专利名称：一种水葫芦生长抑制剂及其制备方法
技术领域：
本发明涉及天然植物来源的除草剂，特别涉及一种防治水葫芦的生长抑制剂及其制备方法。
背景技术：
水葫芦(Eichhornia crassipes)又名凤眼莲，属雨久花科，水葫芦属，为多年生水生植物，原产南美洲。目前，水葫芦主要广泛分布在40° N(葡萄牙)到45° S(新西兰)之间，已经成为世界性的水生恶性杂草之一，在我国造成了很大的危害，利用本地物种生物控制水葫芦的研究十分缺乏。2003年1月国家环境保护局公布了 16种我国第一批外来入侵物种名单(国务院2003年第23号公报)，水葫芦名列其中。水葫芦于1901年引入中国，现已广泛分布于华北、华东、华中和华南的19个省、自治区及直辖市。虽然水葫芦可以作为饲料、吸附重金属和稀土元素，但是在适宜条件下，水葫芦以无性繁殖扩散，生长极快。目前， 水葫芦在许多地方疯狂繁殖，破坏水生生态系统，导致生物多样性丧失，造成严重的生物入侵，同时还堵塞河道、影响水运和水利发电。据统计，每年水葫芦灾害使我国蒙受80-100亿元的经济损失。治理水葫芦的主要方法有人工机械打捞、化学防治和生物防治等。水葫芦防治的传统方法是人工打捞，但是在其快速生长的季节要消耗大量的人力、物力和财力，我国在人工打捞水葫芦上每年要花费资金1亿元左右，据上海市河道管理办公室统计，上海地区 2002年用于水葫芦打捞的费用达1900万元。化学防治是治理水葫芦的主要方法之一，2， 4-D、敌草快和草甘膦对防治水葫芦都有明显的效果，但是化学除草剂容易对水体环境产生污染，影响其它水生生物的正常生长，破坏水生生态环境。世界各国对于如何治理和控制水葫芦观点不一，至今尚未研制出一种安全有效的水葫芦无公害防治剂。2000年，第二届国际“水葫芦生物控制和综合治理”会议中各国的学者专家认为生物控制水葫芦是可行的、安全的和可持续的防治措施。生物防治水葫芦主要利用昆虫、病原菌及植物代谢产物等。其中利用植物代谢产物抑制水葫芦的生长受到了国内外学者的广泛关注，已有的研究证明，马缨丹(Lantana camara)、银胶菊 (Parthenium hysterophorus)、里予薄荷(Coleus amboinicus)、宽丝子(Cuscutareflexa)禾口黑藻(Hydrilla verticillata)等植物的提取物或干粉悬浮液对水葫芦的生长有显著的抑制作用。目前，国内学者关于利用植物代谢产物防治水葫芦生长的研究较少，已见报道的有马缨丹等，但是马缨丹为热带入侵物种，在我国只分布在广东、海南、福建、台湾、广西和云南等省区，利用本地物种抑制水葫芦的研究未见报道。海州常山(Clerodendrum trichotomum)为本地物种，又名臭梧桐，属马鞭草科，大青属，为落叶灌木或小乔木，广泛分布在中国华北、华东、中南和西南各省区。该植物根、茎、叶和花均可入药，有降压、镇静、镇痛和杀菌的作用。本发明研究了本地物种海州常山的叶片提取液对水葫芦生长的抑制作用，将海州常山提取液均勻地喷施在水葫芦叶片上，极显著地抑制了水葫芦的生长，同时本发明通过测定叶绿素、过氧化氢酶活性和丙二醛的含量的变化来分析海州常山提取液对水葫芦生长的生理生化抑制机理，为生物抑制剂防治水葫芦提供新的途径。
发明内容
本发明目的是提供一种有效防治水葫芦的生物抑制剂及其制备方法，所述抑制剂显著抑制水葫芦的生长。本发明采用的技术方案是一种水葫芦生长抑制剂，所述抑制剂由海州常山叶片提取液、甘油和表面活性剂组成，所述海州常山叶片提取液与甘油和表面活性剂的体积比为85 95 1 4，所述表面活性剂为非离子表面活性剂，优选为吐温-20、十二烷基磺酸钠或聚乙二醇辛基苯基醚； 所述海州常山叶片提取液是海州常山叶片于浸提液中研磨12 36小时，离心，上清液为海州常山叶片提取液，所述浸提液为0 0. 05mol ·Γ\ρΗ 5. 6 5. 8的磷酸盐缓冲液或蒸馏水；所述海州常山叶片提取液的有效量以海州常山叶片质量计为0. 04g新鲜叶片/ml浸提液。所述水葫芦生长抑制剂的制备方法为1)取新鲜海州常山叶片于0 0. 05mol ·Ι^、ρΗ 5. 6 5. 8的磷酸盐缓冲液或蒸馏水中研磨，5000 IOOOOg离心15分钟， 上清液为海州常山叶片提取液a ；2)将海州常山叶片提取液a与甘油和表面活性剂混合均勻，获得水葫芦生长抑制剂a ；所述海州常山叶片提取液a与甘油和表面活性剂的体积比为 85 95 1 4，所述海州常山叶片提取液a的有效量以海州常山叶片质量计为0.04g新鲜叶片/ml浸提液；所述表面活性剂为吐温-20、十二烷基磺酸钠或聚乙二醇辛基苯基醚。所述水葫芦生长抑制剂有效量以海州常山叶片提取液中海州常山新鲜叶片投料的生药量计为3 ^ig新鲜叶片/ml抑制剂。此外，一种水葫芦生长抑制剂，所述抑制剂由海州常山叶片提取液、甘油和表面活性剂组成，所述海州常山叶片提取液与甘油和表面活性剂的体积比为85 95 1 4，所述表面活性剂为吐温-20、十二烷基磺酸钠或聚乙二醇辛基苯基醚；所述海州常山叶片提取液为取干燥海州常山叶片于的粉末于浸提液中浸泡M 36h，离心，上清液即为海州常山叶片提取液b，所述浸提液为0. 01 0. 05mol · L—1、pH 5. 6 5. 8的磷酸盐缓冲液或蒸馏水，所述海州常山叶片提取液的有效量以干燥海州常山叶片质量计为0. 04g粉末/ml浸提液。此外，所述水葫芦生长抑制剂的制备方法为1)将新鲜海州常山叶片于40 60°C 下烘干20 25h，粉碎，取粉末于0. 01 0. 05mol ·Ι^、ρΗ5. 6 5. 8的磷酸盐缓冲液或蒸馏水中浸泡24 36h，5000 IOOOOg离心15分钟，上清液为海州常山叶片提取液b ;2)将海州常山叶片提取液b与甘油和表面活性剂混合均勻，获得水葫芦生长抑制剂b ；所述海州常山叶片提取液b与甘油和表面活性剂的体积比为25 35 1 4，所述海州常山叶片提取液b的有效量以干燥海州常山叶片质量计为0. 04g粉末/ml浸提液，所述表面活性剂为非离子表面活性剂，优选为吐温-20、十二烷基磺酸钠或聚乙二醇辛基苯基醚，更优选为吐温—20 ο所述水葫芦生长抑制剂有效量以海州常山叶片提取液中干燥海州常山叶片投料的生药量计为3 ^ig粉末/ml抑制剂。
本发明所述的水葫芦生长抑制剂适合在水葫芦生长和扩散的初期使用，直接喷洒在水葫芦叶面上使用，致使水葫芦叶片干枯腐烂至衰亡，恢复一周后水葫芦枯叶率仍然有 90%，可以有效的控制水葫芦的繁殖。该抑制剂既很好地抑制水葫芦的生长又不会污染水体环境。由于水葫芦具有安全越冬的特点，气温最低时水葫芦的覆盖率仍然很高，当气温升高后，水葫芦开始腐烂下沉，覆盖率降低，然后气温转暖，水葫芦的越冬腋芽萌发成为新的植株。我们的抑制剂年初投放选择在新的植株生长和扩散的初期，即5、6月份。之后的月份若水葫芦有萌发趋势，可以选择再次投放抑制剂进行控制。本发明所述海州常山叶片提取液a和海州常山叶片提取液b均为海州常山叶片提取液，所述水葫芦抑制剂a和水葫芦抑制剂b均为水葫芦抑制剂，为便于区分不同方法和步骤获得的海州常山叶片提取液或水葫芦抑制剂而命名。本发明所述海州常山叶片提取液是本发明抑制剂的主要成份，它能抑制水葫芦的生长，损伤水葫芦的生物膜系统，导致水葫芦的叶片干枯腐烂。所述甘油为丙三醇，它的作用为保水、保湿，使溶液滞留在叶片上。所述非离子表面活性剂的作用是溶解非水溶性物质，常作为水包油型乳化剂，使其它物质均勻在溶液中分散，增加乳剂的稳定性。表面活性剂和甘油的添加有效地促进了水葫芦叶片对于海州常山叶片提取液的吸收，处理组不添加表面活性剂和甘油时，对水葫芦没有显著的抑制效果。推测这是因为水葫芦是水生植物，喷施的溶液无法长时间的滞留在叶片上，充分的发挥抑制作用。但是，甘油使处理组的溶液喷在叶片上均勻分布，形成膜状，可能会堵塞气孔，使气孔导度下降，导致胞间(X)2浓度下降，蒸腾作用也可能受到影响。本发明所述的水葫芦生长抑制剂对水葫芦进行抑制测试，包括对叶绿素含量，过氧化氢酶活性和丙二醛含量的影响，所述叶绿素含量采用Arnon法、过氧化氢酶活性采用分光光度计法、丙二醛含量采用双组分分光光度计法。本发明的抑制剂可以直接喷洒在水葫芦叶面上使用，结果表明，该抑制剂可以有效地抑制水葫芦叶片叶绿素的合成，活性氧积累，生物膜系统受到损伤，从而导致水葫芦叶片干枯腐烂至衰亡。与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在1)海州常山提取液作为水葫芦生长抑制剂相对于其它的抑制剂有着明显的优势； 海州常山提取液相对于化学除草剂更加安全，不会破坏水生生态系统，不易造成二次污染； 效果明显且见效快，10天枯叶率达到90%，18天枯叶率达到99%，死亡率也达到85% ；作用持久，恢复一周后枯叶率仍然有90% ；2)虽然用烘干研磨方法制备海州常山叶片提取液需要更多原材料，在烘干过程中也会损失一部分挥发性物质和破坏一些有效成分，但是其制备方法简单，便于规模化的制备，同时海州常山干粉也更方便于运输和贮存；3)海州常山提取液作为水葫芦生长抑制剂可以很好的控制水葫芦的生长，适合在 5、6月份水葫芦生长和扩散的初期使用，既很好地抑制水葫芦的生长又不会污染水体环境。4)海州常山为本地物种，非入侵物种，分布广泛，于我国的华北、华东、中南和西南各省区均有分布，海州常山的广泛适应性和良好的生长能力为生物控制凤眼莲提供了很好的条件，用其提取液进行水葫芦的生物控制可以在一定范围地进行人工种植。因此，海州常山提取液是一种更安全的、有效的、持久的和易制备的水葫芦生长抑制剂，该抑制剂可以有效地抑制水葫芦叶片叶绿素的合成，活性氧积累，生物膜系统受到损伤，从而导致水葫芦叶片干枯腐烂至衰亡。
图1水葫芦生长抑制剂对水葫芦生长状况的影响A1为组1施药前，Bl为组2施药前，Cl为组3施药前，Dl为组4施药前；A2为组1施药后，B2为组2施药后，C2为组3施药后，D2为组4施药后；图2水葫芦生长抑制剂对水葫芦叶片健康比例况的影响；图3水葫芦生长抑制剂对水葫芦叶片死亡比例况的影响。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此本发明所用水葫芦(Eichhornia crassipes)和海州常山 (Clerodendrumtrichotomum)均取自杭州西溪国家湿地公园，水葫芦的挑选标准为叶片 9 12片，株高约20cm，根长约25cm，鲜重150g左右。实施例1水葫芦生长抑制剂的制备方法取新鲜海州常山叶片4g，加0. 05mol · L-1、pH 5. 8的磷酸钠缓冲液IOOml研磨， 5000 IOOOOg离心15分钟，上清液即为海州常山叶片提取液，滤液可以直接使用，也可以在4°C条件下保存备用；将85ml海州常山叶片提取液(海州常山叶片生药投药量为3. 6mg 新鲜叶片/ml抑制剂)与細1的吐温-20和Iml的甘油混合均勻，即为水葫芦生长抑制剂 100ml。实施例2水葫芦生长抑制剂的制备方法将新鲜海州常山叶片于60°C下烘干Mh，粉碎，取4g粉末，加0.05mol ·Ι^、ρΗ 5.6 的磷酸钠缓冲液IOOmL,浸泡36h，5000 IOOOOg离心15分钟，上清液即为海州常山叶片提取液。将海州常山叶片提取液25ml(海州常山叶片生药投药量为3mg粉末/ml抑制剂)与 4ml的吐温-20和Iml的甘油混合均勻，即为水葫芦生长抑制剂30ml。实施例3水葫芦生长抑制剂的制备方法将新鲜海州常山叶片于40°C下烘干Mh，粉碎，取4g粉末，加蒸馏水IOOmL,浸泡 24h，5000 IOOOOg离心15分钟，上清液即为海州常山叶片提取液。将海州常山提取液 35ml (海州常山叶片生药投药量为^ig粉末/ml抑制剂)与細1的吐温-20和Iml的甘油混合均勻，即为水葫芦生长抑制剂40ml。实施例4水葫芦生长抑制剂对水葫芦的影响1)水葫芦生长抑制剂对水葫芦健康和死亡叶片比例的影响将水葫芦置于60CmX40CmX30Cm的白色塑料箱中，每箱10株，共20箱200株， 箱中预置自来水50L，试验共设四个组组1(处理1)为空白组，组2(处理幻为对照组，组 3(处理3)为实施例1制备的海州常山叶片提取液组，组4(处理4)为实施例2制备的海州常山叶片提取液组，每个组设4个重复，每个重复10株水葫芦；然后用容量为500mL的带刻度的喷壶将实施例1和实施例2制备的海州常山提取液分别均勻地喷洒在组3和组4的水葫芦的叶片上，空白组和对照组分别喷洒等量的缓冲液和甘油-吐温20的混合物，每株每次10mL，每天早晚各一次，持续18天，18天后停止喷施提取液，恢复一周。每箱10株水葫芦分置两侧，其中5株从2009年8月3日起每天记录一次叶片总数、健康叶片数和死亡叶片数，计算健康叶片比例、枯叶率和死亡叶片比例，取均值，结果见表1，图1 图3。健康叶片指叶面的95%以上没有出现干枯腐烂的叶片，健康叶片比例= 健康叶片数/叶片总数；枯叶率=1-健康叶片比例；死亡叶片指整个叶面全部出现干枯腐烂或者衰亡掉落的叶片，死亡叶片比例=死亡叶片数/总叶片数。另外5株水葫芦从2009 年8月5日起，根据下述方法每隔一天测定一次叶片的叶绿素含量、过氧化氢酶的活性和丙二醛含量，持续18天，18天后停止喷施提取液，取均值，结果见表2。表1喷施提取液对水葫芦健康叶片比例和死亡叶片比例的影响
权利要求
1.一种水葫芦生长抑制剂，其特征在于所述抑制剂由海州常山叶片提取液、甘油和表面活性剂组成，所述海州常山叶片提取液与甘油和表面活性剂的体积比为85 95 1 4，所述表面活性剂为吐温-20、十二烷基磺酸钠或聚乙二醇辛基苯基醚；所述海州常山叶片提取液是海州常山新鲜叶片于浸提液中研磨12 36小时，离心，上清液为海州常山叶片提取液，所述浸提液为0. 01 0. 05mol · L—1、pH 5. 6 5. 8的磷酸盐缓冲液或蒸馏水；所述海州常山叶片提取液的有效量以海州常山叶片质量计为0. 04g新鲜叶片/ml浸提液。
2.如权利要求1所述的水葫芦生长抑制剂，其特征在于所述水葫芦生长抑制剂的制备方法为1)取新鲜海州常山新鲜叶片于0. 01 0. 05mol · ΛρΗ 5. 6 5. 8的磷酸盐缓冲液或蒸馏水中研磨，5000 IOOOOg离心15分钟，上清液为海州常山叶片提取液；2)将海州常山叶片提取液与甘油和表面活性剂混合均勻，获得水葫芦生长抑制剂；所述海州常山叶片提取液与甘油和表面活性剂的体积比为85 95 1 4，所述海州常山叶片提取液的有效量以海州常山叶片质量计为0. 04g新鲜叶片/ml浸提液；所述表面活性剂为吐温-20、 十二烷基磺酸钠或聚乙二醇辛基苯基醚。
3.如权利要求1所述的水葫芦生长抑制剂，其特征在于所述水葫芦生长抑制剂有效量以海州常山叶片提取液中海州常山新鲜叶片投料的生药量计为3 ^ig新鲜叶片/ml抑制剂。
4.一种水葫芦生长抑制剂，其特征在于所述抑制剂由海州常山叶片提取液、甘油和表面活性剂组成，所述海州常山叶片提取液与甘油和表面活性剂的体积比为85 95 1 4，所述表面活性剂为吐温-20、十二烷基磺酸钠或聚乙二醇辛基苯基醚；所述海州常山叶片提取液为取干燥海州常山叶片的粉末于浸提液中浸泡M 36h，离心，上清液即为海州常山叶片提取液，所述浸提液为0. 01 0. 05mol · L-1、pH 5. 6 5. 8的磷酸盐缓冲液或蒸馏水，所述海州常山叶片提取液的有效量以干燥海州常山叶片质量计为0. 04g粉末/ml浸提液。
5.如权利要求4所述的水葫芦生长抑制剂，其特征在于所述水葫芦生长抑制剂的制备方法为1)将新鲜海州常山新鲜叶片于40 60°C下烘干20 25h，粉碎，取粉末于0 0. 05mol · ΛρΗ 5. 6 5. 8的磷酸盐缓冲液或蒸馏水中浸泡24 36h，5000 IOOOOg离心15分钟，上清液为海州常山叶片提取液；2)将海州常山叶片提取液b与甘油和表面活性剂混合均勻，获得水葫芦生长抑制剂b ；所述海州常山叶片提取液b与甘油和表面活性剂的体积比为25 35 1 4，所述海州常山叶片提取液的有效量以海州常山叶片质量计为 0. 04g粉末/ml浸提液，所述表面活性剂为吐温-20、十二烷基磺酸钠或聚乙二醇辛基苯基醚。
6.如权利要求4所述的水葫芦生长抑制剂，其特征在于所述水葫芦生长抑制剂有效量以海州常山叶片提取液中干燥海州常山叶片投料的生药量计为3 ^ig粉末/ml抑制剂。
全文摘要
本发明公开了一种水葫芦生长抑制剂及其制备方法，所述抑制剂由海州常山(Clerodendrum trichotomum)叶片提取液、甘油和表面活性剂组成，所述海州常山叶片提取液与甘油和表面活性剂的体积比为85～95∶1∶4，所述表面活性剂为吐温-20；本发明所述水葫芦生长抑制剂可以有效地抑制水葫芦叶片叶绿素的合成，活性氧积累，生物膜系统受到损伤，从而导致水葫芦叶片干枯腐烂至衰亡。
文档编号A01P13/02GK102511508SQ20111035759
公开日2012年6月27日 申请日期2011年11月11日 优先权日2011年11月11日
发明者傅智慧, 卢剑波, 李霞, 郑彬 申请人:杭州师范大学