专利名称：小金海棠铁调控转运体基因在提高植物铁含量中的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)铁调控转运体基因 MxIRTl的一种新用途，尤其涉及小金海棠铁调控转运体基因在提高植物体中铁含量，提高植物吸收和利用铁的能力以及在促进植物生长或提高植物抗逆性中的用途，属于植物基因工程领域。
背景技术：
一直以来，土壤中可被植物吸收利用的可溶性铁的含量不足使得很多植物常表现出缺铁失绿症，给农业生产中的产量和作物品质造成极大的影响，直接导致经济损失。另据 2008年世界卫生组织(WHO)的世界健康报告，全世界铁缺乏人口超过20亿，其中半数是由于铁缺乏而贫血。因而，不断改善和提高主要粮食作物中的营养元素含量就变得尤为重要和紧迫。植物耐缺铁研究不仅对提高植物产量、改善作物品质有重要意义，而且还可通过对食物品质的改良从而改变人类铁缺乏的状况。如果能提高主要农作物中的铁含量，这不仅能显著增强作物的抗缺铁胁迫能力，提高作物的产量，还能大大提高农作物(尤其是种子)的品质，可望解决人类所普遍存在的铁缺乏状况。苹果树属于铁吸收机理I植物，负责铁离子吸收的跨膜转运体蛋白在应答缺铁胁迫过程中的作用十分关键。小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)是苹果属中的铁高效物种，其在缺铁环境下较其他品种具有更高的耐受能力。MxIRTl为小金海棠缺铁根cDNA文库中克隆出来和铁吸收相关的基因，与在其他物种中已发现的铁调控转运体(IRT)家族成员具有较高的相似性，具有相似的跨膜结构域和可变环序列(组氨酸富集区)。MxIRTl受植物铁环境调控，在缺铁条件下被诱导上调表达。在酵母异源互补试验中证实MxIRTl可以回复酵母铁、锌突变体吸收铁锌的能力，是具有铁锌转运活性的二价金属离子跨膜转运体。而其对铜、钴、镍等二价金属离子不具有转运活性。目前尚未见MxIRTl 基因导入到植物体的报道以及将MxIRTl导入到植物体后可提高植物体中的铁的含量的证明。
发明内容
本发明的主要目的是提供小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)铁调控转运体基因在提高植物体矿质营养元素含量中的一种新用途。本发明的主要目的是通过以下技术方案来实现的小金海棠铁调控转运体基因MxIRTl在提高植物铁含量中的用途；其中，所述的小金海棠铁调控转运体基因MxIRTl核苷酸序列为SEQ ID N0:1所示。本发明人发现将小金海棠铁调控转运体基因MxIRTl转化到受体植物中，使 MxIRTl基因在受体植物中表达，可显著的提高植物器官中铁元素的含量(尤其是种籽中的铁含量)；此外，MxIRTl基因在受体植物中表达，还可有效促进植物根系适应缺铁环境，提高植物吸收或利用土壤中矿质元素的能力，促进植物生长和发育并提高植物的抗逆性。具体的，所述的小金海棠铁调控转运体基因MxIRTl在提高植物铁含量中的用途， 包括构建含有小金海棠铁调控转运体基因MxIRTl的植物表达载体；将所述植物表达载体转化到受体植物中。其中，所述的含有MxIRTl基因的植物表达载体可参考以下方法构建得到将 MxIRTl基因序列插入到植物表达载体合适的限制性酶切位点之间，可操作的与表达调控序列相连接，即可得到单子叶植物或双子叶植物表达载体；该植物表达表达载体可以由5' 非编码区、MxIRTl基因序列以及3'非编码区所组成，其中，所述的5'非编码区可以包括启动子序列、增强子序列或/和翻译增强序列；所述的启动子序列可以是组成型、诱导型、 组织或器官特异性诱导子，优选为CaMV35S启动子；所述的3'非编码区可以包含终止子序列、mRNA切割序列等。其中，所述的终止子优选为nos终止子。作为本发明的一个具体的实施方案，本发明通过BamH I、Eco065 I双酶切和T4连接酶将MxIRTl基因插入具有Bgl II、Eco065 I酶切位点的表达载体pCAMBIA1302中(BamH I和Bgl II为同尾酶)，构建得到了植物表达双元载体pCAMBIA1302-MxIRTl，该载体保留了双元载体的主要元件，包括来源于广宿主载体的复制区域(pSVl rep)和复制稳定区域 (pSVl sta)以及T-DNA的左右边界序列。用CaMV 35S启动子控制带Hyr抗性基因的表达， 作为转基因植物的筛选标记基因；用CaMV 35S启动子和nos终止子控制MxIRTl基因的表达，增强了基因的表达效率。将上述植物表达载体转化到受体农作物或植物细胞中(转化的植物细胞再生成小植株)，培育筛选获得转基因植物(包括植物各部分组织)，所得到的转基因植物可以在缺铁胁迫的逆境条件下，增强植物对铁的吸收和转运，维持农作物的正常生长，同时增加农作物种子中的铁含量。所述的植物表达载体转化受体农作物的方法为本领域的常规转化方法，例如可以是根癌农杆菌侵染法、基因枪法、PEG介导法、种质系统介导法、电击穿孔法或微注射法；优选为农杆菌介导胚性愈伤组织转化法；所述的受体农作物可以是单子叶植物或双子叶植物，优选为水稻、油菜、玉米、大豆或小麦；由于水稻一方面是我国主要粮食农作物，另一方面其籽粒中铁等金属微量元素含量远低于其他食用农作物，不能满足人民的营养需求，所以将水稻作为受体农作物以提高水稻种子铁含量的意义更大。本发明以水稻为受体农作物将MxIRTl基因转化到水稻中，试验结果表明，其吸收和利用土壤中铁的能力显然要强于野生型植株，转基因水稻种籽的铁含量要显著高于野生型植株种籽。本发明的一个具体方案的整体描述本发明根据MxIRTl基因结构区域，应用生物软件设计该基因阅读框序列引物， 将小金海棠总RNA反转录，并以反转录产物cDNA为模板，用PCR方法扩增得到约1400bp 的cDNA特异片段，将cDNA切胶回收后插入测序载体，并进行序列分析，得到MxIRTl 基因。通过BamH I、Eco065 I双酶切和T4连接酶再将其构建成植物表达双元载体 pCAMBIA1302-MxIRTl，并通过农杆菌介导胚性愈伤法对水稻进行遗传转化，获得了具有Hyr 抗性的MxIRTl过表达转基因水稻，对各转化材料的T3代种子金属含量进行检测；试验结果表明，将MxIRTl基因导入水稻可以显著提高转化水稻材料的种子铁含量，最高的水稻品系种子铁含量可提高到30ug/g干重，而野生型水稻种子铁含量仅为ll-13ug/g干重，铁的增加幅度大于2倍，差异极显著。这对于农业提高水稻营养体光和效率、水稻产量、籽粒营养价值尤其是铁含量具有重要意义。此外，将MxIRTl基因导入水稻还可显著促进水稻根系的生长，促进水稻对土壤中的铁吸收和利用，显著提高水稻各器官(包括叶片等)中的铁含量，有效促进水稻的生长和发育，提高水稻的抗逆性。本发明首次发现并公开了小金海棠MxIRTl基因具有提高水稻种子铁含量的功能，并提供了含有该基因的植物表达载体的构建方法和提高水稻种子铁量的方法。本发明能够有效解决水稻种子铁含量过低这个制约粮食质量提高的技术难题。
图1为MxIRTl基因表达载体的菌落PCR图；M :D2000 ；LaneA、B、C 正义重组质粒 PCR结果；LaneD :pCAMBIA1302空载体PCR结果；LaneE 未加模板的阴性对照；图2为MxIRTl基因表达载体的酶切验证图；图3为植物表达载体pCAMBIA1302-MxIRTl的结构图；图4为转MxIRTl基因水稻植株的PCR扩增鉴定图；M为500bp Marker, 1为不加模板负对照，2为野生型基因组DNA为模板负对照，3-12为正义转基因株系11-21号的鉴定
结果；图5为转化材料幼根RNA反转录产物RT-PCR图；S9、S15分别为转基因株系编号， 18SRNA示上样量；图6为转基因和野生型水稻的叶色比较及叶绿素含量测定图；左图为叶色比较图；右图为叶绿素含量比较图，WT为野生型叶片，S为转正义基因的水稻叶片；图7为转基因和野生型水稻的种子铁含量比较图。
具体实施例方式下面结合附图和具体实施方式
对本发明作进一步说明，凡依照本发明公开内容所作的本领域任何同等替换，均属于本发明的保护范围。试验材料1.细菌菌株E. coli DH5a ；ToplO (购自天根公司)。2.农杆菌菌株EHA105 (本实验室保存)。3.水稻(Oryza sativa L. japonica cv. Nipponbare)，由中国农科院路铁刚研究员提供(说明本发明中所用到水稻种子可用其它市售的水稻种子代替)。4. pMD18-T购自TAKARA公司，pCAMBIA1302载体可按照以下文献构建得到Chen L, Zhang S, Beachy RN, Fauquet CM(1998)A protocol for consistent, large-scale production of fertile transgenic rice plants. Plant Cell Reportsl8 :25-31。5.质粒的提取试剂盒为OMEGA公司产品；T4连接酶为NEB产品；限制性内切酶购自TAKARA公司，其它主要化学试剂为国产AR级试剂。实施例1小金海棠铁调控转运体基因MxIRTl的克隆及载体构建一、设计MxIRT1相关引物1、用于同源扩增的简并引物对
Π (5，CAGCTTCTCCGTTACAGCTTCTCCGTTATCGTGT3，)r 1 (5，AACTTAACTTCAAGCCCATTTAGCC3，)2、用于3，RACE的引物对f2(5，GCTTCAAACAACACCTGCACAATTAAAGG3，)r2(5， ATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGCC3，)3、用于5，RACE的引物对 f 3 (5，CTCGGGAAGCGCGCCATTGTGTTGGT3，)r3(5， GTAAGATTTGATCTGGAGCTTAATGC3，)4、用于ORF扩增的引物对orf-f(5， CACGTCGACCATGGCTGCCACCAAGTCACATTTGAAGCTCATCCC3，)orf-r(5， GACCCCGGGTTAAGCCCACTTTGCCAATACAGACATGCCACCTGC3，)5、用于DNA水平转基因插入鉴定的引物对S-f (5，TTAGGTGACCGGATCCAATGGCTGCCACCAA3，)S-r (5 ’ AGTAGGTCACCAGCTAGCAGCCCACTTTGCCAA3 ’ )6、转基因水稻MxIRTl的RT-PCR检测的引物对RT-f(5' CTTCCCTCTTgTCACTCgTT3，)RT-r(5，TATCATTgTCCATTCAgTTgTTAT3，)二、小金海棠cDNA克隆小金海棠种子萌发至6-7片真叶后进行缺铁培养，取幼根用SMART cDNA Library Construction Kit (Clontech，USA)制备cDNA文库。用步骤一中的引物对1扩增保守区片段，通过RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)方法用引物步骤一中的引物对2和引物对3分别扩增保守区3’和5’侧翼序列，获得MxIRTl全长序列。用步骤一中的引物对4 扩增得到MxIRTl ORF序列，扩增时MxIRTl两端分别加入BamH I、Eco065 I酶切位点。三、扩增产物测序将步骤二中所扩增的MxIRTl ORF PCR产物与T载体pGEM T(Promega，USA)连接，转染大肠杆菌感受态，经筛选的转化子先经菌落PCR，菌落PCR电泳图见图1，M:D2000 ； LaneA, B、C 正义重组质粒PCR结果；LaneD :pCAMBIA1302空载体PCR结果；LaneE 未加模板的阴性对照。提取质粒进行酶切鉴定，酶切鉴定图如图2，所用酶为Nco I和Nhe I，酶切产物片段大小分别为9337bp，343!3bp，1133bp。对酶切鉴定结果正确的片段进行核苷酸测序鉴定，其具体序列为SEQ ID N0:1所示。四、构建植物表达载体用内切酶Eco065 I、BamH I对上述步骤所构建的T载体进行酶切获得目的片段。 PCAMBIA1302载体用Bgl II、Eco065 I进行双酶切。目的片段和载体进行连接，BamH I和 Bgl II同尾酶连接形成正义表达载体pCAMBIA 1302_MxIRTl。载体结构图如图3。实施例2 MxIRTl转基因水稻株系的获得一、农杆菌细胞的转化与鉴定取农杆菌感受态细胞200ul，加入IOug质粒DNA pCAMBIA1302_MxIRTl，混勻。冰浴30分钟，立即放入液氮中冰冻5分钟，立即放入37°C水浴5分钟，冰上冷却后，加入YEB 培养基lmlJ8°C，150rpm摇床培养2_3小时。在有抗生素(卡那霉素50ng/ml)的YEB固体培养基上涂布均勻，28°C下暗培养2-3天；对单菌落进行菌落PCR扩增鉴定。将菌落PCR 表现阳性的菌落转接到YEB液体培养基振荡培养，加入甘油，_80°C长期保存。二、水稻胚性愈伤组织的获得将去壳的水稻种子用70%乙醇摇洗5min，再用质量百分比浓度2. 5%次氯酸钠溶液灭菌25min，无菌水冲洗8次。无菌种子置于愈伤诱导培养基上避光培养，诱导愈伤组织。约30d后，将从成熟胚盾片处长出的愈伤组织剥下，进行继代培养，选取胚性愈伤组织作为转化受体。三、转化水稻将-80°C下保存的菌种用YEB固体培养基+硫酸链霉素(Mr) 25 μ g/mL+利福平 (Rif) 20mg/L+AS 20mg/L进行培养使其活化，在下培养5_6d。用无菌勺子轻轻刮下菌， 放入AAM液体培养基中，在80rmp，27°C下，4小时摇荡培养。培养基中加有ang/L 2，4_D， 0. 7g/L脯氨酸，20g/L的AS。将摇勻的菌液浓度调节至0D600值为0. 14-0. 19。选直径2-3mm的水稻胚性愈伤组织颗粒，于农杆菌菌液AAM-AS中侵染15-20min。 将愈伤组织在无菌滤纸上吸干，转移到铺有一层无菌滤纸的共培养基上，19-20°C暗培养 3-4d。将共培养的愈伤组织转出，无菌水漂洗3-4次，再用N6培养基+50mg/L头孢霉素在室温下IOOrpm摇洗l_2h，洗2遍，吸干放在滤纸上。用无菌滤纸吸干的愈伤组织，转移到选择培养基上，28°C暗培养，两周继代一次。经2-3次继代培养后，将新长出的抗性愈伤组织转移到预分化培养基上，28°C暗培养7d。将抗性愈伤组织转到芽分化培养基上，先在黑暗下培养72h，然后每天24h，460 μ mol/m2/s (50001ux)光照培养，10_15d后新鲜愈伤组织上开始有绿点出现，每15-20d继代一次，，长出完整小苗，转入壮苗培养基。先开盖炼苗一周， 然后从壮苗培养基上剥离幼苗，在清水中洗净培养基，移栽到温室土壤中一周，再移栽到大田中。四、转基因水稻的鉴定取阳性转基因水稻植株提取DNA。用步骤一中的引物对5(S_f和S-r)扩增转基因植株的基因组DNA，鉴定电泳图见图4。对插入水平阳性植株提取RNA，依Trizol (天根公司)试剂盒说明书及TaKaRa mRNA Selective PCR Kit ver 1. 1说明书操作步骤进行。用实施例1步骤一中的引物对6 (RT-f和RT-r)做转录水平PCR鉴定，可在477bp处发现条带如图5。鉴定共获得正义转基因阳性植株13株，反义转基因植株15株。实施例3MxIRTl基因在促进水稻铁吸收、提高水稻种子中铁含量的应用效果试验一、转基因水稻种子表型观察将去壳的水稻种子用70%乙醇摇洗5min，再用质量百分比浓度2. 5%次氯酸钠溶液灭菌25min，无菌水冲洗8次。无菌种子用蒸馏水浸种，在黑暗培养箱中萌发3天。 将萌发的种子转移到加有0. 3%的植物凝胶的hoagland固态培养基上，至于光照培养室培养2周，观察表型。正义转基因植株的叶色较绿，而野生型叶色偏黄，叶绿素含量测定差异显著(？<0.0幻如图6，左图为叶色比较图；右图为叶绿素含量比较图，WT为野生型叶片， S为转正义基因的水稻叶片。二、转基因水稻种子矿质元素绝对含量的测定
7
将T3代正义转基因植株水稻种子用手播下种皮，每种水稻45粒种子，做3个平行，分别称重，做好标记。用硝酸处理过的硝化罐，自来水洗3遍，蒸馏水润洗3遍，放入80°C 烘箱烘干。将每份种子分别放入硝化罐的套筒中，做好标记。注套筒需注意洁净，防止污染。向硝化罐套筒中加入8ml硝酸，2ml双氧水(体积比是4 1，根据种子重量适当变化)， 组装好硝化罐，放入硝化仪硝化。硝化好后，将硝化罐套筒中的消化液倒入事先刷干净并已烘干的25ml容量瓶中，蒸馏水定容至25ml。配好3种标液，进行ICP-MS检测，所测元素数据见表1。WT为野生型种子，S6、S13、S16为不同的阳性转化株系，如图7。表 权利要求
1.小金海棠(Malusxiaojinensis Cheng et Jiang)铁调控转运体基因MxIRTl在提高植物体或植物器官中铁含量中的用途；其中所述的小金海棠铁调控转运体基因MxIRTl 的核苷酸为SEQ ID NO 1所示。
2.按照权利要求1所述的用途，其特征在于所述的植物体是水稻。
3.按照权利要求1所述的用途，其特征在于所述的植物器官是种子。
4.小金海棠(Malusxiaojinensis Cheng et Jiang)铁调控转运体基因MxIRTl在提高植物吸收、利用土壤中铁的能力中的用途；其中所述的小金海棠铁调控转运体基因MxIRTl 的核苷酸为SEQ ID NO 1所示。
5.小金海棠(Malusxiaojinensis Cheng et Jiang)铁调控转运体基因MxIRTl在促进植物生长中的用途；其中所述的小金海棠铁调控转运体基因MxIRTl的核苷酸为SEQ ID NO 1所示。
6.小金海棠(Malusxiaojinensis Cheng et Jiang)铁调控转运体基因MxIRTl在提高植物抗逆性中的用途；其中所述的小金海棠铁调控转运体基因MxIRTl的核苷酸为SEQ ID NO 1 所示。
7.按照权利要求1-6任何一项所述的用途，其特征在于，包括构建含有小金海棠铁调控转运体基因MxIRTl的植物表达载体；将所述植物表达载体转化到受体植物中。
8.按照权利要求7所述的用途，其特征在于所述的植物表达载体是 pCAMBIA1302-MxIRTl，其中 MxIRTl 的核苷酸序列为 SEQ ID NO 1 所示。
9.按照权利要求7所述的用途，其特征在于所述的受体植物为水稻、油菜、玉米、大豆或小麦。
10.按照权利要求7所述的用途，其特征在于所述的转化方法为农杆菌介导的胚性愈伤组织转化法。
全文摘要
本发明公开了小金海棠(Malus xiaojinensis Cheng et Jiang)铁调控转运体基因在提高植物体中铁含量中的用途；其中所述的小金海棠铁调控转运体基因的核苷酸序列为SEQ ID NO1所示。此外，本发明还公开了小金海棠铁调控转运体基因在提高植物吸收或利用土壤中铁的能力以及在促进植物生长或提高植物抗逆性中的用途。本发明将MxIRT1基因转化到水稻中，试验结果表明，转基因水稻吸收和利用土壤中铁的能力也明显强于野生型植株；转基因水稻的种子中铁含量最高可提高到30ug/g干重，而野生型水稻种子中铁含量仅为11-13ug/g干重，其增加幅度大于2倍，差异极显著。
文档编号A01H4/00GK102304526SQ20111029968
公开日2012年1月4日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者印莉萍, 张放, 张文娟, 戚金亮, 李鹏, 杨光, 王俐勇, 苏红, 靳思, 韩建辉 申请人:首都师范大学