 2 7. 4，将短小芽孢杆菌试管种接种到250ml三角瓶液体培养基中，每瓶装100ml，于 25°C 37°C下摇床培养24h，转速150 250rpm。2、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)杀线虫活性试验
1)制备全齿复活线虫iPanagrellusredivivus)线虫将A rei/irims线虫接种于固体培养基上，经活化处理后保存于4°C冰箱备用；将所需线虫用贝曼漏斗法洗出，置于5ml 离心管内，加5ml无菌水洗涤，瞬时离心，弃上清，重复5次得到洁净供试线虫，用无菌水将线虫稀释为含量为15条/μ 的线虫悬浮液；
2)制备根结线虫(ifehii/o^j/^iflco卵ite)及其虫卵取含根结线虫的烟根，剪碎放入广口瓶中，加入过氧乙酸溶液，振荡3-5 min后倒入双层筛上(上层筛60目，下层筛400 目)，用无菌水反复冲洗后，得到根结线虫卵及其成虫。3、短小芽孢杆菌{Bacillus pumilus)糸P. redivivus线虫的活性测定
将牛肉膏蛋白胨培养基融化后到平板，表面铺一层玻璃纸，等量接入该菌悬液，37°C培养Mh (空白对照不接菌，每种培养基有三个重复)；待菌苔长成后，接入AreiZiWt^s线虫约500条/皿；1 观察一次，连续观察36h，每次随机选取100条线虫计算死亡率。4、短小芽孢杆菌pumilus)结线^SMeloidogyne incognita) R 其虫卵的活性测定
将该菌液加入6孔细胞板中每孔:3ml，分A、B两组各三个重复，A组每孔菌液中加入根结线虫卵100枚；B组每孔菌液中加入根结线虫100条，在无菌牛肉膏蛋白胨液体培养基 (牛肉膏3g，蛋白胨10g，蒸馏水1000ml，pH7. 2 7. 4)分别加入线虫卵和成虫为对照各做 3个重复，每24h观察一次根结线虫卵的变化；每1 观察一次根结线虫的变化，鉴定线虫死亡的方法为在处理中加入1 5滴5%NaCl溶液，2分钟后观察，死虫僵直，活虫则卷曲或扭动。5、试验结果
表1短小芽孢杆菌〈Bacillus pumilus)对P. redivivus线虫的杀伤效果
权利要求
1.一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)在杀灭线虫中的应用。
2.一种短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)的培养方法，其特征在于按以下进行1)试管种培养将短小芽孢杆菌接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，25°C 37°C下培养 Mh，获得试管种；2)液体扩大培养将短小芽孢杆菌试管种接种到液体培养基中，于25°C 37°C下摇床培养Mh，转速150 250rpm。
3.一种制备全齿复活线虫iPanagrellus redivivus)及其虫卵的方法，其特征在于按以下进行1)将Aredivivus线虫接种于固体燕麦培养基上，28°C下培养6天后，4°C保存备用；2)将所需线虫用贝曼漏斗法洗出，置于5ml离心管内，加5ml无菌水洗涤，瞬时离心， 弃上清，重复5次得到洁净供试线虫，用无菌水将线虫稀释到含量为15条/μ 的线虫悬浮液；3)制备根结线虫(ifehii/o^j/^iflco卵ite)及其虫卵取含根结线虫的烟根，剪碎放入广口瓶中，加入过氧乙酸溶液，振荡3-5 min后倒入双层筛上，上层筛60目，下层筛400 目，用无菌水反复冲洗后，得到根结线虫卵及其成虫。
4.一种权利要求1所述的短小芽孢杆菌iBacillus pumilus)杀线虫活性试验方法，其特征在于按以下进行1)短小芽孢杆菌杀线虫的活性测定将牛肉膏蛋白胨培养基融化后倒平板，表面铺一层玻璃纸，等量接入该菌株菌悬液，37°C培养Mh，对照不接菌，每种培养基有三个重复；待菌苔长成后，接入线虫500条/皿，每1 观察一次，连续观察36h，每次随机选取100条线虫计算死亡率；2)短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)杀根结线虫及其虫卵的活性测定将该菌液加入6孔细胞板中每孔:3ml，分A、B两组各三个重复，A组每孔菌液中加入根结线虫卵100枚； B组每孔菌液中加入根结线虫100条，在无菌牛肉膏蛋白胨液体培养基中分别加入线虫卵和成虫做对照，各做3个重复，每24h观察一次根结线虫卵的变化，每1 观察一次根结线虫的变化；鉴定线虫死亡的方法为在处理中加入1 5滴5%NaCl溶液，2分钟后观察，死虫僵直，活虫则卷曲或扭动。
全文摘要
本发明涉及一种短小芽孢杆菌及其在杀灭线虫中的应用。本发明中应用的具有杀线虫功能的短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)菌株的形态特征为呈短杆状,菌体大小0.58×2.1um,具内生芽孢,革兰氏染色呈阳性。在牛肉膏蛋白胨固体培养基上菌落突起，边缘光滑细腻，呈乳白色，直径1.1mm～1.8mm；在DSMZ88改良固体培养基上，菌落较小,呈白色,菌落表面较干燥,边缘粗糙，不规则,直径为1.5-2.0mm。本发明按常规方法制备。即将短小芽孢杆菌扩大培养后，测定其对全齿复活线虫(Panagrellusredivivus)、根结线虫(Meloidogyneincognita)及根结线虫虫卵的杀虫效果。本发明的用短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)对P.redivivus线虫、根结线虫和根结线虫卵具有较好的杀伤效果，可以作为线虫生防菌剂进行开发。
文档编号A01N63/00GK102283253SQ20111025506
公开日2011年12月21日 申请日期2011年8月31日 优先权日2011年8月31日
发明者常寿荣, 徐洁, 王绍坤, 罗华元, 陶南 申请人:云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所, 红云红河烟草(集团)有限责任公司