专利名称：一株杀线虫的绿僵菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株杀线虫的绿僵菌及其应用。
背景技术：
蔬菜根结线虫病是世界性病害，其病原物为根结线虫(Meloidogyne spp.)，分类上属于异皮科根结线虫属。迄今已报道的根结线虫达80余种，主要种类有南方根结线虫、 瓜哇根结线虫、花生根结线虫和北方根结线虫。根结线虫通常没有明显的寄主专化性，能够侵染的植物超过3000种，分属114科，包括单子叶植物，双子叶植物，草本植物和木本植物，对大多数的粮食作物、油料作物、纤维作物、烟草、茶叶、果树、蔬菜、药材和花卉等均可造成严重损失。受其危害后，作物品质下降，大幅度减产，甚至绝产，同时线虫病的发生又加剧了枯萎病、黄萎病和立枯病等土传病害的危害，造成植物抵抗能力下降，极易受其它病原物侵染。病害发生时，一般每年造成10% -15%的经济损失，发病严重的时候损失可达30% -40%，甚至绝产。据不完全统计，全世界每年因根结线虫危害所造成的农业经济损失达1000亿美元以上。据预测，未来10年线虫的发生会有明显的上升，年平均增幅约 1 %-9%，长期连作使得土壤根结线虫累积为害尤为严重，因此在未来相当长的时间内根结线虫病依然是农作物的主要病害之一。目前，对于根结线虫的防治，主要以化学药剂防治为主，以及抗线虫品种和轮作等其它方法。这些方法虽然对线虫防治有一定作用，但都存在着一些弊端。在控制该类病害的方法中，由于根结线虫通常存活于土壤中和植物根内，所以一般化学农药难以控制其危害， 因此该类病害成为大量剧毒农药频繁使用的对象，对农产品生产的安全性构成严重威胁。 同时，由于化学杀线虫剂只能在短期内控制线虫数量，同时还存在成本高、持效短和抗药性等问题；抗性品种的选择作用会使线虫的群体发生变化，最后逐渐丧失抗性；而轮作防治根结线虫不适合现代农业生产的要求等。综上所述，由于目前缺乏实用、高效、可持续的治理技术，根结线虫病发生区域不断扩大，危害作物种类持续增加，致使农业生产面临严峻挑战，杀线虫生物农药具有非常广阔的应用价值和市场前景。安全、有效的防治根结线虫类病害是目前农业生产上亟待解决的紧迫问题，而现有的化学防治等措施并不能满足这一要求，现在生物制剂面临到如下问题1.定植问题。实际应用过程中，菌株在土壤中的定植能力差，防治效果达不到要求。2.稳定性问题。制剂活力丧失十分迅速，导致生防制剂货架期短，难以商业化生产。为了保证制剂具有较长时间的货架期，往往要求严格的保存条件，直接限制了真菌类生物农药的大规模应用。综上所述，高效生防菌株以及稳定剂型的开发是植物寄生线虫病害生物防治工作重要方向
发明内容
本发明的目的是提供一株绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae) HYN-1-2。本发明所提供的绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. M33，该绿僵菌具有高效防治根结线虫的功能。该绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 CGMCC No. 5433 具有以下特征在PDA和SMAY培养基上20-25°C下生长7天，菌落直径；35_，14天达50_。在查氏培养基上菌落扩张较慢。菌落质地绒毛状至棉絮状，初为白色，产孢后变为深绿色至墨绿色，背面棕黄色，菌落表面常因分生孢子粘聚而呈厚苔样。分生孢子梗不形成分生孢子座，直径2. 2-3. 1 μ m。分生孢子单细胞，长椭圆形，表面光滑，脱落后聚集成孢子团 5. 6-8. 4 μ m 2. 5-3. 2 μ m ；最佳生长温度为 25-30°C。本发明的另一个目的是提供一种绿僵菌制剂，所述制剂的活性成分为绿僵菌 (Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 CGMCC No. 5433，在所述制剂中的含量为 IO7-IO9Cfu/克。所述制剂为微球型制剂，所述微球型制剂的单粒微球重为0. 032-0. 034克，粒径为 4. 2-4. 8mm。本发明所提供的绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae) HYN-1-2CGMCC No. 5433或所述制剂可用于防治植物根结线虫。本发明还提供一种防治植物根结线虫的方法，包括如下步骤将绿僵菌 (Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 CGMCC No. 5433或所述制剂施于植物的根下，防治植物根结线虫，所述防治植物根结线虫为降低所述植物根结线虫的病情指数。所述绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 CGMCC No. 5433 或所述制剂按照如下用量施于所述植物的根下每亩AxiOll-SxiO12Cfu所述绿僵菌 (Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2，优选为每亩4X 10"_8X IO11Cfu所述绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2，最优选为每亩 4X IO11 所述 ^iSlii (Metarhizium anisopliae ν8Γ·8π 8ορ1: 8θ)] ΥΝ_1_20所述植物为黄瓜、青椒或西红柿。所述根结线虫为南方根结线虫(Meloidogyne incognita)和/或北方根结线虫 (Meloidogyne hapla)。本发明还提供一种所述制剂的制备方法，包括如下步骤1)将硅藻土、所述绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 和海藻酸钠水溶液按照20-24克硅藻土、AxiollCfu-Txio11Cfu权利要求1所述绿僵菌 (Metarhizium anisopliae)HYN-1-2和2. 6-4. 0克海藻酸钠的配比混合均勻，得到悬浮液；2)将步骤1)得到的悬浮液按2. 6-4. 0克海藻酸钠与1. 11-2. 22克氯化钙的配比加入氯化钙水溶液中，获得所述绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae) HYN-1-2的微球型制剂。田间试验证明，本发明所提供的绿僵菌制剂在室温20-25 V条件、30-40 %湿度条件下放置180天后，仍具有较好的防治线虫功效，防治效果可达50% -70%，说明该制剂较为稳定，且其活性成分即本发明的绿僵菌菌株在土壤中的定植效果好。另外，本发明的绿僵菌制剂还具有无毒无污染、性价比高、施用方便等优点。本发明的绿僵菌菌株及其制剂在植物根结线虫病害防治中可发挥重要作用，应用前景广阔。下面结合具体实施例详细描述本发明，所述实施例用于理解而不是限制本发明。保藏说明 菌种名称绿僵菌 Τ^ι :Metarhizium anisopliae var. anisopliae菌株编号HYN-1-2保藏机构中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏机构简称CGMCC地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号保藏日期2011年10月31日保藏中心登记入册编号CGMCC No. 543
图 1 为以绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 CGMCCNo. 5433为活性成分的微球型制剂形态图。
具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。以下实施例中所使用的材料来源和规格如下海藻酸钠粘度500，烟台新旺海藻有限公司；硅藻土 200-300目，堆密度0. 38g/cm3,渗透率3. 6达西，北京创清源过滤器材有限公司。实 M M I, M Wl M (Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 CGMCCNo. 5433的分离鉴定与保藏采集河北永年黄瓜根结线虫病根，用自来水冲洗病根3-5分钟除去土壤，然后将病根放在解剖镜下，用小镊子挑出卵囊，用次氯酸钠处理卵囊1分钟对卵囊表面消毒并使线虫卵释放，将次氯酸钠卵悬液分别过200 μ m和30 μ m的网筛，用灭菌蒸馏水冲洗3遍以除去次氯酸钠，大约每100个卵涂布在PDA平板上，每天观察菌落出现情况。最终自黄瓜根结线虫卵上分离得到一株杀线虫的真菌菌株，命名为HYN-1-2，并于2011年10月31日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. M33，经鉴定，该菌株为绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)。该绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)菌株 HYN-1-2CGMCC No. 5433 具有以下特征在 PDA 和 SMAY 培养基上20-25°C条件生长7天，菌落直径35mm，14天达50mm。在查氏培养基上菌落扩张较慢。菌落质地绒毛状至棉絮状，初为白色，产孢后变为深绿色至墨绿色，背面棕黄色，菌落表面常因分生孢子粘聚而呈厚苔样。分生孢子梗不形成分生孢子座，直径2.2-3. 1 μ m。分生孢子单细胞，长椭圆形，表面光滑，脱落后聚集成孢子团5. 6-8. 4 μ m 2. 5-3. 2 μ m ；最佳生长温度为25-30°C。以下内容所述绿僵菌如无特别说明均为绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-l-2 CGMCC No. 5433。实施例 2、绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 的培养1、试管种培养将绿僵菌HYN-1-2的菌丝或孢子接种到试管PDA培养基斜面上，在25_27°C下培养，培养72-96小时，获得试管种。2、菌种摇床扩大培养将斜面种子接种到三角瓶液体YES-2培养基中，25-260C、120_180rpm摇床振荡培养。3、液体发酵生产将逐级扩大的绿僵菌HYN-1-2菌液按照1 10的体积比接种于发酵罐(发酵培养基为YES-2培养基)中，25j6°C搅拌并通气(通气量1 1)，培养48小时，得到绿僵菌 HYN-1-2 浓度为 4X 109-7X 109cfu/mL 的发酵液。上述YES-2培养基的配方为葡萄糖30克，酵母6. 12克，K2HPO4 1克，MgSO4 0. 5克， KCl 0. 5 克，FeSO4 0. 01 克，ZnSO4 · 7H20 10 毫克，用水定容至 1L, pH 调至 6. 5。实施例3、绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 的微球型制剂的制备1、微球海藻酸钠凝胶液的配制(100升)将2. 6千克海藻酸钠缓缓加入到100升 80°C的自来水中，不断搅拌使其溶化，得到海藻酸钠水溶液，冷却至约30°C，备用；2、取实例2得到绿僵菌HYN-1-2的浓度为4X 109cfu/mL的发酵液100升勻浆打碎，加入M千克硅藻土充分混勻后，加入到步骤1配制的100升海藻酸钠水溶液中，充分搅拌混勻，得到悬浮液；3、配制CaCl2溶液用自来水配制摩尔浓度为0. 2M的氯化钙溶液100升，备用；4、将步骤2得到的悬浮液通过0. 2毫米孔径的筛孔，滴加到步骤3得到的100升 0. 2M的氯化钙溶液中，筛孔和氯化钙液面相距50厘米左右。海藻酸钠微球与氯化钙溶液反应后，生成海藻酸钙微球。5、将步骤4得到的海藻酸钙微球淬水搅拌10分钟，然后将海藻酸钙微球滤出，用清水冲洗2次，滤出微球40°C吹干，得到微球剂型的绿僵菌HYN-1-2制剂(图1)。经检测， 该制剂的单粒微球重0. 032-0. 034克，直径4. 5 士0. 3mm,每克微球含5 X IO8CFU/克绿僵菌 (M. anisopliae)HYN-1-2。实施例 4、绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 的微球型制剂的制备1、微球海藻酸钠凝胶液的配制(100升)将2. 6千克海藻酸钠缓缓加入到100升 80°C的自来水中，不断搅拌使其溶化，得到海藻酸钠水溶液，冷却至约30°C，备用；2、取实例2得到绿僵菌HYN-1-2的浓度为7X 109cfu/mL的发酵液100升勻浆打碎，加入20千克硅藻土充分混勻后，加入到步骤1配制的100升海藻酸钠水溶液中，充分搅拌混勻，得到悬浮液；3、配制CaCl2溶液用自来水配制摩尔浓度为0. 2M的氯化钙溶液100升，备用；
4、将步骤2得到的悬浮液通过0. 2毫米孔径的筛孔，滴加到步骤3得到的100升 0. 2M的氯化钙溶液中，筛孔和氯化钙液面相距50厘米左右。海藻酸钠微球与氯化钙溶液反应后，生成海藻酸钙微球。5、将步骤4得到的海藻酸钙微球淬水搅拌10分钟，然后将海藻酸钙微球滤出，用清水冲洗2次，滤出微球40°C吹干，得到微球剂型的绿僵菌HYN-1-2制剂(图1)。经检测， 该制剂的单粒微球重0. 032-0. 034克，直径4. 5 士 0. 3mm,每克微球含5. 5 X IO8CFU/克绿僵菌 HYN-1-2。实施例 5、绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 的微球型制剂的制备1、微球海藻酸钠凝胶液的配制(100升)将4. 0千克海藻酸钠缓缓加入到100升 80°C的自来水中，不断搅拌使其溶化，得到海藻酸钠水溶液，冷却至约30°C，备用；2、取实例2得到绿僵菌HYN-1-2的浓度为4X 109cfu/mL的发酵液100升勻浆打碎，加入20千克硅藻充分混勻后，加入到步骤1配制的100升海藻酸钠水溶液中，充分搅拌混勻，得到悬浮液；3、配制CaCl2溶液用自来水配制摩尔浓度为0. IM的氯化钙溶液100升，备用；4、将步骤2得到的悬浮液通过0. 2毫米孔径的筛孔，滴加到步骤3得到的100升 0. 2M的氯化钙溶液中，筛孔和氯化钙液面相距50厘米左右。海藻酸钠微球与氯化钙溶液反应后，生成海藻酸钙微球。5、将步骤4得到的海藻酸钙微球淬水搅拌10分钟，然后将海藻酸钙微球滤出，用清水冲洗2次，滤出微球40°C吹干，得到微球剂型的绿僵菌HYN-1-2制剂(图1。经检测， 该制剂的单粒微球重0. 032-0. 034克，直径4. 5士0. 3mm,每克微球含5 X IO8CFU/克绿僵菌 HYN-1-2。实施例 6、绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 的微球型制剂的制备1、微球海藻酸钠凝胶液的配制(100升)将4. 0千克海藻酸钠缓缓加入到100升 80°C的自来水中，不断搅拌使其溶化，得到海藻酸钠水溶液，冷却至约30°C，备用；2、取实例2得到绿僵菌HYN-1-2的浓度为4X 109cfu/mL的发酵液100升勻浆打碎，加入M千克硅藻土充分混勻后，加入到步骤1配制的100升海藻酸钠水溶液中，充分搅拌混勻，得到悬浮液；3、配制CaCl2溶液用自来水配制摩尔浓度为0. 2M的氯化钙溶液100升，备用；4、将步骤2得到的悬浮液通过0. 2毫米孔径的筛孔，滴加到步骤3得到的100升 0. 2M的氯化钙溶液中，筛孔和氯化钙液面相距50厘米左右。海藻酸钠微球与氯化钙溶液反应后，生成海藻酸钙微球。5、将步骤4得到的海藻酸钙微球淬水搅拌10分钟，然后将海藻酸钙微球滤出，用清水冲洗2次，滤出微球40°C吹干，得到微球剂型的绿僵菌HYN-1-2制剂(图1)。经检测， 该制剂的单粒微球重0. 032-0. 034克，直径4. 5 士0. 3mm,每克微球含3 X IO8CFU/克绿僵菌 HYN-1-2。将上述实例3得到的绿僵菌HYN-1-2微球制剂于室温20_25°C，湿度20-30%条件下放置6个月，每克微球中含绿僵菌HYN-1-2变为1 X IO8CFU,防治效果如实施例7_9。
实施例 7、绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 制剂对黄瓜根结线虫的生防效果检测选择根结线虫病发病严重的北京市门头沟碧琨种植中心蔬菜温室大棚，种植品种为迷你型小黄瓜(北京金土地农业技术研究所)。实验采用随机区组试验，共设三个区组 (重复)，每个区组设6个小区(处理)，每个小区的面积为20平方米。在黄瓜苗移栽时，将供试药剂采用穴施的方法，施于作物根下，实验期间按常规方法管理，黄瓜移栽的株距和行距分别是30cm和50cm。作物收获后，挖出黄瓜根，统计每个处理各重复中各级(0-10级)病株的数目，计算病情指数及防治效果，结果见表1，同时采集空白对照中黄瓜根上的根结线虫，用立式显微镜通过形态方法鉴定根结线虫的种类。各处理及药剂如下处理1 不施任何药剂(空白对照)；处理2 :1千克/亩穴施本发明的微球剂型绿僵菌HYN-1-2制剂；处理3 :4千克/亩穴施本发明的微球剂型绿僵菌HYN-1-2制剂；处理4 :8千克/亩穴施本发明的微球剂型绿僵菌HYN-1-2制剂；处理5 :1升/亩穴施1. 8%阿维菌素乳油(北京中农大生物技术有限公司奇克农药厂生产)(对照1)；处理6 :30-40克/亩98%大扫灭粉剂(有效成分为二硫代氨基甲酸钾和二甲基噻二嗪，上海金山实验化工厂)熏蒸(对照2)。根结线虫分级调查指标0级代表没有根结，1级代表1-10%的根上有根结，2级代表11-20%的根上有根结，3级代表21-30%的根上有根结，4级代表31-40%的根上有根结，5级代表41-50%的根上有根结，6级代表51-60%的根上有根结，7级代表61-70%的根上有根结，8级代表71-80%的根上有根结，9级代表81-90%的根上有根结，10级代表 91-100%的根上有根结；病情指数=100X Σ (各级病株数X各级代表值)/调查总株数X最高代表值；防治效果=100% X (空白对照的病情指数-处理后的病情指数)/空白对照的病情指数。结果空白对照中黄瓜根上的根结线虫主要是南方根结线虫(Meloidogyne incognita)禾口北方牛艮结线虫(Meloidogyne hap la)。表1本发明的绿僵菌制剂对黄瓜根结线虫的防治效果检测结果
处理病情指数防治效果(％)处理1(空白对照)90. 38 ±4. 2处理2 (绿僵菌制剂1千克/亩)55. 14±6. 038. 98处理3 (绿僵菌制剂4千克/亩)29. 31±6. 767. 57处理4 (绿僵菌制剂8千克/亩)27. 82±4. 169. 22
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权利要求
1.绿僵菌(Metarhiziumanisopliae var. anisopliae)HYN-1-2，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No. M33。
2.—种绿僵菌制剂，其特征在于所述制剂的活性成分为权利要求1所述的绿僵菌 (Metarhizium anisopliae var· anisopliae)HYN-1-2。
3.根据权利要求2所述的制剂，其特征在于权利要求1所述的绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 在所述制剂中的含量为 IO7-IO9Cfu/克。
4.根据权利要求2或3所述的制剂，其特征在于所述制剂为微球型制剂。
5.权利要求1 所述的绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2 或权利要求2-4中任一所述制剂在防治植物根结线虫病害中的应用。
6.一种防治植物根结线虫病害的方法，包括如下步骤将权利要求1所述的绿僵菌 (Metarhizium anisopliae var. anisopliae) HYN-1-2 或权利要求2-4 中任一所述制剂施于植物的根下防治植物根结线虫，所述防治植物根结线虫为降低所述植物根结线虫的病情指数。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于权利要求1所述的绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae)HYN-1-2或权利要求2-4中任一所述制剂按照如下用量施于所述植物的根下每亩Axioll-Sxio12Cfu权利要求1所述绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. Bnisopliae) ΥΝ_1_20
8.根据权利要求5-7中任一所述的应用或方法，其特征在于所述植物为黄瓜、青椒或西红柿。
9.根据权利要求5-8中任一所述的应用或方法，其特征在于所述根结线虫为南方根结线虫(Meloidogyne incognita)禾口 / 或北方牛艮结线虫(Meloidogyne hap la)。
10.权利要求2-4中任一所述制剂的制备方法，包括如下步骤1)将硅藻土、权利要求1 所述绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae) HYN-1-2和海藻酸钠水溶液按照20- 克硅藻土、4X 10"-7X IO11Cfu权利要求1所述绿僵菌(Metarhizium anisopliae)HYN-1-2和2. 6-4. O克海藻酸钠的配比混合均勻，得到悬浮液；2)将步骤1)得到的悬浮液按2.6-4. O克海藻酸钠与1. 11-2. 22克氯化钙的配比加入氯化钙水溶液中，获得权利要求1所述绿僵菌(Metarhizium anisopliae var. anisopliae) HYN-1-2的微球型制剂。
全文摘要
本发明公开了一株杀线虫的绿僵菌及其应用。该绿僵菌为绿僵菌(Metarhizium anisopliae var.anisopliae)HYN-1-2，2011年10月31日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏登记入册编号为CGMCC No.5433。本发明的绿僵菌及绿僵菌制剂用于防治植物根结线虫，防治效果可达50％-70％，较为稳定，其活性成分在土壤中的定植效果好，无毒无污染、性价比高、施用方便，具有广阔的应用前景。
文档编号A01P5/00GK102382775SQ20111036999
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月18日 优先权日2011年11月18日
发明者刘建斌, 刘杏忠, 向梅春, 李锋, 段维军 申请人:中国科学院微生物研究所