专利名称：一种玉米wip1基因启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种玉米wipl基因启动子及其应用。
背景技术：
植物启动子控制植物基因的表达。外源基因在转基因植物中的表达强度也取决于外源基因前面的启动子强度。启动子可分为组成型、诱导型和组织特异启动子。组成型启动子可以使基因在植物中的所有部位和不同发育阶段都表达。目前应用最为广泛的此类启动子包括来自烟草花叶病毒的355启动子、玉米泛素基因的WDiquitin启动子、水稻肌动蛋白基因的Actin启动子。组织特异启动子使目的基因仅在植物特定的器官或组织表达， 如玉米加13启动子使目的基因仅在花粉中表达(Hanson DD et al.，1989)。诱导型启动子在信号刺激下而具有转录活性。RD29A启动子能够驱动目的基因在干旱等胁迫条件下的表达，广泛应用于抗逆植物基因工程(Yamaguchi-Shinozaki，K. &Shinozaki, K.，1993).随着抗病虫基因越来越多的应用于农作物，使得作物产量得到了大幅度的提高。为了提高这些抗病虫基因在转基因作物中的表达，多是使用异源组成型启动子调控表达，比如CaMV35S， 因此直接从禾谷类作物克隆高效表达的启动子具有重要的应用价值。目前自然界共发现四大类蛋白酶抑制剂，包括丝氨酸蛋白酶抑制剂、巯基蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂和酸性蛋白酶抑制剂。其中丝氨酸蛋白酶抑制剂又可分为 Kunitz, Bowman-Birk, PI-I和PI-II四个家族。Bowman-Birk族的独特分子特征是其分子中有两个独立的结合位点。玉米的一个基因wipl (wound-induced protein)是从玉米胚芽鞘cDNA的差显库里筛选得到的一个基因，受伤诱导表达，同各种Bowman-Birk族蛋白有 30%的同源性(Rohrmeier T and Lehle L，1993)。该基因在创伤诱导15min时开始表达， 60min表达达到顶峰，不受3，5-D，ABA, BAP, IAA和methyl jasmonate胁迫诱导，在胚芽鞘中试验，发现受伤之后，信号从受伤处向上传递(Eckelkamp C et al.，1993)。目前在植物基因工程中所用的、能较强地启动基因转录的启动子主要局限于花椰菜花叶病毒35S启动子、水稻actin启动子和玉米ubiquitin启动子。进行多基因转化时使用相同的启动子容易产生基因沉默。需要发掘更多的具有强活性的启动子，以进行植物遗传操作。而发掘植物源性的启动子，特别是亲缘关系较近的启动子，在植物体内启动基因表达直至产生基因产物就显得尤为重要。
发明内容
为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种具有高效启动活性的玉米wipl 基因启动子Zmpwipl及其应用。本发明启动子的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示，序列全长1442bp。根据植物顺式调控元件数据库(PLACE)的搜索，本发明所提供的启动子区域含有多个TATA box.ff box 禾口 GCC boxο本发明技术人员应当理解根据SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，对其替换、缺失或增加一个或几个核苷酸，获得具有相同功能的核苷酸序列，例如，在非应答元件或作用元件，替换一个或几个碱基。本领域技术人员还可以根据SEQ ID No. 1的序列获得启动基因表达的DNA功能片段。因此，本发明所述的启动子还包括SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列经替换、缺失或增加一个或几个核苷酸，如将SEQ ID No. 1所示的序列的5’端缺失掉约200bp， 而衍生的具有控制基因表达的DNA功能片段。本领域技术人员可以理解的是，本发明的启动子还包括由SEQ ID No. 1产生的具有相同功能的DNA片段。所述的具有相同功能的DNA片段核苷酸序列与SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列的同源性至少大于90%、甚至95%、甚至98%的衍生的具有启动子基本元件，能启动基因表达的DNA片段。在本发明的一个实施方案中，将SEQ ID No. 1所示的序列分别进行5’端的IMbp、 211bp或511bp的缺失，而获得具有启动子功能的衍生出的启动子。本领域技术人员可以将本发明启动子用于构建表达载体。此外还可以将目的基因可操作地连接到本发明的启动子之下，构建得到表达盒，进一步可将该表达盒导入植物表达载体，获得重组表达载体。因此，本发明还包括由上述启动子构建的表达盒，以及含有上述表达载体或表达盒的表达载体或重组载体。本发明启动子可以用于制备转基因植物。比如，通过农杆菌介导、基因枪法以及花粉管通道等方式获得转基因植物。从而可以通过引入抗虫、抗病等基因，培育出抗虫、抗病植物，提高植物抗虫和/或抗病活性。本发明的启动子可用于制备本领域公知的转基因植物，用于控制外源或内源基因的表达，所述植物可为双子叶植物或单子叶植物，优选的植物为单子叶植物，更优选为玉米、水稻、小麦、高粱等单子叶植物，最优选为玉米。将本发明的各个启动子构建成GUS融合表达载体，并转化烟草和拟南芥。GUS组织化学染色和GUS酶活性的测定结果均表明，本发明提供的启动子能启动GUS基因的表达，具有启动子活性。
图1为玉米wipl启动子的PCR扩增。图2为含玉米wipl启动子表达载体构建图。图3为ZmWipl启动子缺失片段示意图。图4为生长4周的转基因拟南芥叶片⑶S染色分析结果。图5为生长4周的转基因拟南芥中的⑶S活性的定量分析结果。图6为生长4周的转基因烟草⑶S染色分析结果
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例1玉米wipl启动子克隆及序列分析将GenBank登录的Zmwipl基因的序列(登录号X71396)在maizesequence网站上进行比对分析，得到包含此基因序列的Bac序列AC206573。根据此Bac序列设计引物扩增 Zmwipl的启动子序列。设计引物为正向引物5' ATCTGCAGGGCTCCGTTCTACTTGACT 3' (SEQ ID No. 3) ,5'端引入PstI 酶切位点，反向引物5' TGGATCCGGTCTCGGACGAGCTGTTCTT3‘ (SEQ ID No. 4),5'端引入BamHl酶切位点。通过PCR扩增从玉米自交系综31的基因组DNA 上扩增Zmwipl基因的启动子序列，得到1737bp PCR产物(图1)，测序后的序列如SEQ ID No. 2所示。PCR反应体系
ddH20
10 xPCR缓冲液 dNTP(lOmM) 上游引物(10 μΜ)下游引物(10 μΜ)
权利要求
1.一种玉米Wipl基因启动子，其为DSEQ ID No. 1所示的核苷酸组成的DNA片段；或2) SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列经替换、缺失或增加一个或几个核苷酸，由1)衍生的具有启动基因表达的DNA功能片段。
2.根据权利要求1所述的启动子，其特征在于，所述的DNA功能片段为SEQID No. 1所示的核苷酸序列5，端缺失lMbp、211bp或511bp所衍生的DNA片段。
3.含有权利要求1或2所述启动子构建的表达盒。
4.含有权利要求1或2所述启动子的植物表达载体。
5.权利要求1或2所述的启动子在制备转基因植物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述植物为单子叶植物。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的植物为玉米、水稻、小麦、大豆、高梁。
全文摘要
本发明涉及一种玉米wip1基因启动子及其应用，该启动子为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列组成的DNA片段或SEQ ID No.1所示的核苷酸序列经替换、缺失或增加一个或几个核苷酸，由1)衍生的具有启动基因表达的DNA功能片段。转化烟草和拟南芥试验结果表明，本发明的启动子可以启动GUS基因的表达，具备启动子活性，可应用于玉米、水稻等作物的遗传改良和产业化研究。
文档编号A01H5/00GK102399779SQ201110329378
公开日2012年4月4日 申请日期2011年10月26日 优先权日2011年10月26日
发明者刘允军, 张生学, 王国英, 练云 申请人:中国农业科学院作物科学研究所